內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)心肌細(xì)胞線粒體損傷參與肺心病發(fā)病機(jī)制研究*

單 虎，張 蓉，張秋紅，楊 俠，高 錦，張 潔，李雅莉，張 明△

（1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，西安 710004；2.陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)一科，西安 710068）

慢性肺源性心臟病是多數(shù)呼吸系統(tǒng)慢性疾病常見(jiàn)的晚期并發(fā)癥，它以慢性缺氧、肺動(dòng)脈高壓、右心擴(kuò)大和右心衰竭為主要特征[1]。慢性肺源性心臟病尚缺乏有效的特異性治療措施，且患者就診時(shí)常因急性呼吸道感染而表現(xiàn)為呼吸衰竭合并右心衰竭，預(yù)后極差[2]。因此，探索慢性肺源性心臟病的發(fā)病機(jī)制，繼而尋找特異性治療措施已成為當(dāng)前重要的研究熱點(diǎn)。肺泡慢性缺氧等因素誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓一直被認(rèn)為是慢性肺源性心臟病的主要發(fā)病機(jī)制，然而直到近年來(lái)，慢性缺氧對(duì)心肌細(xì)胞的直接損傷作用才引起人們的重視[3-6]?，F(xiàn)已證實(shí)，慢性缺氧可直接造成心肌細(xì)胞線粒體功能異常、線粒體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）、心肌細(xì)胞肥大和凋亡，其中線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為心肌細(xì)胞重要的細(xì)胞器在其中發(fā)揮著重要的作用[7-9]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體遭受外界刺激導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡無(wú)法糾正時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體通過(guò)結(jié)構(gòu)耦聯(lián)和交互作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10-13]。然而，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在慢性缺氧環(huán)境下心肌細(xì)胞線粒體損傷中所發(fā)揮的作用尚未有研究證實(shí)。本研究擬利用慢性缺氧大鼠模型探索ERS在慢性缺氧誘發(fā)心肌細(xì)胞線粒體損傷中的作用及其機(jī)制，從而探索慢性肺源性心臟病發(fā)病機(jī)制及可能的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與儀器試劑 30只8周齡雄性Wistar大鼠（200～250 g）購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；氣體濃度控制器購(gòu)自上海塔望智能科技有限公司；H7650透射電子顯微鏡（日本日立）；721型分光光度儀（上海第三分析儀器廠）；熒光酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；半干轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Hoefer公司）；手術(shù)器械（西安交通大學(xué)試劑中心）；高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司）；組織蛋白裂解液（武漢博士德生物工程有限公司）；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）活性測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；細(xì)胞色素C 氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）活性測(cè)定試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司）；4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid，4-PBA，ERS 抑制劑，美國(guó)Sigma 公司）；抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）兔多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（bs-1219R）；抗CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司（SAB5700602）；常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 動(dòng)物飼養(yǎng)和處置均符合我國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的要求，30 只雄性Wistar 大鼠平均分配到6 籠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，7 d 后，按隨機(jī)數(shù)字表法將其分為3組：（1）對(duì)照組大鼠10只，暴露在空氣中喂養(yǎng)；（2）低氧組大鼠10 只，每天固定8 h 在（10±0.5）%的氧濃度下喂養(yǎng)，籠內(nèi)氧濃度由氣體濃度控制器（上海塔望智能科技有限公司）控制，其余16 h在空氣中喂養(yǎng)；（3）干預(yù)組大鼠10只，喂養(yǎng)方式同低氧組，每天給予0.5 mg/kg 4-PBA混懸液灌胃。對(duì)照組和低氧組大鼠每天給予等體積生理鹽水灌胃。3組大鼠均喂養(yǎng)21 d，并稱(chēng)重記錄。

1.3 組織取材 用10%醫(yī)用水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，然后將其固定于試驗(yàn)臺(tái)上。沿肋弓剪開(kāi)皮膚及深層腹壁，而后縱行剪開(kāi)左側(cè)肋骨，暴露心臟，在主動(dòng)脈根部水平剪斷分離心臟，并迅速用4 ℃PBS溶液沖洗心腔內(nèi)血液至澄清。在冰面上進(jìn)行心臟各部分分離操作，首先修剪去除心包組織和脂肪組織，然后分別分離心房、右心室（RV）、左心室和室間隔（LV+S），用濾紙吸干后分別稱(chēng)重。用手術(shù)刀切取部分右心室組織置于2.5%戊二醛溶液固定，用于制作電鏡標(biāo)本，部分右心室組織用于提取線粒體并檢測(cè)線粒體膜電位、呼吸鏈酶復(fù)合物活性，剩余組織均置于液氮罐中速凍，后轉(zhuǎn)移到-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 組織病理學(xué)檢查 將右心室組織標(biāo)本放置在2.5%戊二醛溶液于4 ℃冰箱過(guò)夜，按照電鏡超薄切片制作方法進(jìn)行脫水、包埋、切片，在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞及線粒體結(jié)構(gòu)。

1.5 線粒體提取 稱(chēng)取0.5 g左右新鮮右心室組織用于提取線粒體并檢測(cè)線粒體膜電位和呼吸鏈復(fù)合物活性。根據(jù)線粒體提取試劑盒說(shuō)明書(shū)在冰上完成操作，首先用眼科剪將組織剪碎，用PBS 溶液沖洗后轉(zhuǎn)移到5 mL EP 管，加入2.5 mL 酶解液后冰上孵育10 min，低溫離心機(jī)1 000 g離心2 min，棄上清后分別加入1.5 mL 清理液和1 mL 凈化液，震蕩混勻后再次離心棄上清，加入2.5 mL裂解工作液并轉(zhuǎn)移到玻璃勻漿器中進(jìn)行勻漿操作30～40 次，再次于低溫離心機(jī)以1 200 g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液到新的EP管，最后使用低溫超高速離心機(jī)10 000 g離心10 min，棄上清后所得沉淀物即為新鮮的心肌組織線粒體混懸液，加入0.2 mL預(yù)冷的保存液輕柔吹打重新懸浮線粒體，隨即開(kāi)始檢測(cè)線粒體膜電位和呼吸鏈酶復(fù)合物活性。

1.6 線粒體功能檢測(cè) 在避光環(huán)境下使用JC-1 熒光探針用于檢測(cè)線粒體膜電位，向新鮮提取的線粒體混懸液中加入0.1 mL JC-1染色工作液，搖勻后置入37 ℃水浴箱孵育20 min，隨后離心棄上清，使用0.2 mL染色緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每次10 min，最后加入0.2 mL染色緩沖液并懸浮線粒體，使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度（設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)525 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590 nm）。根據(jù)SDH活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，首先制備反應(yīng)底物并在37 ℃水浴箱內(nèi)避光孵育5 min，取0.1 mL 新鮮提取線粒體加入反應(yīng)底物中，分別在5 s和65 s時(shí)讀取600 nm處吸光度值，其差值代表琥珀酸脫氫酶活性。根據(jù)COX 活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，設(shè)置分光光度儀25 ℃，將0.93 mL緩沖液加入比色皿，加入20 μL 新鮮提取的線粒體混懸液，37 ℃孵育3 min 后放入分光光度儀，加入50 μL 反應(yīng)工作液并混勻，隨機(jī)計(jì)時(shí)，在反應(yīng)第0 秒和60 秒分別讀取550 nm 處吸光值，其差值代表COX活性。

1.7 Western blotting 檢測(cè) 稱(chēng)取100 g 右心室心肌組織在冰上剪碎，轉(zhuǎn)移到研缽進(jìn)行研磨，再轉(zhuǎn)移到EP 管中，加入含1%苯甲基磺酰氟的裂解液1 mL，于冰上裂解30 min。裂解結(jié)束后于低溫離心機(jī)6 500 g 離心20 min，取上清液用Bradford 法進(jìn)行蛋白定量，加入相應(yīng)量的上樣緩沖液，在PCR 儀上95 ℃加熱5 min 使蛋白質(zhì)變性。取等質(zhì)量蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，用含10%脫脂奶粉的PBST室溫下封閉2 h，隨后分別用1∶1 000稀釋后的GRP78抗體和1∶2 000稀釋后的CHOP抗體4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，用1∶20 000稀釋的HRP標(biāo)記二抗37 ℃搖床孵育2 h。使用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，將經(jīng)過(guò)顯影和定影后的X 光膠片晾干保存，統(tǒng)一用凝膠電泳成像分析系統(tǒng)照相，用Image Plus Pro圖像處理軟件進(jìn)行灰度分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心臟右心室質(zhì)量占比變化 缺氧組大鼠在常壓間歇缺氧環(huán)境下飼養(yǎng)21 d過(guò)程中，逐漸出現(xiàn)活動(dòng)減少，進(jìn)食量減少及生長(zhǎng)緩慢等表現(xiàn)，至飼養(yǎng)第21 天時(shí)，缺氧組大鼠心臟體質(zhì)比（心臟質(zhì)量/體重）、右心室體質(zhì)比（右心室質(zhì)量/體重）和右心室占比[右心室質(zhì)量/左心室+室間隔質(zhì)量之和，RV/（LV+S）]均高于對(duì)照組（均P＜0.001），見(jiàn)圖1。提示缺氧組大鼠出現(xiàn)以右心室肥大為主的心臟肥大表現(xiàn)，證實(shí)慢性缺氧誘發(fā)的慢性肺源性心臟病模型成功建立。

與缺氧組大鼠相比，干預(yù)組大鼠活動(dòng)量、進(jìn)食量有所增加，生長(zhǎng)緩慢現(xiàn)象有所緩解，至飼養(yǎng)第21 天時(shí)，干預(yù)組大鼠心臟體質(zhì)比、右心室體質(zhì)比和RV/（LV+S）均低于缺氧組，其中以右心室質(zhì)量及右心室體質(zhì)比降低最為顯著（均P＜0.05），見(jiàn)圖1。提示4-PBA 干預(yù)可以有效防治慢性缺氧刺激誘發(fā)的慢性肺源性心臟病。

圖1 慢性缺氧時(shí)大鼠心臟形態(tài)變化及4-PBA的干預(yù)作用

2.2 大鼠右心室心肌組織線粒體結(jié)構(gòu)變化 慢性缺氧刺激下，缺氧組大鼠心肌線粒體出現(xiàn)腫脹變形，線粒體嵴排列紊亂，部分線粒體膜破壞，線粒體結(jié)構(gòu)完整性喪失。干預(yù)組大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)異常相對(duì)較輕，線粒體結(jié)構(gòu)完整性良好，未見(jiàn)線粒體膜破壞，見(jiàn)圖2。

圖2 慢性缺氧時(shí)大鼠心肌線粒體形態(tài)變化及4-PBA 的干預(yù)作用（×5 000）

2.3 大鼠右心室心肌線粒體膜電位及呼吸鏈酶復(fù)合物活性變化 與對(duì)照組相比，缺氧組大鼠心肌線粒體膜電位水平降低，線粒體呼吸鏈中COX 和SDH 酶相對(duì)活性均降低（均P＜0.001），見(jiàn)圖3。與缺氧組相比，干預(yù)組大鼠心肌線粒體膜電位水平及COX、SDH 酶相對(duì)活性均有所升高（均P＜0.001），見(jiàn)圖3。

圖3 慢性缺氧時(shí)心肌線粒體功能變化及4-PBA的干預(yù)作用

2.4 大鼠右心室心肌ERS 相關(guān)蛋白表達(dá)變化 與對(duì)照組比較，缺氧組大鼠心肌組織ERS 相關(guān)蛋白CHOP、GRP78 表達(dá)水平上調(diào)（均P＜0.001），而4-PBA干預(yù)后，干預(yù)組CHOP、GRP78表達(dá)水平低于缺氧組（均P＜0.001），見(jiàn)圖4。提示慢性缺氧刺激可誘發(fā)心肌組織ERS，同步給予4-PBA 可有效降低ERS水平。

圖4 慢性缺氧時(shí)ERS相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化及4-PBA的干預(yù)作用

3 討論

心臟是一個(gè)對(duì)氧氣高度依賴(lài)的器官，任何引起機(jī)體系統(tǒng)性缺氧的疾病都可能導(dǎo)致心肌組織慢性缺氧，繼而引發(fā)心肌收縮功能降低，甚至心力衰竭。因此，探尋慢性缺氧情況下心肌細(xì)胞功能變化的機(jī)制將為臨床上救治慢性肺源性心臟病等缺氧性心臟病提供新的突破點(diǎn)。

線粒體是維持心肌細(xì)胞能量供應(yīng)的重要細(xì)胞器，在慢性缺氧情況下，線粒體首先做出代償性反應(yīng)。慢性缺氧刺激通過(guò)活化氧敏感性轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)線粒體相關(guān)生物合成，通過(guò)增加線粒體數(shù)量和增強(qiáng)線粒體呼吸功能的方式，保證線粒體的能量產(chǎn)出，維持心肌組織功能。同時(shí)，慢性缺氧刺激心肌細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），上調(diào)蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）活性，繼而誘導(dǎo)心肌線粒體耐受鈣超載，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，促進(jìn)線粒體自噬，防止心肌細(xì)胞凋亡。然而，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，ROS 積累將誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷，通過(guò)介導(dǎo)線粒體損傷，促進(jìn)鈣離子和細(xì)胞色素C的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是心肌細(xì)胞中除線粒體外的另一個(gè)重要細(xì)胞器，主要參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、鈣穩(wěn)態(tài)和凋亡的調(diào)節(jié)。由于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞凋亡方面有諸多功能重疊，線粒體－內(nèi)質(zhì)網(wǎng)交互作用也逐漸被揭示且已經(jīng)被證實(shí)參與包括炎癥性疾病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生過(guò)程。包括缺血缺氧、氧化應(yīng)激等在內(nèi)的應(yīng)激刺激可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白質(zhì)過(guò)程紊亂，同時(shí)出現(xiàn)鈣平穩(wěn)紊亂和未折疊蛋白反應(yīng)，即ERS。ERS發(fā)生后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的轉(zhuǎn)錄激活因子6（activating transcription factor，ATF-6）、IRE1（inositol-requiring enzyme 1）和PERK（protein kinase R-like ER kinase）分別活化，介導(dǎo)線粒體損傷及細(xì)胞凋亡[15]。此外，線粒體－內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)耦聯(lián)（mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane，MAM）也為兩者之間鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等交互影響提供物理作用平臺(tái)[16]。盡管如此，ERS在慢性缺氧刺激導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常中所發(fā)揮的作用仍未有研究證實(shí)，以阻斷ERS為靶點(diǎn)，是否可作為慢性肺源性心臟病的潛在治療方法也需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)揭示。

本研究通過(guò)常壓間歇缺氧法構(gòu)建慢性肺源性心臟病大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在肺心病大鼠出現(xiàn)右心室肥大的同時(shí)，右心室心肌細(xì)胞線粒體膜電位降低，呼吸鏈酶復(fù)合物中的關(guān)鍵酶COX、SDH 活性均降低，繼而出現(xiàn)線粒體嵴結(jié)構(gòu)排列紊亂、線粒體膜完整性破壞、線粒體腫脹等結(jié)構(gòu)異常。在肺心病大鼠出現(xiàn)心肌組織線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常的同時(shí)，ERS 標(biāo)志性蛋白CHOP 及GRP78 表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.001），提示ERS 與線粒體受損同時(shí)出現(xiàn)。為了進(jìn)一步明確ERS與線粒體損傷之間的相互關(guān)系，本研究結(jié)果結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4-PBA 在抑制ERS 的同時(shí)，可以有效地發(fā)揮線粒體保護(hù)作用，4-PBA 干預(yù)大鼠在慢性缺氧環(huán)境中線粒體膜電位下降得到改善，線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性有所升高，電鏡下還可以觀察到線粒體結(jié)構(gòu)破壞程度有所緩解，并最終減輕了慢性缺氧導(dǎo)致的右心室肥大。

由此可見(jiàn)，ERS 可能作為線粒體損傷的上游機(jī)制參與慢性缺氧誘發(fā)慢性肺源性心臟病的發(fā)病過(guò)程，而且以ERS為作用靶點(diǎn)可以有效減輕慢性缺氧誘發(fā)的線粒體損傷和右心室肥大。在阿爾茨海默病、帕金森病等多種疾病模型研究中，線粒體一直被認(rèn)為在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)交互作用中發(fā)揮主體作用，即多種應(yīng)激刺激引起線粒體產(chǎn)生ROS 增多，通過(guò)氧化應(yīng)激誘使線粒體結(jié)構(gòu)及功能異常，從而激活ERS，最終通過(guò)未折疊蛋白反應(yīng)和鈣穩(wěn)態(tài)失衡影響細(xì)胞功能狀態(tài)[17-18]。然而，ERS發(fā)生后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中儲(chǔ)存的大量鈣離子釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，可引發(fā)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，引發(fā)線粒體腫脹，細(xì)胞色素C釋放入細(xì)胞質(zhì)，激活線粒體途徑細(xì)胞凋亡[19-20]。此外，ERS下游信號(hào)通路中的caspase-12活化后可以通過(guò)MAM 上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白GRP78 與線粒體蛋白VDAC1調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[21-22]。

綜上所述，本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)揭示了慢性缺氧可誘發(fā)心肌細(xì)胞ERS，繼而引起線粒體功能損傷和結(jié)構(gòu)異常，參與慢性肺源性心臟病的發(fā)病過(guò)程。明確ERS 介導(dǎo)的線粒體損傷在慢性肺源性心臟病中的作用有助于闡明慢性肺源性心臟病的發(fā)病機(jī)制，并證實(shí)靶向ERS的藥物可以應(yīng)用于以心肌細(xì)胞保護(hù)為策略的慢性肺源性心臟病治療中。