補(bǔ)喂胍基乙酸對運(yùn)動訓(xùn)練伊犁馬血漿胍基乙酸、肌酸濃度的影響

劉 律，李曉斌，馬 艷，楊 昊，張文杰，魯 豪，衛(wèi)鑫嵐，高俊杰，歐陽文，楊開倫

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗室，烏魯木齊 830052；2.新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇縣種馬場，新疆伊犁 835699）

0 引言

【研究意義】肌酸（Creatine，Cr）在動物機(jī)體的生命代謝以及能量供應(yīng)上有極其重要的作用，既可作為營養(yǎng)物質(zhì)，參與肌肉細(xì)胞的合成代謝，又可作為能源物質(zhì)，為肌肉收縮儲備能量[1]。肌酸通常來源于高蛋白的動物性飼糧（魚粉或肉粉），而草食動物的飼糧中不含肌酸[2]，對肌酸的外源攝取較少。直接在飼糧中添加肌酸[3]或灌喂肌酸水合物[4]，對機(jī)體血漿中肌酸、肌酐的濃度無顯著影響。、動物機(jī)體肌酸的內(nèi)源合成受到其前體物質(zhì)胍基乙酸的調(diào)控，胍基乙酸（Guanidineacetic acid，GAA）是一種天然存在于脊椎動物體內(nèi)的氨基酸衍生物[5-6]，從人和狗的尿液中分離得到是肌酸合成的直接前體物[7-8]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Ostojic等[9]研究發(fā)現(xiàn)，單次口服2.4 g的胍基乙酸1 h后，可增加人血清、尿液中的胍基乙酸和肌酸濃度。飼糧中添加0.06%的胍基乙酸，飼喂60 d后可以影響育肥豬的糖酵解[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于機(jī)體在運(yùn)動過程中對能量物質(zhì)的需求較大，胍基乙酸可轉(zhuǎn)化為肌酸，為機(jī)體提供能量?！緮M解決的關(guān)鍵問題】選用運(yùn)動訓(xùn)練伊犁馬為研究對象，于飼糧中添加不同水平的胍基乙酸，研究補(bǔ)喂胍基乙酸對運(yùn)動訓(xùn)練伊犁馬血漿胍基乙酸、肌酸濃度的影響，為伊犁馬的科學(xué)養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2020年5月17日～6月21日在新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇種馬場進(jìn)行。

挑選20匹年齡為2～3歲、體重[（373.2±30.53）kg]相近且經(jīng)過嚴(yán)格訓(xùn)練的速度賽用伊犁馬。隨機(jī)分為4組，每組5匹（3♀+2♂），進(jìn)行為期5周的試驗。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計

所有試驗馬匹所喂試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平一致。每匹馬每天飼喂精料補(bǔ)充料4 kg，自由采食青干草，各組每天每匹馬分別補(bǔ)喂0（CON組）、25（25 GAA組）、50（50 GAA組）、75 mg/kg BW（75 GAA組）的胍基乙酸（購自北京君德同創(chuàng)農(nóng)牧科技股份有限公司，純度≥98.0%）。胍基乙酸與玉米和次粉按照2∶1∶1制作成顆粒后與精料補(bǔ)充料混合補(bǔ)喂。試驗中胍基乙酸的補(bǔ)喂量參考Ostojic等[9]和Setoue等[11]的研究結(jié)果。表1

表1 試驗精料補(bǔ)充料和青干草營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）Table 1 Nutrient levels of concentrate supplementation and green hay（DM basis，%）

1.2.2 飼養(yǎng)管理

試驗馬匹單廄飼養(yǎng)管理，自由飲水。每天每匹馬飼喂4 kg精料補(bǔ)充料，自由采食青干草。補(bǔ)喂的胍基乙酸與精料補(bǔ)充料分為2份裝入封口袋，每日分2次飼喂，分別在08：00和20：00；青干草每日分3次添喂，分別在07：30、13：30和19：30。飼喂時先粗后精，先采食粗飼料1 kg，再補(bǔ)給精料補(bǔ)充料，待精料補(bǔ)充料采食完畢后，繼續(xù)添喂粗飼料。每天按時打掃馬廄，清除糞便和墊料，更換墊草。

1.2.3 訓(xùn)練方案及場地

試驗馬匹每天1次速度訓(xùn)練，馬匹訓(xùn)練時間安排在11：00～13：00或者17：30～19：30。首先熱身訓(xùn)練，騎手騎乘試驗馬在草道上慢步10 min，隨即進(jìn)入沙道，進(jìn)行10 min快步訓(xùn)練，15 min慢跳訓(xùn)練，停止訓(xùn)練，牽遛5～10 min，直至馬匹呼吸平穩(wěn)。訓(xùn)練場地為新疆昭蘇種馬場伊犁馬測試調(diào)訓(xùn)中心，賽道由橢圓形沙道和草道組成。內(nèi)部沙道由細(xì)沙構(gòu)成，深度40 cm，底部為土基，道寬21 m，周長為800 m；外部草道由天然的牧草形成，寬20 m，周長為1 000 m。

1.2.4 樣品采集及指標(biāo)測定

1.2.4.1 血漿生化

于試驗第1、3、5、7和10 d的飼喂后2 h使用5 mL肝素鈉抗凝管于馬匹頸靜脈采集血液1管，以3 500 r/min離心10 min，收集上清血漿，分裝，-20℃冷凍保存。

于試驗第36 d飼喂前0 h及飼喂后1、2、3、4、6、9、12 h使用5 mL肝素鈉抗凝管和4 mL氟化鈉抗凝管于馬匹頸靜脈采集血液各1管，以3500 r/min離心10 min，收集上清血漿，分裝，-20℃冷凍保存。

（2）無過熱現(xiàn)象，軸系相關(guān)部件溫度不能太高。尾軸管密封裝置的工作溫度不應(yīng)超過65℃，中間軸承的工作溫度不應(yīng)超過80℃；

血漿中胍基乙酸、肌酸和肌酐等代謝物指標(biāo)使用高效液相色譜儀定量分析檢測[12]。

1.2.4.2 尿液生化

于試驗第36 d，使用自制收尿裝置，收集試驗馬匹24 h尿樣，將尿液充分搖勻后，收集樣品50 mL存入凍存管，-20℃冷凍保存。

血漿中胍基乙酸、肌酸和肌酐等代謝物指標(biāo)使用高效液相色譜儀進(jìn)行定量分析檢測[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行初步整理，試驗馬匹血漿和尿液肌酸代謝物指標(biāo)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著則用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（mean±SD）表示，以0.05≤P＜0.10作為有顯著趨勢，P＜0.05為差異顯著水平，P＜0.01為差異極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 補(bǔ)喂GAA對伊犁馬飼喂后2 h血漿肌酸代謝物濃度的影響

2.1.1 補(bǔ)喂胍基乙酸對伊犁馬飼喂后2 h血漿Cr/GAA的影響

研究表明，25 GAA組馬匹在試驗第5、7及10 d的飼喂后2 h血漿Cr/GAA極顯著高于CON組（P＜0.01）；50 GAA組馬匹在試驗第1、3、5、7及10 d的飼喂后2 h血漿Cr/GAA均極顯著高于CON組、25 GAA組、75 GAA組（P＜0.01）；75 GAA組馬匹在試驗第1、7 d的飼喂后2 h血漿Cr/GAA極顯著高于CON組（P＜0.01）。表2

表2 補(bǔ)喂胍基乙酸下伊犁馬飼喂后2 h血漿Cr/GAA變化Table 2 Effects of supplemented with guanidineacetic acid on plasma Cr/GAA at 2 h after feeding in Yili horses（%）

2.1.2 補(bǔ)喂胍基乙酸對伊犁馬飼喂后2 h血漿肌酐濃度的影響

表3 補(bǔ)喂胍基乙酸下伊犁馬飼喂后2 h血漿肌酐濃度變化Table 3 Effects of supplemented with guanidineacetic acid on plasma creatinine concentration at 2 h after feeding in Yili horses（μmol/L）

2.2 補(bǔ)喂胍基乙酸對伊犁馬血漿肌酸代謝物濃度的影響

2.2.1 補(bǔ)喂胍基乙酸對伊犁馬血漿胍基乙酸濃度的影響

研究表明，與CON組相比，25 GAA組馬匹在飼喂后6 h血漿胍基乙酸濃度顯著低于CON組（P＜0.05）；50 GAA組馬匹在飼喂后3 h、4 h和6 h血漿胍基乙酸濃度顯著低于CON組（P＜0.05），且在飼喂后6 h達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；75 GAA組馬匹在飼喂后1、3、4、6、9和12 h血漿胍基乙酸濃度顯著低于CON組（P＜0.05），且在飼喂后1、4、6 h達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01）。25 GAA組馬匹在飼喂后1、3、4、6、9和12 h血漿胍基乙酸濃度顯著低于CON組（P＜0.05）。50 GAA組馬匹在飼喂后2、9 h血漿胍基乙酸濃度極顯著高于75 GAA組（P＜0.01），飼喂后2、12 h顯著高于25 GAA組（P＜0.05）。表4

表4 補(bǔ)喂胍基乙酸下伊犁馬血漿胍基乙酸濃度變化Table 4 Effects of supplemented with guanidineacetic acid on plasma guanidine acetic acid concentration in Yili horse（μmol/L）

2.2.2 補(bǔ)喂胍基乙酸對伊犁馬血漿肌酸濃度的影響

研究表明，與CON組相比，25 GAA組馬匹飼喂后9 h血漿肌酸濃度顯著高于CON組（P＜0.05）；50 GAA組馬匹飼喂后1、2、3、9和12 h血漿肌酸濃度極顯著高于CON組（P＜0.01）；75 GAA組馬匹飼喂后1、2、3和9 h血漿肌酸濃度極顯著高于CON組（P＜0.01）。50 GAA組馬匹飼喂后1、2、3、6和9 h血漿肌酸濃度極顯著高于25 GAA組（P＜0.01）。表5

表5 補(bǔ)喂胍基乙酸下伊犁馬血漿肌酸濃度變化Table 5 Effects of supplemented with guanidineacetic acid on plasma creatine concentration in Yili horse（μmol/L）

2.2.3 補(bǔ)喂胍基乙酸對伊犁馬血漿Cr/GAA的影響

研究表明，與CON組相比，25 GAA組馬匹在飼喂前及飼喂后2、3、4、9和12 h血漿Cr/GAA均極顯著高于CON組（P＜0.01）；50 GAA組馬匹在飼喂前及飼喂后1～12 h血漿Cr/GAA均極顯著高于CON組（P＜0.01）；70 GAA組馬匹在飼喂前及飼喂后1～9 h血漿Cr/GAA均極顯著高于CON組（P＜0.01）。表6

表6 補(bǔ)喂胍基乙酸下伊犁馬血漿Cr/GAA變化Table 6 Effect of guanidine acetic acid supplementation on plasma Cr/GAA in Yili horse

2.2.4 補(bǔ)喂胍基乙酸對伊犁馬血漿肌酐濃度的影響

研究表明，與CON組相比，各試驗組馬匹飼喂后0、1、2、3、4、6、9和12 h的血漿肌酐濃度均無顯著影響（P＞0.05）。表7

表7 補(bǔ)喂胍基乙酸下伊犁馬血漿肌酐濃度變化Table 7 Effects of supplemented with guanidineacetic acid on plasma creatinine concentration in Yili horse（μmol/L）

2.3 補(bǔ)喂胍基乙酸對伊犁馬24 h尿液肌酸代謝物排出量的影響

研究表明，各試驗組肌酸代謝物排出量均高于CON組。與CON組相比，50 GAA組和75 GAA組的24 h尿液胍基乙酸、肌酸、肌酐排出量均極顯著高于CON組（P＜0.01），25 GAA組的24 h尿液肌酸、肌酐排出量均極顯著高于CON組（P＜0.01）。表8

表8 補(bǔ)喂胍基乙酸下伊犁馬24 h尿液肌酸代謝物排出量變化Table 8 Effect of guanidine acetic acid supplementation on 24 h urinary creatine metabolite excretion in Yili horse

3 討論

3.1 補(bǔ)喂GAA對伊犁馬飼喂后2 h血漿肌酸代謝物濃度的影響

GAA是人和動物體內(nèi)合成肌酸的主要內(nèi)源性物質(zhì)，肌酸作為體內(nèi)新陳代謝的重要分子，是能量暫時儲存的場所。肌酸在體內(nèi)有游離態(tài)肌酸和磷酸肌酸兩種形式，二者一起構(gòu)成了磷酸原系統(tǒng)[13]。當(dāng)機(jī)體ATP過剩時，磷酸肌酸可將能量儲存，當(dāng)機(jī)體ATP不足時，磷酸肌酸將ATP釋放，但因為ATP不能穿透細(xì)胞膜，故其不可直接由體外補(bǔ)充得到，補(bǔ)充的能量物質(zhì)只能是葡萄糖或其他能源物質(zhì)。GAA作為肌酸的天然前體物質(zhì)，可通過在日糧中添加GAA來補(bǔ)充肌酸。肌酸在肌酸激酶的催化下生成磷酸肌酸，磷酸肌酸是動物體所有活細(xì)胞能源利用的關(guān)鍵物質(zhì)[14]，對動物的能量代謝和生長發(fā)育起著非常重要的作用[15-17]。

試驗中，補(bǔ)喂GAA顯著提高了各試驗組伊犁馬血漿Cr/GAA，其中50 GAA組極顯著高于CON組、25 GAA組、75 GAA組，顯著提高了50 GAA組馬匹肌酐濃度，對25、75 GAA組馬匹肌酐濃度無顯著影響。Ostojic等[9]研究發(fā)現(xiàn)，單次口服2.4 g GAA后，可極顯著增加人血清GAA、肌酸的濃度，對肌酐的濃度無顯著影響。Majdeddin等[18]選用1日齡羅斯308公雞720只，隨機(jī)分成3個處理組，分別在第26 d和第39 d采血，0.6、1.2 g/kg的GAA均提高了育肥雞生長階段的飼料轉(zhuǎn)化率，在試驗第26 d，0.6、1.2 g/kg GAA添加量組均可增加育肥雞血液中精氨酸含量，分別提高了18.3%、30.8%，同時均增加了兩個GAA處理組育肥雞的胸肌中磷酸肌酸、肌酸的含量。He等[19]試驗一將180頭平均體重為（33.61±3.91）kg的公豬按體重和性別分成5個處理組。試驗表明，98 d時，血清GAA和肝臟肌酐含量隨日糧中GAA添加水平的增加呈線性上升趨勢，但對于第35、70、98 d血清肌酐含量無顯著影響。與試驗研究結(jié)果一致。外源的GAA可轉(zhuǎn)化為肌酸，易于生物的利用，且添加GAA可節(jié)約精氨酸，使精氨酸更多的用于其他生理代謝。

3.2 補(bǔ)喂GAA對伊犁馬血漿和尿液肌酸代謝物含量的影響

GAA由甘氨酸和L-精氨酸合成，通過血液循環(huán)被轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，經(jīng)載體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入肝臟細(xì)胞合成肌酸，釋放進(jìn)入血液循環(huán)，然后經(jīng)肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CreaT）將肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入肌纖維和其它組織中[20]。肌酸通過肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入骨骼肌細(xì)胞后，在肌肉組織中被磷酸化形成磷酸肌酸[21]，參與機(jī)體反應(yīng)后，代謝為肌酐，經(jīng)尿液排出體外[13]。

試驗中，CON組血漿GAA、肌酸分別在飼喂后4、6 h達(dá)到峰值，而各試驗組均在飼喂后2 h出現(xiàn)峰值。各試驗組馬匹在飼喂前及飼喂后血漿Cr/GAA均極顯著高于CON組。血漿肌酐方面，各試驗組肌酐變化波動不大，但濃度普遍都高于CON組。對于肌酸代謝物排出量，各試驗組均極顯著高于CON組。He等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在育肥豬飼糧中添加300～1 200 mg/kg的GAA，均可增加第98天肝臟肌酸和血清GAA的濃度，但對于血清肌酐含量無顯著影響。Li等[22]選用48頭安格斯公牛，隨機(jī)分為4組，分別添加0、0.3、0.6和0.9 g/kg DM的GAA，補(bǔ)喂104 d后，0.6、0.9 g/kg組的血液肌酸含量高于對照組，而L-精氨酸甘氨酰轉(zhuǎn)移酶活性低于對照組。與試驗研究結(jié)果一致。GAA的外源補(bǔ)喂，促進(jìn)了伊犁馬機(jī)體對GAA的快速吸收。

試驗中，50 GAA組馬匹血漿肌酸、肌酐濃度及尿液肌酸、肌酐排出量最高，且高于75 GAA組。Tachikawa等[23]在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中導(dǎo)入含有大鼠GAA轉(zhuǎn)運(yùn)載體γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體2的基因，體外培養(yǎng)一段時間后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對胞外GAA的吸收呈現(xiàn)飽和效應(yīng)，當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)載體達(dá)到飽和，其GAA的轉(zhuǎn)運(yùn)速率不再增加，隨著外源GAA濃度的持續(xù)增加，過量的GAA則會對載體轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生一定程度的自身抑制。與試驗研究結(jié)果一致。75 GAA組補(bǔ)喂水平從腸道吸收后進(jìn)入肝臟細(xì)胞，達(dá)到了馬匹肝細(xì)胞GAA轉(zhuǎn)運(yùn)載體的飽和濃度，且過量的GAA對肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)GAA分子產(chǎn)生一定程度的抑制。

4 結(jié)論

補(bǔ)喂胍基乙酸極顯著提高了50 GAA組馬匹第1～10 d以及75 GAA組馬匹7 d、10 d的飼喂后2 h血漿Cr/GAA（P＜0.01），補(bǔ)喂胍基乙酸極顯著提高了各試驗組血漿Cr/GAA（P＜0.01），極顯著提高了50、75 GAA組馬匹血漿肌酸濃度及24 h尿液肌酸代謝物排出量（P＜0.01）。補(bǔ)喂胍基乙酸提高了伊犁馬血漿肌酸代謝物濃度，促進(jìn)了伊犁馬機(jī)體對胍基乙酸的快速吸收，以供機(jī)體利用，適宜添加水平為50 mg/kg BW。