金花菜與苜蓿屬主要物種基因組SSR分布特征的比較分析

周 勃，任海龍，，張 龑，高 強(qiáng)，徐 麟，鄒集文

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南三亞農(nóng)作物育種試驗(yàn)中心，海南三亞 572014；2.廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，廣州 510308；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，烏魯木齊 830091）

0 引言

【研究意義】金花菜（Medicago polymorpha）屬豆科苜蓿屬一年生苜蓿[1]。金花菜在食用、飼用、藥用和綠肥有較高價(jià)值[2]，早年金花菜在我國(guó)栽培面積達(dá)20×104hm2（300萬(wàn)畝）[3]。近年來(lái)，金花菜是我國(guó)極具發(fā)展前景的多用途豆科牧草[4]。金花菜其所在的豆科苜蓿屬（Medicago）大約有87個(gè)種，包括了豆科模式植物蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）和最重要的豆科牧草紫花苜蓿（Medicago sativa）[5]。金花菜作為苜蓿屬“Polymorpha clade”進(jìn)化分支的代表性物種，其染色體數(shù)目的非整倍體減少（基本染色體數(shù)8→7）[6]。利用金花菜全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，分析其基因組中簡(jiǎn)單重復(fù)序列的分布特征及與蒺藜苜蓿和紫花苜蓿的異同，對(duì)金花菜種質(zhì)資源遺傳多樣性和分子標(biāo)記輔助選育有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR，Simple Sequence Repeats）又稱微衛(wèi)星，為共顯性標(biāo)記，具有擴(kuò)增穩(wěn)定、數(shù)量豐富、多態(tài)性高及特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[7]、指紋圖譜構(gòu)建[8]、遺傳連鎖圖譜[9]及QTLs定位等研究[10]。利用高通量測(cè)序數(shù)據(jù)開發(fā)SSR標(biāo)記是一種快速、高效、低成本的策略。由于金花菜等一年生苜蓿缺乏基因組序列信息，Eujayl等[11]提出利用豆科模式植物蒺藜苜蓿的ESTs（Expressed sequence tags）序列，開發(fā)可用于其它一年生苜蓿的EST-SSR穿梭標(biāo)記，89%的蒺藜苜蓿EST-SSRs在其他一年生苜蓿上可以跑出條帶。Chu等[12]通過(guò)對(duì)92對(duì)蒺藜苜?；蚪MSSR的研究發(fā)現(xiàn)，有53%的蒺藜苜?；蚪MSSR標(biāo)記可以在金花菜上通用。但由于這些種間的SSR穿梭標(biāo)記通常來(lái)自于物種基因組的保守區(qū)域，檢測(cè)得到的金花菜多樣性并不高，且難以獲得大量的有效標(biāo)記[13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于缺少基因組信息，金花菜SSR標(biāo)記的開發(fā)只能借鑒其近緣物種的基因組進(jìn)行，制約著金花菜相關(guān)工作的有效開展。需找到均勻覆蓋金花菜全基因組的分子標(biāo)記并高通量開發(fā)。2021年金花菜的全基因組測(cè)序工作順利完成，針對(duì)該物種基因組進(jìn)行SSR標(biāo)記的分析與開發(fā)成為可能?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在perl語(yǔ)言環(huán)境下，運(yùn)行微衛(wèi)星篩選軟件MISA（MIcroSAtellite identification tool）的腳本，分別對(duì)金花菜、蒺藜苜蓿和紫花苜蓿的基因組FASTA文件進(jìn)行掃描，對(duì)篩選出的簡(jiǎn)單重復(fù)序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1 材料與方法

1.1 材料

金花菜基因組從國(guó)家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心（National Genomics Data Center）數(shù)據(jù)庫(kù)下載（https://bigd.big.ac.cn/gsa/s/q0VtV4XI）[14]；蒺 藜苜?；蚪M（Mt 5.0）從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫(kù)下載（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/6?genome_assembly_id=406060）[15]；紫花苜蓿基因組從Figshare科學(xué)數(shù)據(jù)共享平臺(tái)下載（https://figshare.com/articles/dataset/Medicago_sativa_genome_and_annotation_files/12623960）[16]，3種苜蓿基因組所有序列均以FASTA文件格式保存。表1

表1 三種苜蓿的基因組測(cè)序信息Table 1 Genome sequencing information of three Medicago species

1.2 方法

使用微衛(wèi)星檢索工具M(jìn)ISA[17]（https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/）執(zhí)行命令perl misa.pl genome.fasta，對(duì)3種苜蓿全基因組進(jìn)行掃描，篩選符合條件的簡(jiǎn)單重復(fù)序列。篩選標(biāo)準(zhǔn)為MISA軟件的默認(rèn)值：?jiǎn)魏塑账嶂貜?fù)次數(shù)在10次及以上，二核苷酸重復(fù)次數(shù)在6次及以上，三至六核苷酸重復(fù)次數(shù)在5次及以上，復(fù)合型SSR的檢索條件是2個(gè)SSR片段間的距離低于100 bp。將生成的數(shù)據(jù)采用Excel軟件整理，對(duì)序列特征進(jìn)行分析并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 金花菜基因組SSR總體分布特征的比較

研究表明，金花菜為同源二倍體，染色體數(shù)目為14條，全基因組大小為457.53 Mb，共篩選出195 753個(gè)SSR，相對(duì)密度為428個(gè)/Mb，平均長(zhǎng)度為18 bp；蒺藜苜蓿為同源二倍體，染色體數(shù)目為16條，全基因組大小為430.01 Mb，共篩選出242 434個(gè)SSR，相對(duì)密度為564個(gè)/Mb，平均長(zhǎng)度為15 bp；紫花苜蓿為同源四倍體，染色體數(shù)目為32條，全基因組大小為817.12 Mb，共篩選出390 496個(gè)SSR，相對(duì)密度為478個(gè)/Mb，平均長(zhǎng)度為16 bp。在這3種苜蓿中，金花菜檢索到的SSR最少，平均SSR長(zhǎng)度最長(zhǎng)；蒺藜苜蓿檢索到的SSR密度最高，平均SSR長(zhǎng)度最短；紫花苜蓿的基因組最大，SSR的總數(shù)量最多。表2

表2 三種苜蓿基因組中SSR的分布Table 2 Distribution of SSR in three Medicago species

2.2 金花菜基因組SSR不同核苷酸重復(fù)單元特征比較

研究表明，金花菜基因組SSR類型比較豐富，其中又以單核苷酸重復(fù)單元的數(shù)量最多，占基因組SSR數(shù)量的75.58%（147 953個(gè)SSR位點(diǎn)），其次為二、三核苷酸重復(fù)單元類型，分別占基因組SSR數(shù)量的15.31%（29 975個(gè)SSR位點(diǎn)）和7.94%（15 548個(gè)SSR位點(diǎn)）；四、五、六核苷酸重復(fù)單元類型所占比例均相對(duì)較低，三者的比例總和僅為1.16%（共2 277個(gè)SSR位點(diǎn)）。金花菜和蒺藜苜?；蚪M中，SSR均是單核苷酸重復(fù)單元數(shù)目最多，然后依次是二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸。紫花苜蓿除六核苷酸重復(fù)單元略高于五核苷酸重復(fù)單元外，其余核苷酸重復(fù)單元數(shù)目的變化趨勢(shì)與金花菜和蒺藜苜蓿相一致，均是隨重復(fù)單元核苷酸數(shù)的增加逐漸減少。

3種苜蓿同一核苷酸重復(fù)單元拷貝數(shù)變化趨勢(shì)是相似的，且均隨著重復(fù)拷貝數(shù)的增加，其SSR數(shù)目逐漸遞減。金花菜，蒺藜苜蓿和紫花苜蓿的單核苷酸重復(fù)單元拷貝數(shù)主要集中在10～25次，分別占單核苷酸類型SSR總數(shù)的99.34%，98.95%和99.33%；二核苷酸重復(fù)單元拷貝數(shù)主要集中在6～26次，分別占比92.94%，91.20%和88.74%；三核苷酸重復(fù)單元拷貝數(shù)范圍較為集中，主要集中在5～13次，分別占比94.21%，95.18%和88.81%；四核苷酸中重復(fù)單元拷貝數(shù)范圍也較為集中，主要集中在5～8次，分別占比93.95%，96.57%和91.25%；五核苷酸重復(fù)單元拷貝數(shù)主要集中在5～7次，占比96.41%，98.03%和94.53%；六核苷酸重復(fù)單元拷貝數(shù)主要集中在5～7次，占比92.17%，94.53%和91.20%。在3種苜蓿中，金花菜的單核苷酸和二核苷酸重復(fù)單元拷貝數(shù)更為集中，蒺藜苜蓿三、四、五、六核苷酸重復(fù)單元拷貝數(shù)更為集中，紫花苜蓿的核苷酸重復(fù)單元拷貝數(shù)比金花菜和蒺藜苜蓿較為分散。表3

表3 三種苜蓿不同SSR重復(fù)單元的數(shù)目和占比Table 3 Number and proportion of different SSR repeat types in three Medicago species

2.3 金花菜基因組SSR重復(fù)單元核苷酸構(gòu)成的比較

研究表明，共發(fā)現(xiàn)184種重復(fù)單元類型，比例最高的前20種類型共計(jì)有194 858個(gè)SSR（占99.54%）。在這些核苷酸重復(fù)單元中，單核苷酸重復(fù)單元中以A/T占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)（共142 396個(gè)，占72.74%），其次為C/G（共5 557個(gè)，占2.84%）；二核苷酸重復(fù)單元中以AT/AT占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)（共14 803個(gè)，占7.56%），其次為AG/CT（共9 781個(gè)，占5.00%）；三核苷酸重復(fù)類型中則以AAT/ATT（共5 694個(gè)，占2.91%）為優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元類型，其次為AAG/CTT（1.88%）、AAC/GTT（1.37%）、ATC/ATG（0.77%）和ACC/GGT（0.40%）重復(fù)單元類型；四、五、六核苷酸重復(fù)單元相對(duì)較少，但類型較豐富，共2 277個(gè)，占SSR總數(shù)的1.16%，其中有72種重復(fù)單元類型僅出現(xiàn)1次。圖1

圖1 金花菜基因組SSR的重復(fù)基元類型及數(shù)量Fig.1 The number of different SSR in Medicago polymorpha genome

蒺藜苜?；蚪M中共發(fā)現(xiàn)177種重復(fù)單元類型，比例最高的20種類型SSR共計(jì)241 517個(gè)（占99.62%），從高到低依次為：A/T（共185 412個(gè)，占76.48%）、AT/AT（共21 621個(gè)，占8.92%）、AG/CT（共9 493個(gè)，占3.92%）、AAT/ATT（共6 361個(gè)，占2.62%）、AC/GT（共4 435個(gè)，占1.83%）、AAG/CTT（共3 443個(gè)，占1.42%）、AAC/GTT（共3 268個(gè)，占1.35%）、C/G（共2 729個(gè)，占1.13%）、ATC/ATG（共1 549個(gè)，占0.64%）、AAAT/ATTT（共697個(gè)，占0.29%）、ACC/GGT（共675個(gè)，占0.28%）、AGG/CCT（共484個(gè)，占0.20%）、AGC/CTG（共246個(gè)，占0.10%）、ACT/AGT（共245個(gè)，占0.10%）、AAAG/CTTT（共173個(gè)，占0.07%）、AGAT/ATCT（共151個(gè)，占0.06%）、ACAT/ATGT（共148個(gè)，占0.06%）、CG/CG（共142個(gè)，占0.06%）、AAAAT/ATTTT（共124個(gè)，占0.05%）和AGGG/CCCT（共121個(gè)，占0.05%）。圖2

圖2 蒺藜苜蓿基因組SSR的重復(fù)基元類型及數(shù)量Fig.2 The number of different SSR in Medicago truncatula genome

紫花苜?；蚪M中共發(fā)現(xiàn)200種重復(fù)單元類型，比例最高的20種類型SSR共計(jì)387 829個(gè)（占99.32%），從高到低依次為：A/T（共274 264個(gè)，占70.23%）、AT/AT（共39 090個(gè)，占10.01%）、AG/CT（共20 359個(gè)，占5.21%）、AAT/ATT（共11 562個(gè)，占2.96%）、AC/GT（共10 985個(gè)，占2.81%）、AAG/CTT（共8 212個(gè)，占2.10%）、C/G（共6 811個(gè)，占1.74%）、AAC/GTT（共6 179個(gè)，占1.58%）、ATC/ATG（共2 773個(gè)，占0.71%）、AAAT/ATTT（共1 227個(gè)，占0.31%）、ACC/GGT（共1 177個(gè)，占0.30%）、AGG/CCT（共935個(gè)，占0.24%）、AATC/ATTG（共781個(gè)，占0.20%）、AATT/AATT（共747個(gè)，占0.19%）、AATGTC/ACATTG（共580個(gè)，占0.15%）、ACAT/ATGT（共542個(gè)，占0.14%）、ACT/AGT（共505個(gè)，占0.13%）、AGAT/ATCT（共396個(gè)，占0.10%）、AAAG/CTTT（共372個(gè)，占0.10%）和AGC/CTG（共332個(gè)，占0.09%）。

3種苜蓿中，紫花苜?；蚪M中SSR重復(fù)單元類型最多，其次是金花菜和蒺藜苜蓿。重復(fù)單元類型中，A/T、AT/AT、AG/CT和AAT/ATT是三種苜蓿共有的常見核心SSR類型。圖3

圖3 紫花苜蓿基因組SSR的重復(fù)基元類型及數(shù)量Fig.3 The number of different SSR in Medicago sativa genome

2.4 金花菜基因組SSR片段長(zhǎng)度比較

研究表明，金花菜基因組SSR序列長(zhǎng)度主要集中于12 bp以內(nèi)，為100 982個(gè)，占SSR總數(shù)的51.59%；分布于12～20 bp的SSR數(shù)量為72 215個(gè)，占SSR總數(shù)的36.89%；≥20 bp以上的SSR數(shù)量為22 556個(gè)，占SSR總數(shù)的11.52%。相較于蒺藜苜蓿和紫花苜蓿，金花菜SSR分布在＜12 bp長(zhǎng)度上的比例最高。金花菜仍有大量的中等多態(tài)性和較高多態(tài)性長(zhǎng)度的SSR，具有較大的多態(tài)性標(biāo)記開發(fā)潛力。圖4

圖4 金花菜基因組SSR不同片段長(zhǎng)度的數(shù)量Fig.4 The number of different fragment length SSR in Medicago polymorpha genome

3 討論

SSR序列長(zhǎng)度＜12 bp時(shí)SSR標(biāo)記的多態(tài)性表現(xiàn)極低；序列長(zhǎng)度在12～20 bp之間時(shí)標(biāo)記多態(tài)性適中；≥20 bp時(shí)具有較高多態(tài)性，是理想的標(biāo)記位點(diǎn)[18]。基因組中存在著大量的重復(fù)序列，從進(jìn)化角度看，物種間重復(fù)序列的差異是自然選擇的結(jié)果，因此鑒定SSR在基因組中的分布特征有重要意義[19]。金花菜、蒺藜苜蓿和紫花苜蓿是苜蓿屬的不同種，其中金花菜和蒺藜苜蓿屬于一年生苜蓿，紫花苜蓿屬于多年生苜蓿，3種苜蓿基因組有很強(qiáng)的的共線性關(guān)系[14]。研究發(fā)現(xiàn)，金花菜基因組SSR的分布密度為428個(gè)/Mb，明顯低于蒺藜苜蓿的分布密度（564個(gè)/Mb）以及紫花苜蓿的分布密度（478個(gè)/Mb）。Varshney等[20]研究認(rèn)為，SSR分布密度之所以出現(xiàn)差異，除了物種間差異因素外，還與測(cè)序數(shù)據(jù)深度、序列拼接數(shù)據(jù)質(zhì)量及SSR位點(diǎn)查找軟件以及SSR搜索標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。研究選用主流的微衛(wèi)星篩選軟件MISA（MIcroSAtellite identification tool），在相同設(shè)置條件下分析了這3種苜蓿間差異。金花菜、蒺藜苜蓿和紫花苜蓿的測(cè)序深度分別為117X、109X和153X，均為二代+三代測(cè)序組裝的高質(zhì)量基因組，結(jié)果比較能真實(shí)發(fā)映出物種間的差異。金花菜基因組SSR的分布密度較低，可能與金花菜染色體數(shù)目少有關(guān)。

單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復(fù)單元是絕大多植物基因組SSR序列中優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元[18，21]。研究發(fā)現(xiàn)，金花菜基因組SSR中，單、二和三核苷酸重復(fù)單元類型分別占基因組SSR數(shù)量的75.58%、15.31%和7.94%，其后依次是，四、五和六核苷酸重復(fù)單元，與蒺藜苜蓿觀測(cè)到的結(jié)果相一致。與金花菜和蒺藜苜蓿相比，紫花苜蓿的六核苷酸重復(fù)單元數(shù)量多于五核苷酸重復(fù)單元，且單核苷酸重復(fù)單元類型的SSR數(shù)量相對(duì)較少，這可能與紫花苜蓿是同源四倍體，異花授粉導(dǎo)致遺傳變異更為豐富有關(guān)。

4 結(jié)論

共發(fā)現(xiàn)94 771個(gè)片段長(zhǎng)度≥12 bp的金花菜基因組簡(jiǎn)單重復(fù)序列，具有較高的多態(tài)性。

金花菜基因組共篩選出195 753個(gè)SSR，相對(duì)密度為428個(gè)/Mb，平均長(zhǎng)度為18 bp，金花菜基因組SSR的分布密度低于蒺藜苜蓿和紫花苜蓿，重復(fù)單元類型較豐富，具有較大的多態(tài)性標(biāo)記開發(fā)潛力。