LC-MS/MS測定3種復(fù)合蔬果汁中吡唑醚菌酯、啶蟲脒及噠螨靈殘留

葉 倩，朱富偉，萬 凱，黃聰靈，唐雪妹

（1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與監(jiān)測技術(shù)研究所，廣州 510640；2廣東省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估重點實驗室，廣州 510640；3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室，廣州 510640）

0 引言

復(fù)合蔬果汁飲品，旨在提供多種維生素、礦物質(zhì)的同時兼具有豐富的口感而備受青睞。但由于復(fù)合蔬果汁原料為多種新鮮蔬菜水果，而蔬菜水果在種植過程中不可避免的施用農(nóng)藥，同時盲目或過量地使用這些農(nóng)藥而造成的環(huán)境污染、農(nóng)藥超標等問題使得蔬果汁中農(nóng)藥殘留存在一定的隱患。吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)、啶 蟲 脒 (acetamiprid)、噠 螨 靈(pyridaben)作為廣譜類的殺菌劑、殺蟲劑以及殺螨劑，目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，在初級農(nóng)產(chǎn)品中也有一定的檢出率。吡唑醚菌酯為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，通過抑制線粒體呼吸作用，使細胞缺乏正常代謝所需能量，最終導(dǎo)致細胞死亡[1]。啶蟲脒作為煙堿類殺蟲劑，主要作用于昆蟲神經(jīng)結(jié)合部后膜,通過與乙酰膽堿受體結(jié)合使昆蟲興奮-痙攣-麻痹-死亡，同時對抗有機磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯類殺蟲劑的害蟲有特效[2]。噠螨靈作為一種噠嗪酮類殺螨劑，因其對食植性害螨具有明顯的防治效果而被廣泛應(yīng)用。目前中國對吡唑醚菌酯、啶蟲脒、噠螨靈在飲料類中只規(guī)定了茶葉、茉莉花、咖啡豆、啤酒花中的限量，而蔬果汁中并無相應(yīng)的限量規(guī)定[3]。因此，建立快速、靈敏的檢測方法，對監(jiān)測復(fù)合蔬果汁中農(nóng)藥的殘留具有一定的重要意義。

目前，吡唑醚菌酯和噠螨靈主要通過氣相色譜(GC)[4-7]、液相色譜(LC)[8-11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GCMS)[12-13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)[14-16]等檢測方法進行。啶蟲脒報道的比較多的檢測方法主要集中于液相色譜法(LC)[11,17]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LCMS/MS)[16,18]。由于氣相色譜法、液相色譜法的靈敏度較低，易受干擾，準確度較低，在基質(zhì)相對簡單的作物上的單個殺菌劑殘留分析中發(fā)揮著重要作用。質(zhì)譜法的選擇性和靈敏度相對較高，在果蔬、谷物、茶葉、中藥材、飲料、肉類等復(fù)雜基質(zhì)的多殘留分析中發(fā)揮著主要作用。復(fù)合蔬果汁基質(zhì)相對于一般的植物源、動物源基質(zhì)酸性較大，含水量較高。本研究采用SPE凈化技術(shù)與LC-MS/MS結(jié)合，建立了一種快速、靈敏地檢測復(fù)合蔬果汁中吡唑醚菌酯、啶蟲脒和噠螨靈殘留的定量分析方法。

1 實驗步驟

1.1 儀器與試劑

SHIMADZU 8050液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本島津公司）；漩渦振蕩器(德國海道爾夫公司)；離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；超純水儀（美國密理博公司）；電子天平(梅特勒-托利多儀器(中國)有限公司)；氮吹儀（美國Organomation公司）。

色譜級乙腈、二氯甲烷、甲醇（德國默克公司）；色譜級甲酸（美國西格瑪公司）；SPE-NH2固相萃取柱（美國安捷倫公司）；分析純乙酸、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉（廣州化學(xué)試劑廠）。尼龍濾膜（天津津騰實驗設(shè)備有限公司）。

吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)、噠螨靈(pyridaben)和啶蟲脒(acetamiprid)標準品濃度為1000mg/L(純度≥99.0%)，購置于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所。

復(fù)合蔬果汁購于本地超市。分別以番茄，芒果和橙子作為基底液的3種復(fù)合蔬果汁，在外觀顏色上分別呈現(xiàn)紅色、黃色、橙色。

1.2 樣品的提取以及凈化

提?。悍Q取10.00 g樣品，用20m L酸化乙腈溶液（含體積分數(shù)1%乙酸），渦旋振蕩5m in進行提取，后加入4.00 g無水硫酸鎂、2.00 g無水乙酸鈉，再次渦旋振蕩2 m in；以4500 r/m in離心5 m in[19]，取上清液10 m L于另一干凈離心管中，氮吹至凈干，使用2m L二氯甲烷-甲醇（體積比95:5）混合液復(fù)溶，等待下一步凈化。

凈化：首先采用4m L二氯甲烷-甲醇（體積比95:5）混合液對所使用的SPE-NH2凈化柱進行活化，當溶劑液面達到凈化柱吸附層表面時，且溶劑未完全流凈時，加入提取待凈化溶液，用4m L二氯甲烷-甲醇（體積比95:5）混合液洗滌離心管后，再次對SPE-NH2凈化柱進行洗脫，重復(fù)2次，收集洗脫液，用氮氣吹收集到的洗脫液至近干，用乙腈定容到5m L，使用尼龍濾膜過濾后，等待儀器測定。

1.3 LC-MS/MS條件

色譜柱：島津Shim-pack XB-18色譜柱(2.1mm×50mm,2.6μm)。液相色譜及串聯(lián)質(zhì)譜儀器條件[19-20]見表1；吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒的質(zhì)譜檢測參數(shù)見表2。

表1 LC-MS/MS條件

表2 吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒的質(zhì)譜檢測參數(shù)

1.4 標準溶液配制及標準曲線的繪制

將吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒標準溶液，用適宜溶劑配制成儲備液，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ捎?種目標物在所用儀器的靈敏度不同，因此分別使用經(jīng)測定不含目標化合物的復(fù)合蔬果汁基質(zhì)溶液將吡唑醚菌酯和噠螨靈配制為 0.001、0.005、0.010、0.050、0.10、0.50 mg/L系列標準溶液；將啶蟲脒配制為0.005、0.010、0.050、0.10、0.50、1.0 mg/L系列標準溶液，以1.3節(jié)所述儀器條件進行檢測，以各待測目標化合物的定量離子響應(yīng)值為縱坐標(y)，以對應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(x)得到各目標化合物的標準曲線[21]，以便得到3種待測物的線性方程以及相關(guān)系數(shù)(R2)。

1.5 正確度和精密度

稱取經(jīng)測定不含吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒的復(fù)合蔬果汁樣品10.00 g，使用標準溶液儲備液進行0.010、0.10和0.50mg/kg 3個濃度的添加[21]，每個添加濃度重復(fù)6次。渦旋混勻后，按照1.2節(jié)所述條件進行樣品前處理。計算各添加濃度平均回收率及相對標準偏差(RSD)，用以考察方法的正確度和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑優(yōu)化

介于3種復(fù)合蔬果汁組成上的差別，致使不同復(fù)合蔬果汁在組成成份以及pH值存在一定的差異。試驗采用乙腈和酸化乙腈進行了提取溶劑優(yōu)化。結(jié)果如圖1所示：使用乙腈提取時，吡唑醚菌酯的回收率為88.5%～118.6%，RSD為3.6%～16.0%；噠螨靈的回收率為97.4%～111.6%，RSD為4.5%～15.7%；啶蟲脒的回收率處于73.1%～125.6%之間，RSD為7.3%～13.4%；使用含1%(v%)乙酸的乙腈溶液提取時3種農(nóng)藥的回收率在87.5%～106.8%之間，RSD為1.3%～9.5%，回收率以及相對標準偏差均優(yōu)于使用乙腈的提取效果。分析其原因，可能是由于提取液中所含有的乙酸與后續(xù)提取中所加入的無水乙酸鈉形成了一個緩沖體系，穩(wěn)定了提取體系的同時對目標物的提取也產(chǎn)生了一定的促進作用，確切原因需要進一步的研究考證。

圖1 不同提取溶劑對不同復(fù)合蔬果汁中吡唑醚菌酯、噠螨靈、啶蟲脒的提取效果影響

2.2 SPE柱洗脫液的優(yōu)化

基于3種復(fù)合蔬果汁成分以及pH上的差異，試驗對比了采用氨基SPE柱進行樣品凈化時，分別使用二氯甲烷-甲醇和乙腈-甲苯作為洗脫液時對3種農(nóng)藥回收率的影響。結(jié)果如圖2所示：使用二氯甲烷-甲醇為洗脫液時3種被試物的回收率為87.5%～106.8%，RSD為1.3%～9.5%；采用乙腈-甲苯為洗脫液時3種被試物的回收率為67.8%～119.9%，RSD為0.6%～14.5%。相比之下二氯甲烷-甲醇為洗脫液時3種被試物的回收率及RSD相對穩(wěn)定。本研究中最終使用二氯甲烷-甲醇為洗脫液，氨基SPE柱進行樣品凈化。

圖2 不同洗脫溶劑對不同復(fù)合蔬果汁中吡唑醚菌酯、噠螨靈、啶蟲脒的洗脫效果影響

2.3 線性方程、檢出限和定量限

使用1.4節(jié)所述方法配制吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒系列梯度基質(zhì)匹配標準溶液，得到3種目標化合物的線性方程。結(jié)果表明（表3）：吡唑醚菌酯和噠螨靈在0.001～0.50mg/L、啶蟲脒在0.005～1.0mg/L范圍內(nèi)，3種目標化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)在0.9984以上。定量限(LOQ)為最低添加濃度0.010mg/kg。

2.4 正確度和精密度

用復(fù)合蔬果汁空白基質(zhì)分別添加0.01、0.10、0.50mg/kg 3個濃度的上述3種農(nóng)藥，以測定方法的正確度和精密度。按照1.2節(jié)方法進行前處理，1.3節(jié)方法進行測定，試驗結(jié)果表明（表3）：添加0.010、0.10、0.50mg/kg 3個濃度時，3種目標農(nóng)藥的平均回收率、相對標準偏差(RSD)分別介于80.6%～113.4%、0.5%～9.3%之間，可以滿足復(fù)合蔬果汁中目標農(nóng)藥的定性、定量分析要求[22]。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

為了提高目標化合物的測定準確度，需要對不同基質(zhì)產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)作出評價，并選擇合適的方法減小基質(zhì)效應(yīng)的影響。本研究采用基質(zhì)效應(yīng)=（基質(zhì)匹配標準溶液響應(yīng)-純?nèi)軇藴嗜芤喉憫?yīng)）/純?nèi)軇藴嗜芤喉憫?yīng)×100[23]的方式對試驗中所產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)進行了評價。在0.10mg/L時，3種農(nóng)藥在3種復(fù)合蔬果汁中的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表3：吡唑醚菌酯在3種復(fù)合蔬果汁中都表現(xiàn)出基質(zhì)增強效應(yīng)，且3種蔬果汁中的差異相對較大，其中橙汁為基底液的復(fù)合蔬果汁中表現(xiàn)最強，達到56.8%。噠螨靈在3種復(fù)合蔬果汁中既有增強效應(yīng)也有減弱效應(yīng)，番茄、芒果為基底液的復(fù)合蔬果汁中表現(xiàn)出較弱的基質(zhì)減弱效應(yīng)-2.1%～-4.0%；而橙汁為基底液的復(fù)合蔬果汁中則表現(xiàn)出基質(zhì)增強效應(yīng)24.2%。啶蟲脒在3種復(fù)合蔬果汁中既有增強效應(yīng)也有減弱效應(yīng)，番茄、芒果為基底液的復(fù)合蔬果汁中表現(xiàn)出較強的基質(zhì)減弱效應(yīng)-56.0%～-54.0%；而橙汁為基底液的復(fù)合蔬果汁中則表現(xiàn)出基質(zhì)增強效應(yīng)14.2%。分析發(fā)現(xiàn)，3種農(nóng)藥在橙汁為基底液的復(fù)合蔬果汁中均表現(xiàn)出基質(zhì)增強效應(yīng)。在番茄、芒果為基底液的復(fù)合蔬果汁中則有所不同，分析是否與基質(zhì)的成分以及酸堿度(pH)有關(guān)，或者其他可能的原因需進一步研究分析確證。因此為保證定量結(jié)果的準確性，本論文中采用基質(zhì)匹配標準溶液對數(shù)據(jù)進行校準，進而消除基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果的影響。

表3 復(fù)合蔬果汁中吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒殘留測定方法確認(n＝6)

3 討論與結(jié)論

本研究建立了LC-MS/MS同時測定復(fù)合蔬果汁中吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒殘留的方法。目前文獻中對這3種目標物的殘留測定主要集中于蔬菜、水果等初級農(nóng)產(chǎn)品以及土壤中，對于加工后農(nóng)產(chǎn)品的報道相對較少。因此，本方法建立的在酸性較強且含水量較高的基質(zhì)中同時測定吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒3種不同種類農(nóng)藥殘留的方法在一定程度上彌補了這個空缺。同時，本研究中的目標物是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的3種殺菌劑、殺螨劑、殺蟲劑，對后續(xù)相似基質(zhì)中同類目標物的殘留分析提供一定參考數(shù)據(jù)。

本研究中的基質(zhì)酸性較強且含水量較高，對于一些酸不穩(wěn)定的殘留物來說，在酸性條件下是否會產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物是否也同樣會對人體健康產(chǎn)生一定的潛在危害，是否需要一并測定，需進一步進行研究討論。因此，使用該方法時可以根據(jù)目標物在酸性環(huán)境是否會產(chǎn)生代謝物進行考慮，必要時可對相關(guān)代謝物也一并進行測定。本研究是否適用于在酸性條件下不穩(wěn)定易降解的目標物，本文并沒有進一步進行研究，這也需進一步進行驗證。同時，基于風(fēng)險評估的角度，單個農(nóng)產(chǎn)品的攝入，對人體健康產(chǎn)生的風(fēng)險，與同時攝入多種農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)生的風(fēng)險也存在差異。同時攝入多種農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)生的風(fēng)險，可能會產(chǎn)生疊加效應(yīng)，因此需進一步進行探討。

本研究通過優(yōu)化樣品提取和凈化方法，建立了LC-MS/MS同時測定復(fù)合蔬果汁中吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒殘留的方法。本方法提供了在酸性較強且含水量較高的基質(zhì)中同時測定吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒3種不同種類農(nóng)藥殘留的方法，采用基質(zhì)匹配標準溶液對數(shù)據(jù)進行校準，從而有效降低了檢測過程中串聯(lián)質(zhì)譜所產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果準確度的影響。樣品前處理相對簡便、檢測靈敏度高，方法的線性關(guān)系在0.9984以上、在添加濃度為0.010、0.10和0.50 mg/kg時，3種目標物的回收率為80.6%～113.4%；相對標準偏差(RSD)介于0.5%～9.3%之間，正確度和精密度等指標均可滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求[22]，該方法適用于復(fù)合蔬果汁中吡唑醚菌酯、噠螨靈和啶蟲脒等同類農(nóng)藥殘留的同時檢測分析。