毛細(xì)管與聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測甜菜SSR位點的比較研究

馮琬淇，張福順，劉乃新

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜(Beta vulgaris L.)為莧科(Amaranthaceae)甜菜屬(Beta L.)。糖甜菜、根甜菜、葉甜菜、飼料甜菜是4種栽培變種，糖甜菜是世界上重要的糖料作物[1]，也是新興的能源作物，在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和發(fā)展地方經(jīng)濟(jì)中同樣有著重要地位[2]；根甜菜和葉甜菜均可食用，尤其是根甜菜有很高的藥用價值[3-4]和營養(yǎng)價值[5-6]，現(xiàn)有多個國家進(jìn)行種植[7]；而飼料甜菜由于其含糖量低，塊根大而主要被用于畜牧業(yè)。

分子標(biāo)記技術(shù)是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記之后發(fā)展起來的一種基于蛋白質(zhì)和核酸分子突變的理想的遺傳標(biāo)記形式[8]。SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有帶型整齊、退火溫度高、重復(fù)性好、共顯性及操作簡單等特點而得到了廣泛的應(yīng)用[9-10]。為了測定不同品種SSR位點的多態(tài)性，多態(tài)片段的分離常用瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳方法來檢測[11-12]。

毛細(xì)管電泳是最近幾年發(fā)展起來的技術(shù)，并不斷成熟，主要用于多肽、蛋白質(zhì)、核酸、離子和藥物的分離和測定[13]，技術(shù)原理是利用電場作為驅(qū)動力，毛細(xì)管作為通道，根據(jù)分子量或堿基逐個分離，可以同時檢測多個樣品和多個標(biāo)記，大大提高了檢測效率和精確度[14-15]。2010年梁俊等[16]使用了SSR標(biāo)記和毛細(xì)管電泳對甘蔗進(jìn)行了遺傳分析，結(jié)果表明SSR分子標(biāo)記與毛細(xì)管技術(shù)結(jié)合，相比別的分子標(biāo)記技術(shù)或電泳技術(shù)，具有更準(zhǔn)確、簡便、自動化等優(yōu)點；2011年陳雅瓊等[17]利用SSR熒光標(biāo)記和毛細(xì)管電泳對煙草進(jìn)行了遺傳分析，結(jié)果表明熒光檢測法克服了銀染法的不足，具有簡便、可靠及高通量的優(yōu)點；2017年郭正兵等[18]通過SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳分析了30份無花果品種遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)了30份無花果品種資源表現(xiàn)出比較豐富的遺傳多樣性；2018年胡依依等[19]進(jìn)行了聚丙烯酰胺凝膠與毛細(xì)管電泳檢測龍須菜SSR位點的比較研究經(jīng)，測序檢驗，PAGE結(jié)果均準(zhǔn)確，而毛細(xì)管電泳分型結(jié)果出現(xiàn)誤差。在樣本量少，SSR位點的變異小時,使用PAGE檢測SSR位點更為準(zhǔn)確。

本研究選擇8個甜菜品種，8對SSR引物，利用聚丙烯酰胺電泳和毛細(xì)管電泳兩種檢測平臺，來檢驗引物對品種的鑒定效果，為進(jìn)一步甜菜品種鑒定提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料

選取8個不同的甜菜品種，具體實驗材料見表1。將種子播種于營養(yǎng)缽中，在室溫20℃，光照3500 lux的條件下培養(yǎng)10天，待幼苗長至5 cm左右剪下，用無菌水沖洗干凈并晾干備用。

表1 甜菜品種信息表

1.2 主要試劑及儀器

PCR擴(kuò)增所用的主要試劑2xTaq PCRM ix、50 bp Marker購自大連寶生物有限公司；引物由擎科生物有限公司合成。主要儀器有JY-JX5北京君意東方電泳儀，Nanodrop one超微量分光光度計，Thermal Cycler C1000 Touch型PCR儀，ABI3730高通量基因分析儀。

1.3 甜菜基因組DNA模板的提取

用CTAB法提取基因組DNA[20]，樣品放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SSR引物擴(kuò)增

選擇8個SSR位點設(shè)計引物，具體引物信息見表2。常規(guī)反應(yīng)體系：在20μL的反應(yīng)體系中包括：100 μmol/L的上下游引物各 1μL，M IX（2×DNA Polymerase、Buffer、dNTPM ixture），2×Taq PCR M ix 10μL，10 ng/μL的DNA模板2.0μL，滅菌超純水補(bǔ)足至20μL，旋渦振蕩混勻。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3m in；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次；最后再72℃延伸5m in。

1.5 SSR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

1.5.1 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行檢測。在180V恒壓條件下電泳50m in。用改良的銀染法進(jìn)行染色顯影[21]。然后放置在白光板上拍照保存。

1.5.2 毛細(xì)管電泳檢測 將表2中SB13、Bvv23和GTT1合成ROX標(biāo)記的熒光引物，BvCA2、SB15和Bvv45合成FAM（藍(lán)）標(biāo)記的熒光引物，SSD6、SB06合成HEX（綠）標(biāo)記的熒光引物，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，等體積混合不同熒光標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物，混勻后從混合液中吸取1μL加入到DNA分析儀專用96孔板孔中，板中各孔分別加入0.1μL分子量內(nèi)標(biāo)和8.9μL去離子甲酰胺。將樣品在PCR儀上95℃變性5m in后取出，立即置于碎冰上，冷卻10m in以上，離心10 s后放置到DNA分析儀上，隨后利用ABI3730XLDNA序列分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，檢測目的產(chǎn)物的片段大小，得到初始數(shù)據(jù)后用Gene Marker V2.2.0進(jìn)行分析并得到峰圖。

表2 SSR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 PAGE膠檢測結(jié)果

根據(jù)PAGE膠上不同個體之間的差異性條帶可以得到每條條帶上的等位基因數(shù)目，等位基因數(shù)目為3個的多態(tài)性SSR位點包括BVV45、SB15和SSD6，等位基因數(shù)目為2個的多態(tài)性SSR位點包括BVV23、GTT1、SB06和SB13，而非多態(tài)性SSR引物包括BVCA2，如圖1所示。

圖1 引物PAGE膠檢測結(jié)果

2.2 毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果

根據(jù)毛細(xì)管電泳分型結(jié)果分析，引物BvCA2、Bvv23分別在8個個體中出現(xiàn)2條不同分子量的DNA片段，引物SB13、SB06、GTT1、Bvv45分別在8個個體中出現(xiàn)3條不同分子量的DNA片段，引物SB15在8個個體中出現(xiàn)7條不同分子量的DNA片段。引物SSD6在8個個體中出現(xiàn)4條不同分子量的DNA片段，部分分型結(jié)果如下。圖2、圖3分別為SSR熒光標(biāo)記電泳檢測法對引物Bvv45、SB15擴(kuò)增產(chǎn)物分析的結(jié)果。結(jié)果表明，Bvv45分別在8個個體中出現(xiàn)3種分型結(jié)果如圖2，即140、212、231 bp；SB15引物在8個個體中出現(xiàn)了7種分型結(jié)果如圖3，即138、143、147、152、153、154、168 bp，總體信號清晰，可以直觀的看出不同峰型的堿基數(shù)，易于判斷，可以用于鑒定8個體多態(tài)性的檢測。

圖2 引物Bvv45特征峰圖

圖3 引物SB15特征峰圖

2.3 兩種方法的檢測結(jié)果比較

表3顯示8個品種在8對SSR引物上的毛細(xì)管電泳和PAGE結(jié)果的比較，PAGE與毛細(xì)管電泳分型結(jié)果一致的位點包括SB13，而分型結(jié)果不一致的位點包括BvCA2、BVV23、BVV45、GTT1、SB06、SB15和SSD6，不同引物兩種檢測方法的匹配比率分別是75%、87.5%、50%、75%、25%、100%、37.5%、50%。毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記法各分子樣品中均含有分子量內(nèi)標(biāo)，因此可以準(zhǔn)確的知道DNA片段的分子大小，當(dāng)檢測樣品多時具有較高準(zhǔn)確性；PAGE電泳檢測不同樣品的分子量時，只能用肉眼觀察出與Marker比較估測得出大致分子量，不能得出準(zhǔn)確分子量。

表3 8個甜菜品種在8對SSR引物上的毛細(xì)管電泳和PAGE結(jié)果比較

3 討論與結(jié)論

3.1 PAGE電泳檢測SSR的方法探究

用PAGE進(jìn)行電泳時，可以選用6%或8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行檢測：有研究表明[22]，8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果由于凝膠濃度偏高，以致條帶模糊、不齊整，泳道痕跡明顯。6%的非變性聚丙烯酰胺的結(jié)果明顯，沒有拖尾，而且能將條帶均勻分開，因此本實驗采用6%的非變性聚丙烯酰胺進(jìn)行電泳。

并且判斷SSR位點的多態(tài)性，需要得到穩(wěn)定清晰的譜帶，因此在做膠技巧、電泳時間、上樣量、銀染時間等因素上進(jìn)行探究，得到以下經(jīng)驗：做膠時的玻璃板要徹底清洗干凈，不能在上面有明顯的膠塊，否則在電泳結(jié)束時取下凝膠會使玻璃板與凝膠難以分離；緩沖液要定時更換，否則電泳時會使條帶偏離難以辨認(rèn)，影響結(jié)果的判斷；上樣時，一定要保證手穩(wěn)，輕按移液器，讓樣品緩慢輕柔地沉入進(jìn)樣孔內(nèi)，待全部樣品擠出槍頭后再緩慢拿走移液器，這樣可以防止出現(xiàn)條帶拖尾的現(xiàn)象；在銀染時間上，也需要時刻注意，切勿染色太久，會導(dǎo)致凝膠顏色過深難以分辨條帶，也不可以染色時間過短，導(dǎo)致條帶與凝膠分離不開；電泳時間要控制在90min左右，時間過短不能使目標(biāo)條帶分離，會聚集在一起難以辨認(rèn)，而電泳時間過長會使目標(biāo)條帶跑到非變性凝膠外面以至于彌散存在。

3.2 PAGE電泳與毛細(xì)管電泳檢測SSR方法比較

毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記法各分子樣品中均含有分子量內(nèi)標(biāo)，因此可以準(zhǔn)確的知道DNA片段的分子大小，當(dāng)檢測樣品多時具有較高準(zhǔn)確性，但是有的樣品的檢測結(jié)果丟失，峰圖雜亂沒有目標(biāo)峰，如GTT1引物的4號樣本和SB06引物的4號和7號樣本，然而PAGE電泳檢測目標(biāo)條帶明顯，因此可以排除無效等位基因的可能[23]，比較分析原因可能是由于在進(jìn)行熒光PCR時，加入的樣品較少或忘記加入熒光引物，如果只依靠毛細(xì)管電泳結(jié)果則無法判斷是否有無效等位基因。PAGE電泳檢測不同樣品的分子量時，只能用肉眼與Marker比較估測得出大致分子量，不能得出準(zhǔn)確分子量。

利用PAGE電泳進(jìn)行檢測時，需要一板96孔板中的64格，進(jìn)行電泳時只需兩塊玻璃膠，大約一小時后即可完成電泳銀染的過程，因此效率較高，而進(jìn)行毛細(xì)管電泳時，需要將PCR樣品送到生物公司再進(jìn)行檢測，隨后的數(shù)據(jù)整理過程也費時費力，因此，PAGE電泳具有效率高的優(yōu)點。

目前，利用毛細(xì)管電泳熒光比較法的高通量、智能化等優(yōu)點，分子標(biāo)記技術(shù)得到了迅速發(fā)展，該方法具有較高的靈敏度能夠較好地區(qū)分出不同的等位變異。傳統(tǒng)的PAGE檢驗方式在樣本數(shù)量較多時不僅耗時、費力，同時在對大量多批次的數(shù)據(jù)采集和分析過程中也有較大的缺陷，主要體現(xiàn)在對不同的等位變異數(shù)無法精確鑒定，對各個批次反映的數(shù)量也無法統(tǒng)一管理。毛細(xì)管檢測技術(shù)的創(chuàng)新之處在于：與銀染技術(shù)相比，熒光法具有更高的精度和效率，它能準(zhǔn)確地計算出微衛(wèi)星等位突變的擴(kuò)增片段，使其與高效自動化技術(shù)相結(jié)合，并能有效地降低銀染對環(huán)境的影響。

本研究實驗中出現(xiàn)的特殊情況在跑PAGE膠是會出現(xiàn)不同程度的脫帶，會導(dǎo)致銀染所呈現(xiàn)的結(jié)果不清晰，讀帶不完整，因此可以看出普通的PAGE電泳具有實驗上的誤差，不夠方便靈敏。熒光檢測技術(shù)的限制因素在于PCR需要運送時間，數(shù)據(jù)分析也較為費力。

但是，由于毛細(xì)管檢測法技術(shù)的費用較高，相比之下銀染技術(shù)比較經(jīng)濟(jì)，常規(guī)使用的聚丙烯酰胺凝膠電泳法和銀染法可以很好的分辨出不同的種類，從而大大減少了測試費用。利用熒光法進(jìn)行快速、高效、自動化的毛細(xì)管電泳技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)前生命科學(xué)的一個熱點和焦點。大量的實驗結(jié)果顯示，毛細(xì)管電泳技術(shù)操作簡單、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，特別是DNA片段多態(tài)性的檢測，能更全面、準(zhǔn)確地反映出DNA的多態(tài)性和多態(tài)性。試驗結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的銀染方法相比，這種方法具有更好的應(yīng)用前景。結(jié)果表明，該技術(shù)正朝著簡便、快速、高通量、自動化、智能化的方向發(fā)展。

綜上，通過比較PAGE膠與毛細(xì)管熒光檢測技術(shù)兩種技術(shù)，當(dāng)樣品較少時利用PAGE電泳的方法來檢測SSR位點的多態(tài)性，既能節(jié)省成本又能節(jié)省時間，還能保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，而樣品較多并且經(jīng)費充足時，可以使用毛細(xì)管電泳的方法，可以減少操作人員與有毒害的聚丙烯酰胺凝膠、銀染液接觸，將操作人員從大量枯燥重復(fù)的實驗中解脫開來，自動上樣的毛細(xì)管電泳可以提高工作效率，并且避免了由于人工操作引起的誤差[24]。