長(zhǎng)鏈非編碼RNA KUCG1通過MAGEA11調(diào)節(jié)PTEN/AKT/mTOR途徑促進(jìn)ccRCC舒尼替尼的耐藥性①

汪浩洋 毛正發(fā) 鄒元章 盧俅董迪 姚勤 陳兵海

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，鎮(zhèn)江 212001）

近年腎癌發(fā)病率逐年遞增，且腎癌發(fā)病率與年齡增長(zhǎng)密切相關(guān)［1］。2018年全球腎癌病死人數(shù)超過175 000例［2］。腎透明細(xì)胞癌（clear cell carcinoma of kidney，ccRCC）占 成 人 腎 細(xì) 胞 癌70%以 上［3］。ccRCC對(duì)放化療均不敏感，手術(shù)治療是其主要治療方式，但ccRCC缺乏早期臨床特征，導(dǎo)致部分患者就診時(shí)已失去根治性手術(shù)的機(jī)會(huì)［4］。即使切除腫瘤，仍有20%~30%患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［5］。

分子靶向藥物的出現(xiàn)給腫瘤治療提供了新的視角［6］。舒尼替尼是一種血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）靶向抑制劑，可通過抑制血管生成而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，明顯改善晚期腎癌患者預(yù)后［7-8］。但長(zhǎng)期使用舒尼替尼會(huì)誘導(dǎo)腫瘤耐藥，加上部分患者先天性耐藥，限制了該藥物的應(yīng)用［9］。腫瘤旁路信號(hào)激活可導(dǎo)致舒尼替尼耐藥，但耐藥機(jī)制尚不明確［10］。因此，揭示舒尼替尼耐藥的潛在機(jī)制并逆轉(zhuǎn)耐藥性迫在眉睫。

隨著基因測(cè)序技術(shù)發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了數(shù)以萬計(jì)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。研究顯示，lncRNA在調(diào)控細(xì)胞功能、疾病和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［11-12］。但lncRNA影響舒尼替尼耐藥的分子機(jī)制鮮有報(bào)道。

KUCG1是新近發(fā)現(xiàn)的lncRNA，又名LINC00850，最初由TRAN等［13］在杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良患者中發(fā)現(xiàn)，KUCG1下調(diào)可能與精神發(fā)育遲滯相關(guān)。但目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)闡釋KUCG1的具體功能。而KUCG1表達(dá)、臨床意義和對(duì)舒尼替尼耐藥性的影響尚無相關(guān)研究。本研究通過體外試驗(yàn)研究KUCG1對(duì)ccRCC細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的影響，研究KUCG1對(duì)ccRCC細(xì)胞舒尼替尼耐藥性的作用，并探討其可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料769-P和786-O腎癌細(xì)胞株購自ATCC；293-T細(xì)胞株購自漢恒生物科技有限公司（上海）；RNA提取試劑盒購自超研生物科技有限公司（上海）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒購自諾維贊生物科技有限公司（南京）；凋亡試劑盒購自福麥斯生物技術(shù)有限公司（南京）；酶標(biāo)儀（Multiskan GO）購自Thermo公司；流式細(xì)胞分析儀購自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)769-P和786-O腎癌細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培 養(yǎng)基，293-T細(xì)胞 培養(yǎng) 于DMEM培養(yǎng)基，所有培養(yǎng)基均含10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2。

1.2.2 qPCR檢測(cè)提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qPCR試劑盒檢測(cè)基因表達(dá)，以2μl cDNA作為qPCR反應(yīng)模板，以GAPDH為內(nèi)參，KUCG1正向引物序列：5'-TGCCTTCATCCCATTGTCCT-3'，反向引 物 序 列：5'-AGACATGGCACCACTGATGA-3'；MAGEA11正向引物序列：5'-ATGCTGGGGAGTGT?CATCAA-3'，反向引物序列：5'-ATGCAGTTCCCCTCCATGAA-3'；GAPDH正向引物序列：5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，反向引物序列：5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'。2-ΔΔCt法計(jì)算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 慢病毒感染慢病毒感染試驗(yàn)參考文獻(xiàn)［14］。采用REV、GAG、VAVG 3種質(zhì)粒構(gòu)建慢病毒系統(tǒng)，包裝CRISPR/Cpf1-KUCG1基因序列的質(zhì)粒后感染293-T細(xì)胞獲取病毒液。病毒液感染腎癌769-P和786-O細(xì) 胞，構(gòu) 建 穩(wěn) 定 低 表 達(dá)KUCG1的769-P和786-O腎癌細(xì)胞株KUCG1（-）-1、KUCG1（-）-2。感染后培養(yǎng)24 h更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)基。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用吉瑪制藥技術(shù)有限公司（上海）的siRNA轉(zhuǎn)染試劑向穩(wěn)定低表達(dá)KUCG1的769-P和786-O腎癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-MAGEA11和陰性對(duì)照（NC），轉(zhuǎn)染6 h后更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)基。siRNA-MAGEA11正向引物序列：5'-GCACUACUUUCCUGAGAUATT-3'，反向引物序列：5'-UAUCUCAGGAAAGUAGUCCTT-3'；NC正向引物序列：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反向引物序列：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

1.2.5 CCK-8將細(xì)胞接種至96孔板，100μl/孔，密度為5 000個(gè)/孔。孵育4 h，加入舒尼替尼（10μmol/L）分別處理769-P和786-O細(xì)胞72 h和120 h，每48 h更換1次培養(yǎng)基。加入CCK-8試劑37℃孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)量各孔450 nm處吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 侵襲實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞懸浮于500 μl不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，添加至小室上室（5 000個(gè)/室）。將500μl含10%FBS的完全培養(yǎng)基添加至小室下室，37℃孵育24 h，棉簽擦拭過濾器上側(cè)，冷甲醇固定過濾器，0.1%結(jié)晶紫染色30 min。隨機(jī)選擇多個(gè)區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和拍照。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡采用凋亡試劑盒分析細(xì)胞凋亡，冷的PBS洗滌細(xì)胞，采用250μl結(jié)合緩沖液重新懸浮（1×106個(gè)/ml）。取100 μl加入2.5 μl Annexin V/Alexa Flour 488和5 μl碘化丙啶避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀測(cè)量樣品熒光強(qiáng)度，F(xiàn)lowJo_V10軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.8 Western blot收集細(xì)胞，加入含磷酸化酶抑制劑和PMSF的RIPA裂解液冰上裂解30 min，4℃、13 000 r/min離心10 min，取上清，采用蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定蛋白濃度，-80℃儲(chǔ)存。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜，3%BSA封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，加入二抗孵育2 h，TBST洗滌3次，化學(xué)發(fā)光成像儀獲取圖像，Image J軟件分析條帶灰度，以GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用方差分析（ANOVA），以±s表示。GraphPad Prism8軟件繪圖，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KUCG1表達(dá)下調(diào)與ccRCC舒尼替尼耐藥相關(guān)本研究建立一個(gè)包括244個(gè)lncRNA的gRNA文庫，采用CRISPR/cas9技術(shù)將244個(gè)lncRNA gRNA文庫感染769-P細(xì)胞，得到下調(diào)244個(gè)lncRNA的769-P細(xì)胞文庫，舒尼替尼（10μmol/L）作用6 d后得到舒尼替尼耐藥的769-P細(xì)胞，對(duì)244個(gè)lncRNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，與未處理的769-P細(xì)胞相比，處理后細(xì)胞KUCG1表達(dá)明顯下降（P=0.004，圖1A、B、D）。推測(cè)KUCG1與腎癌細(xì)胞舒尼替尼耐藥有關(guān)，其位于染色體Xq28區(qū)域，長(zhǎng)度為54 092個(gè)核苷酸（圖1C）。TCGA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，腎癌組織中KUCG1表達(dá)明顯下調(diào)（圖1E）。

圖1 KUCG1（LINC00850）與舒尼替尼耐藥有關(guān)Fig.1 KUCG1（LINC00850）is related to sunitinib resis?tance

2.2 KUCG1表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)ccRCC對(duì)舒尼替尼的耐藥性為研究KUCG1對(duì)ccRCC細(xì)胞舒尼替尼耐藥性的影響，以769-P和786-O ccRCC細(xì)胞建立穩(wěn)定低表達(dá)KUCG1的細(xì)胞株（圖2A），CCK-8結(jié)果顯示，舒尼替尼以時(shí)間依賴的方式抑制腎癌細(xì)胞活力，而KUCG1低表達(dá)顯著提高兩種細(xì)胞對(duì)舒尼替尼的耐藥性，提高769-P和786-O細(xì)胞生存能力（圖2B）。舒尼替尼處理48 h后，對(duì)照組比KUCG1下調(diào)組出現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變，包括細(xì)胞極性消失、細(xì)胞膜收縮、細(xì)胞質(zhì)空泡化（圖2C）。提示KUCG1下調(diào)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，降低腫瘤細(xì)胞對(duì)舒尼替尼的敏感性。

圖2 KUCG1表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)ccRCC細(xì)胞舒尼替尼耐藥性（×400）Fig.2 Down-regulation of KUCG1 expression induced sunitinib resistance in ccRCC cells（×400）

2.3 KUCG1表達(dá)下調(diào)促進(jìn)腎癌細(xì)胞侵襲，抑制其凋亡侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KUCG1下調(diào)，腎癌細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組（圖3A），提示KUCG1表達(dá)下調(diào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲。采用流式細(xì)胞儀分析KUCG1下調(diào)對(duì)ccRCCs細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，KUCG1下調(diào)，腎癌細(xì)胞凋亡率明顯下降（圖3B），提示KUCG1下調(diào)可抑制腎癌細(xì)胞凋亡。

圖3 KUCG1表達(dá)下調(diào)增強(qiáng)腎癌細(xì)胞侵襲及抗凋亡能力（×400）Fig.3 Down-expression of KUCG1 enhanced invasion and anti-apoptosis ability of renal carcinoma cells（×400）

2.4 KUCG1表 達(dá) 下 調(diào) 可 調(diào) 節(jié)PTEN/AKT/mTOR信號(hào)通路Western blot檢測(cè)KUCG1下調(diào)對(duì)PTEN/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，KUCG1下調(diào)，腎癌細(xì)胞mTOR和p-AKT表達(dá)增加，PTEN表達(dá)降低（圖4）。KUCG1通過調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白表達(dá)增強(qiáng)腎癌細(xì)胞增殖和侵襲，并增強(qiáng)其耐藥性。

圖4 KUCG1下調(diào)后PTEN/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.4 Expressions of PTEN/AKT/mTOR signal-related proteins after KUCG1 down-regulation

2.5 KUCG1通過上調(diào)MAGEA11表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖KUCG1前后1 Mb基因表達(dá)情況分析結(jié)果顯示，與未處理的腎癌769-P細(xì)胞相比，舒尼替尼耐藥的腎癌細(xì)胞MAGEA11表達(dá)明顯升高且變化最為顯著，786-O細(xì)胞株同樣表現(xiàn)出相同結(jié)果（圖5A），推測(cè)KUCG1可能通過調(diào)控MAGEA11表達(dá)影響腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為。Western blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組相比對(duì)照組細(xì)胞MAGEA11蛋白水平明顯升高（圖5B）。為進(jìn)一步研究KUCG1基因下調(diào)后促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，采用siRNA下調(diào)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MAGEA11表達(dá)，并采用qPCR和Western blot驗(yàn)證其MAGEA11下調(diào)結(jié)果（圖5B、C）。STRING數(shù)據(jù)庫查詢發(fā)現(xiàn)，MAGEA11可通過調(diào)控AKT/mTOR信號(hào)通路影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為。Western blot檢測(cè)PTEN/AKT/mTOR信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)，MAGEA11下調(diào)后mTOR和p-AKT表達(dá)下降，PTEN表達(dá)上升（圖6）。表明KUCG1下調(diào)通過上調(diào)MAGEA11表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)其耐藥性。

圖5 KUCG1調(diào)控MAGEA11表達(dá)Fig.5 KUCG1 regulates expression of MAGEA11

圖6 MAGEA11影響PTEN/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.6 MAGEA11 affects expressions of PTEN/AKT/mTOR signaling pathway related proteins

2.6 MAGEA11表達(dá)下調(diào)腎癌細(xì)胞增殖、侵襲減弱，凋亡增強(qiáng)為驗(yàn)證MAGEA11對(duì)腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，采用siRNA-MAGEA11下調(diào)769-P腎癌細(xì)胞KUCG1下調(diào)組MAGEA11表達(dá)，CCK-8、侵襲和凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MAGEA11表達(dá)下調(diào)后腎癌細(xì)胞增殖和侵襲能力較處理前明顯降低，凋亡明顯增強(qiáng)（圖7）。

圖7 MAGEA11表達(dá)下調(diào)影響腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為（×400）Fig.7 Down-regulation of MAGEA11 expression affects biological behavior of renal cell carcinoma（×400）

3 討論

本研究顯示，舒尼替尼以劑量依賴的方式抑制腫瘤細(xì)胞生存能力。KUCG1表達(dá)下調(diào)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞活力和對(duì)舒尼替尼的耐藥性。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，KUCG1下調(diào)后抑制腎癌細(xì)胞凋亡，可能依賴于細(xì)胞周期激活。G1/S期轉(zhuǎn)換過程中，周期蛋白依賴激酶（CDK）和細(xì)胞周期蛋白D和E結(jié)合維持細(xì)胞循環(huán)正常進(jìn)行［15］。KUCG1下調(diào)可能促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D和E表達(dá)，或與細(xì)胞周期蛋白/CDK復(fù)合物抑制劑表達(dá)降低有關(guān)，促進(jìn)細(xì)胞循環(huán)及細(xì)胞生長(zhǎng)。

KUCG1下調(diào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，表明藥物誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。KUCG1下調(diào)可抵抗舒尼替尼殺傷效應(yīng)。舒尼替尼可通過抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transi?tion，EMT）過程抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT過程中，由于上皮鈣黏蛋白表達(dá)減少導(dǎo)致上皮細(xì)胞極性喪失，細(xì)胞間黏附減少，誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［16］。同時(shí)腫瘤細(xì)胞耐藥性與EMT密切相關(guān)。KUCG1可能通過促進(jìn)EMT促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥。

晚期腎癌患者對(duì)靶向藥物產(chǎn)生耐藥性，目前臨床無有效治療方法。腫瘤對(duì)一線TKI藥物產(chǎn)生耐藥的可能機(jī)制包括：血管生成信號(hào)激活后血管再生；增加覆蓋的被膜細(xì)胞保護(hù)脈管系統(tǒng)；改變腫瘤微環(huán)境及增強(qiáng)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移加強(qiáng)脈管系統(tǒng)再生以及其他旁路信號(hào)激活［17-18］。因此，探索舒尼替尼耐藥的分子機(jī)制，尋找新的作用靶點(diǎn)是臨床研究重點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制是由于藥物介導(dǎo)的AKT、MAPK、STAT等信號(hào)通路被抑制［19］。PTEN低表達(dá)與舒尼替尼耐藥密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，KUCG1在舒尼替尼耐藥腎癌細(xì)胞中低表達(dá)。KUCG1表達(dá)下調(diào)，PTEN表達(dá)被抑制，AKT/mTOR信號(hào)通路被激活，ccRCCs舒尼替尼的耐藥性增強(qiáng)。AKT/mTOR是經(jīng)典生存信號(hào)通路，與細(xì)胞活力密切相關(guān)，而PTEN表達(dá)可抑制此通路。

KUCG1對(duì)臨近編碼基因MAGEA11可能通過Cis調(diào)控機(jī)制進(jìn)行調(diào)控，即KUCG1通過順式作用元件，包括增強(qiáng)編碼基因啟動(dòng)子、增強(qiáng)子活性、調(diào)控序列和可誘導(dǎo)元件等激活轉(zhuǎn)錄和調(diào)控基因表達(dá)［20］。KUCG1可能通過形成多個(gè)RNP復(fù)合物或編碼微肽參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。lncRNA還可增強(qiáng)RNA聚合酶Ⅱ活性，此外，lncRNA調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)，反過來抑制編碼基因和miRNA靶向結(jié)合［21］。lncRNA還可通過lncRNA-mRNA/miRNA相互作用調(diào)節(jié)腎細(xì)胞癌MAGEA11表達(dá)［22］。MAGEA11是腫瘤種系抗原，通過介導(dǎo)DNA低甲基化、血管形成和腫瘤轉(zhuǎn)移等多種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖生長(zhǎng)及對(duì)多種化療藥物耐藥，并在黑色素瘤、前列腺癌和食管癌等多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)［23-25］。且MAGEA11表達(dá)對(duì)于細(xì)胞自噬至關(guān)重要［26］。本研究發(fā)現(xiàn)KUCG1下調(diào)后兩種腎癌細(xì)胞株中MAGEA11表達(dá)明顯增加。為驗(yàn)證MAGEA11表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞特性的影響，直接利用siRNA敲減MAGEA11表達(dá)，MAGEA11表達(dá)下調(diào)后腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲受抑制，表明KUCG1表達(dá)下調(diào)通過促進(jìn)MAGEA11上調(diào)增強(qiáng)腎癌細(xì)胞活性，增強(qiáng)腎癌細(xì)胞耐藥性。

KUCG1通過磷酸化和促進(jìn)AKT信號(hào)傳導(dǎo)抑制細(xì)胞凋亡。KUCG1正向調(diào)節(jié)PTEN表達(dá)，反向調(diào)節(jié)p-AKT水平，而p-AKT和mTOR通過MAGEA11表達(dá)升高，因此，KUCG1通過調(diào)節(jié)MAGEA11表達(dá)影響PTEN/AKT/mTOR信號(hào)通路。而mTOR又可正向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D和E表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，促進(jìn)細(xì)胞增殖［27］。因此，KUCG1通過MAGEA11調(diào)節(jié)PTEN/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞耐藥性。

綜上，KUCG1通過促進(jìn)細(xì)胞周期、抑制凋亡和促進(jìn)AKT信號(hào)通路促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖和侵襲，本研究證明KUCG1下調(diào)可降低腎透明癌細(xì)胞對(duì)舒尼替尼藥物的敏感性，降低藥物治療效果。KUCG1通過MAGEA11上調(diào)影響PTEN/AKT/mTOR信號(hào)通路。本研究證實(shí)，KUCG1可降低晚期腎癌患者臨床治療效果，為尋找耐藥靶點(diǎn)提供了新的思路，將通過臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。