氯沙坦調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路對(duì)腎血管性高血壓大鼠左心室重構(gòu)的保護(hù)作用①

陳強(qiáng) 菅建國(guó) 張娟 陳麗珠

（內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，包頭 014010）

在過(guò)去十年中，全球死于心血管疾病的人數(shù)比以往增加了12.5%，現(xiàn)在因心血管疾病死亡的人數(shù)約占全球所有死亡人數(shù)的三分之一［1］。高血壓相關(guān)性左心室肥厚被認(rèn)為是不良心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，包括心律失常、心肌梗死、充血性心力衰竭、卒中和腎功能衰竭［2-3］。左心室肥厚不僅是后負(fù)荷增加引起的靶器官損害，也是最主要的心血管危險(xiǎn)因素。及時(shí)治療和改善左心室肥厚、心力衰竭、缺血性心臟病和房顫能有效提高生存率［4-5］。另外，左心室肥厚還與多種非血流動(dòng)力學(xué)因素有關(guān)，包括體重指數(shù)、年齡、腎素、醛固酮、血管緊張素、細(xì)胞內(nèi)鈣、心房利鈉肽、血液黏度、動(dòng)脈血管順應(yīng)性等［6-7］。目前研究顯示氯沙坦（losartan，LOS）有減少心室重構(gòu)和改善心室功能的作用，可以有效改善高血壓患者的炎癥因子，但是臨床療效及具體的作用機(jī)制仍存在爭(zhēng)議［8-9］。本研究通過(guò)觀察氯沙坦對(duì)腎血管性高血壓大鼠（RVH）心功能、心室重構(gòu)和心肌纖維化的影響，進(jìn)一步探討高血壓心臟病的病理機(jī)制，同時(shí)研究氯沙坦對(duì)高血壓大鼠心功能、心室重構(gòu)和炎癥因子的干預(yù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料SD大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，選取200~250 g、10~12周齡雄性SD大鼠。氯沙坦片（批號(hào)：20180902）購(gòu)自杭州默沙東制藥有限公司；小動(dòng)物彩色多普勒超聲診斷儀（富士2100）購(gòu)自山東帕頓國(guó)際貿(mào)易有限公司；Masson染色試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；中性樹(shù)膠購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大鼠CRP、TNF-α、IL-10 ELISA試劑盒購(gòu)自上海賽默科技生物發(fā)展有限公司；大鼠IL-1、IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司；兔抗TLR4（ab13556 1∶500）和兔抗NF-κB（ab131546 1∶500）抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PVDF膜和ECL化學(xué)發(fā)光劑均購(gòu)自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 腎血管性高血壓模型構(gòu)建將45只雄性SD大鼠隨機(jī)分為：空白對(duì)照組、模型對(duì)照組（RVH）和氯沙坦干預(yù)組（RVH+LOS），每組各15只。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，將大鼠俯臥固定，背部皮膚脫毛后用碘伏棉球消毒，在第三腰椎棘突水平沿背后正中線做1個(gè)3~4 cm的切口，切開(kāi)皮下組織和腰背筋膜，暴露左側(cè)腎動(dòng)脈。先鈍性分離左腎動(dòng)脈，將0.3 mm的“U”型鈦合金夾水平方向套在左腎動(dòng)脈上，待左腎顏色變?yōu)闇\紅色，取下鈦合金夾。同樣的方法在較左側(cè)開(kāi)口高1 cm處做右側(cè)切口，分離結(jié)扎方法相同，手術(shù)視野內(nèi)注入0.3 ml青霉素（8×104U/ml）。縫合消毒后肌內(nèi)注射青霉素4×104U/只，連續(xù)用藥5 d。Sham組僅游離左、右腎動(dòng)脈，不做結(jié)扎，其余操作均同模型組。每只大鼠用耳標(biāo)號(hào)標(biāo)記，術(shù)前1 d用無(wú)創(chuàng)尾部血壓計(jì)測(cè)量血壓作為大鼠的基礎(chǔ)血壓，術(shù)后4周測(cè)量血壓進(jìn)行評(píng)估。每只大鼠選3次血壓測(cè)量值計(jì)算平均血壓，3次測(cè)量值差距不能超過(guò)5 mmHg。大鼠收縮壓較術(shù)前升高22.6 mmHg（3 kPa）即為造模成功［10］。

1.2.2 干預(yù)方案參照文獻(xiàn)［11］，造模第2天進(jìn)行相關(guān)藥物干預(yù)，干預(yù)組分別進(jìn)行氯沙坦5、10、20 mg/kg灌胃給藥（1次/d），給藥治療4周，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃，最后1次給藥后禁食24 h，用多普勒超聲心動(dòng)儀評(píng)估心功能。

1.2.3 多普勒超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)大鼠心臟功能多普勒超聲心動(dòng)儀探頭型號(hào)MS250，檢測(cè)頻率為13~24 MHz。將大鼠麻醉，記錄大鼠左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）和左心室短軸縮短率（LVFS），辛普森法測(cè)定左室射血分?jǐn)?shù)LVEF。

1.2.4 心室/體質(zhì)量指數(shù)測(cè)定記錄大鼠體質(zhì)量后將大鼠處死，取出心臟。去除心外膜脂肪組織、大血管、心房和瓣膜等組織，用生理鹽水清洗干凈并用濾紙吸去多余水分。用電子天平稱取并記錄心臟重量（HW）、心室重量（VW）和左心室重量（LVW）。用心室重量除以大鼠體質(zhì)量計(jì)算心室/體質(zhì)量指數(shù)。

1.2.5 Masson染色觀察大鼠心肌膠原含量膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）心臟組織用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水處理后石蠟包埋，做4μm的連續(xù)切片，烤片后常規(guī)脫蠟至水。根據(jù)染色試劑盒說(shuō)明書(shū)，用Weigert鐵蘇木素染色5~10 min，酸性乙醇分化，再用Massson返藍(lán)液返藍(lán)，隨后用麗春紅品紅染色5 min，經(jīng)磷鉬酸分化后，用苯胺藍(lán)染色1~2 min。分別經(jīng)過(guò)80%乙醇、95%乙醇、2次無(wú)水乙醇30 s快速脫水，然后放在二甲苯中透明，取出切片在通風(fēng)櫥晾干后用中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察被染成藍(lán)色的是膠原纖維，心肌組織染成紅色，胞核染成黑藍(lán)色。照片用Image pro plus 6.0軟件進(jìn)行分析，心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）為膠原纖維染色面積占切片總面積的百分比。

1.2.6 ELISA測(cè)定血清炎癥因子用非抗凝注射器從腹主動(dòng)脈取血4 ml，4℃、2 000 r/min離心10 min后，血清保存在-80℃冰箱，標(biāo)本收集完全后，在室溫下解凍，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)通過(guò)ELISA法測(cè)定各組大鼠血漿中CRP、TNF-α、IL-6、IL-10的含量。

1.2.7 心肌組織TLR4及NF-κB的表達(dá)情況心肌組織在蛋白裂解液中研磨，冰上裂解20 min，4℃、12 000 r/min離心15 min。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白加入上樣緩沖液金屬浴100℃煮5 min使其變性。將蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，置于4℃恒溫冰箱分別孵育兔抗TLR4（1∶500）和兔抗NF-κB（1∶500）抗體過(guò)夜，第二天孵育HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，然后用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。結(jié)果用Image J軟件計(jì)算灰度值，β-actin為內(nèi)參，分析TLR4和NF-κB的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用Graphpad 7.0進(jìn)行繪圖，SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，One-way ANOVA進(jìn)行多組間比較，Western blot條帶灰度值用Image J軟件分析，數(shù)據(jù)使用單向方差分析（ANOVA）。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本情況實(shí)驗(yàn)過(guò)程中RVH組大鼠死亡1只，其余兩組無(wú)死亡。RVH組建模成功，造模后第4周收縮壓比造模前升高59.97 mmHg；Sham組造模后第4周收縮壓升高10.53 mmHg；RVH+LOS（5、10、20 mg/kg）組造模后第四周收縮壓分別升高42.63 mmHg、35.49 mmHg和22.92 mmHg。低濃度LOS（5、10 mg/kg）對(duì)腎血管性高血壓大鼠的作用低于高濃度LOS（20 mg/kg），因此，后續(xù)研究LOS對(duì)腎血管性高血壓大鼠左心室重構(gòu)的影響采用20 mg/kg LOS干預(yù)組（表1）。

表1 各組大鼠手術(shù)前后收縮壓比較（±s，mmH）Tab.1 Comparison of systolic blood pressure before and after operation in each group（±s，mmH）

表1 各組大鼠手術(shù)前后收縮壓比較（±s，mmH）Tab.1 Comparison of systolic blood pressure before and after operation in each group（±s，mmH）

Groups Blank control group（Sham）Model control group（RVH）Intervention group（LOS 5 mg/kg）Intervention group（LOS 10 mg/kg）Intervention group（LOS 20 mg/kg）1 d before operation 113.94±6.74 116.38±4.70 109.42±6.92 115.76±3.29 108.46±7.23 4 weeks after operation 124.47±7.28 176.35±7.32 152.05±7.14 151.25±5.16 131.38±6.19 Mean value of difference（postoperative-preoperative）10.53 59.97 42.63 35.49 22.92

2.2 3組大鼠心臟功能和心室重構(gòu)指標(biāo)彩色多普勒超聲儀檢測(cè)心功能指標(biāo)。結(jié)果顯示，與Sham組相比，RVH組LVESD和LVEDD水平均顯著升高（P<0.05），LVFS、LVEF水平均顯著降低（P<0.05）。氯沙坦治療后與RVH組相比，氯沙坦干預(yù)組LVESD和LVEDD水平明顯下降（P<0.05），LVFS、LVEF水平明顯升高（P<0.05），見(jiàn)表2。與Sham組相比，RVH組心臟重量（HW）、心室重量（VW）、左心室重量（LVW）、左心室/體質(zhì)量指數(shù)均顯著增加（P<0.05），而氯沙坦干預(yù)后上述指標(biāo)明顯降低（P<0.05），見(jiàn)表3。

表2 氯沙坦對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心功能的影響（±s，n=15）Tab.2 Effect of losartan on cardiac function in spontaneously hypertensive rats（±s，n=15）

表2 氯沙坦對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心功能的影響（±s，n=15）Tab.2 Effect of losartan on cardiac function in spontaneously hypertensive rats（±s，n=15）

Note：Compared with Sham group，1）P<0.05；compared with RVH group，2）P<0.05.

Groups Blank control group（Sham）Model control group（RVH）Intervention group（RVH+LOS）LVESD/mm 58.12±1.53 72.24±0.881）64.54±0.612）LVEDD/mm 30.22±1.02 53.36±0.741）44.18±0.822）LVFS/%46.22±1.10 22.48±0.751）35.64±0.982）EF/%76.98±0.92 43.71±0.751）54.32±0.942）

表3 3組大鼠心室重構(gòu)指標(biāo)（±s，n=15）Tab.3 Ventricular remodeling index in three groups of rats（±s，n=15）

表3 3組大鼠心室重構(gòu)指標(biāo)（±s，n=15）Tab.3 Ventricular remodeling index in three groups of rats（±s，n=15）

Note：Compared with Sham group，1）P<0.05；compared with RVH group，2）P<0.05.

Groups Blank control group（Sham）Model control group（RVH）Intervention group（RVH+LOS）BW/g 242.31±3.32 238.20±3.54 240.52±4.53 HW/mg 242.32±3.32 1 053.05±14.991）994.53±8.732）VW/mg 441.21±4.89 503.83±11.851）467.04±6.892）LVW/mg 237.23±3.05 293.06±9.261）60.72±4.592）LVW/BW/（mg·g-1）0.98±0.02 1.24±0.131）1.09±0.042）

2.3 3組大鼠心肌膠原含量Masson染色結(jié)果用Image pro plus 6.0軟件計(jì)算膠原纖維染色面積占切片總面積的百分比（心肌膠原容積分?jǐn)?shù)，CVF）。結(jié)果顯示，與Sham組CVF（5.46±0.68）相比，RVH組心肌膠原纖維明顯增多，CVF（14.66±0.45）明顯升高（P<0.01）。與RVH組相比，干預(yù)組心肌膠原纖維明顯減少，CVF（8.18±0.52）明顯降低（P<0.01），見(jiàn)圖1。

圖1 3組大鼠心肌組織的膠原容積分?jǐn)?shù)Fig.1 Collagen volume fraction of myocardial tissue in three groups of rats

2.4 3組大鼠血液炎癥因子水平ELISA檢測(cè)3組大鼠血漿中CRP、IL-6、TNF-α、IL-10的含量。結(jié)果如圖2所示，與Sham組相比，RVH組血漿中CRP、IL-6、TNF-α的含量顯著上升（P<0.05），IL-10含量明顯降低（P<0.05）。與RVH組相比，RVH+LOS組血 漿中CRP、IL-6、TNF-α的 含量明 顯降低（P<0.05），IL-10含量明顯升高（P<0.05）。

圖2 3組大鼠血漿中CRP、IL-6、TNF-α、IL-10的含量Fig.2 Levels of CRP，IL-6，TNF-α and IL-10 in plasma of three groups of rats

2.5 3組大鼠心肌組織TLR4及NF-κB的表達(dá)情況Western blot檢測(cè)大鼠心肌組織中TLR4和NFκB的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與Sham組相比，RVH組TLR4表達(dá)明顯增加，NF-κB表達(dá)也明顯增加。而與RVH組相比，RVH+LOS組TLR4和NF-κB表達(dá)均下降（圖3）。

圖3 3組大鼠心肌組織中TLR4/NF-κB通路的激活Fig.3 Activation of TLR4/NF-κB pathway in myocardial tissue of three groups of rats

3 討論

高血壓可引起多種心臟有關(guān)的疾病，包括高血壓心臟病和阻塞性冠心病。高血壓性心臟病的定義是高血壓患者出現(xiàn)左室肥厚或左室收縮期和舒張期功能障礙及其臨床表現(xiàn)，如心律失常和有癥狀的心力衰竭［12］。在因全身高血壓而導(dǎo)致的壓力超負(fù)荷條件下，左室廣泛增長(zhǎng)，導(dǎo)致左室肥厚，以維持心輸出量。心肌肥厚表現(xiàn)為纖維化、冠脈循環(huán)改變和心肌細(xì)胞凋亡，可導(dǎo)致心衰、心肌缺血和心律失常［13］。本研究用“兩腎兩夾”的方法構(gòu)建大鼠腎血管性高血壓模型，誘導(dǎo)大鼠心室重構(gòu)。彩色多普勒超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示，腎血管性高血壓大鼠左室收縮末期直徑和左室舒張末期直徑都明顯增加，左室短軸縮短率和射血分?jǐn)?shù)明顯降低。高血壓模型組大鼠心臟重量、心室和左心室重量較對(duì)照組都有所增加，左心室和體重指數(shù)明顯升高。結(jié)果表明腎血管性高血壓模型大鼠心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生改變并影響心臟功能。

慢性和持續(xù)性炎癥通路的激活在高血壓心臟病引起的心室重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。炎癥細(xì)胞因子可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大、心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化等心室重構(gòu)的表型［14］。心肌纖維化是指心肌間質(zhì)中膠原纖維過(guò)度堆積，不同分型膠原比例失調(diào)，膠原纖維排列紊亂［15］。心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）是Masson染色后評(píng)價(jià)心肌間質(zhì)纖維化程度的指標(biāo)，高血壓模型組大鼠CVF比對(duì)照組明顯增加。研究表明，左室肥厚的高血壓患者同單純高血壓患者相比CRP和TNF-α水平升高。TNF-α是炎癥細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)心肌肥厚和心肌細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)TNF-α的小鼠隨年齡增長(zhǎng)，心肌細(xì)胞肥大同時(shí)心肌間質(zhì)纖維化加重［16］。相反，基因敲除TNF-α的小鼠主動(dòng)脈縮窄術(shù)后心肌細(xì)胞肥大減輕和心肌膠原纖維沉積減輕并伴有心肌凋亡細(xì)胞減少［17］。IL-6可以降低心肌收縮功能和誘導(dǎo)細(xì)胞肥大、膠原沉積和纖維化的發(fā)展，體外實(shí)驗(yàn)中IL-6可直接引起心肌成纖維細(xì)胞膠原合成的增加。在心肌纖維化過(guò)程中，IL-6作為促炎細(xì)胞因子可以促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生［18］。單核細(xì)胞分泌的IL-10作為細(xì)胞因子合成抑制因子，抑制心肌纖維化的發(fā)展［19］。本研究與文獻(xiàn)報(bào)道一致，高血壓模型組大鼠血漿中炎癥因子CRP、TNF-α和IL-6水平明顯升高，抑炎因子IL-10水平明顯降低。結(jié)果提示，炎癥反應(yīng)促進(jìn)了心室重構(gòu)的發(fā)展。

促炎因子IL-6和抑炎因子IL-10受核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的調(diào)控［20］，因此推測(cè)腎血管性高血壓導(dǎo)致的心室重構(gòu)的發(fā)生可能與NF-κB通路有關(guān)。Toll樣受體（TLRs）是存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的細(xì)胞跨膜蛋白受體，通過(guò)識(shí)別相應(yīng)的高度保守的病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），在抵御外來(lái)微生物入侵的先天性免疫應(yīng)答和觸發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，并且通過(guò)TLRs信號(hào)通路來(lái)介導(dǎo)腫瘤的免疫治療［21-22］。其中TLR4是TLR家族中的最重要一員，TLR4與配體結(jié)合后可以激活一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中包括絲裂原激活的蛋白激酶家族和NF-κB通路，進(jìn)而上調(diào)一系列的炎癥因子，激活炎癥反應(yīng)［23］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高血壓模型組心肌組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)均升高，提示TLR4/NF-κB信號(hào)通路被激活。

氯沙坦是一種具有抗高血壓活性的血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑。它被用于高血壓和心臟衰竭的管理［24-25］。目前的研究顯示氯沙坦有減少心室重構(gòu)和改善心室功能的作用，但是臨床療效及具體的作用機(jī)制目仍存在爭(zhēng)議［26］。本研究觀察了氯沙坦對(duì)腎血管性高血壓大鼠（RVH）心室重構(gòu)的影響，結(jié)果顯示，氯沙坦干預(yù)組腎血管性高血壓大鼠心功能得到了明顯改善，心臟結(jié)構(gòu)變化程度和心肌纖維化程度也有所減輕；大鼠血漿中炎癥因子CRP、TNF-α和IL-6水平降低，抑炎因子IL-10水平升高；TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)明顯低于高血壓模型組。上述結(jié)果表明，氯沙坦可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路減輕高血壓大鼠的炎癥水平，從而改善左心室重構(gòu)。但是，仍需要進(jìn)一步證實(shí)TLR4/NF-κB通路抑制劑能否阻斷氯沙坦對(duì)腎血管性高血壓大鼠左心室重構(gòu)的保護(hù)作用。

綜上所述，氯沙坦調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路對(duì)腎血管性高血壓大鼠左心室重構(gòu)具有保護(hù)作用，拓寬了臨床對(duì)高血壓左心室重構(gòu)作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，對(duì)防治高血壓左心室重構(gòu)具有重要的理論和實(shí)際意義。