TIGIT分子在HBV免疫治療中的作用探究①

盧楊 孫汭 田志剛 陳永艷（中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)免疫學(xué)研究所，合肥 230027）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球性公共衛(wèi)生問題，世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示2019年全球共有2.96億慢性HBV感染者，由慢性HBV感染引起的肝硬化與肝細(xì)胞癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)約82萬［1］。中國目前約有8 600萬HBV感染者，其中約3 000萬為慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB），乙肝成為威脅人群公共健康的重要問題［2-3］。HBV誘導(dǎo)的免疫耐受是HBV感染慢性化的重要原因，多種機制參與了HBV免疫耐受形成過程，其中免疫抑制性受體介導(dǎo)的抑制信號發(fā)揮了重要作用［4］。

T細(xì)胞免疫球蛋白與ITIM結(jié)構(gòu)域（T cell immu?noglobulin and immune receptor tyrosine-based inhibi?tory motif domain，TIGIT）分子是近些年新發(fā)現(xiàn)的免疫抑制性受體之一，表達(dá)于T細(xì)胞和NK細(xì)胞上，與其配體CD155或CD112結(jié)合后可以直接抑制CD8+T細(xì)胞或NK細(xì)胞的功能［5］。在人類腫瘤患者和小鼠腫瘤模型中，NK細(xì)胞和T細(xì)胞顯著上調(diào)表達(dá)TIGIT分子，表現(xiàn)為功能耗竭，其抗腫瘤能力顯著下降［6-7］。利用單克隆抗體阻斷TIGIT信號可以有效恢復(fù)NK細(xì)胞和T細(xì)胞的效應(yīng)功能，因此靶向TIGIT分子已成為腫瘤免疫治療的研 究 熱點［5，8］。除 此之外，TIGIT分子在HCV、HIV等慢性病毒感染患者的T細(xì)胞上高表達(dá)，導(dǎo)致抗病毒T細(xì)胞功能障礙進而無法有效清除病毒，抗體阻斷TIGIT可以部分恢復(fù)抗病毒T細(xì)胞的功能，這為靶向TIGIT治療慢性感染提供了依據(jù)［9-12］。

本實驗室已有的研究證實HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠的CD8+T細(xì)胞上TIGIT分子的表達(dá)水平顯著高于野生型小鼠，TIGIT分子參與了機體對HBV適應(yīng)性免疫耐受的維持［13］。但是，目前對于阻斷TIGIT分子是否影響機體抗HBV的免疫應(yīng)答尚無相關(guān)報道。本研究利用高壓注射pAAV-HBV1.2質(zhì)粒獲得HBV攜帶小鼠，發(fā)現(xiàn)HBV攜帶小鼠其NK細(xì)胞和T細(xì)胞顯著上調(diào)表達(dá)TIGIT分子，證實抗體阻斷TIGIT信號或TIGIT基因缺陷均可加快機體對HBV的免疫排斥，為靶向TIGIT分子進行HBV免疫治療提供了重要的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物4周齡SPF級野生型（WT）C57/BL6雄性小鼠和6周齡的雌性裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司；TIGIT轉(zhuǎn)基因（TIGIT-Tg）小鼠由中國科學(xué)院生物物理所范祖森教授贈送；TIGIT分子缺陷（TIGIT-KO）小鼠由Bristol-Myers Squibb公司提供。所有小鼠均飼養(yǎng)在中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)和繁育過程嚴(yán)格按照SPF級小鼠的飼養(yǎng)要求和條件進行，實驗操作過程遵守中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)實驗動物管理條例。

1.1.2 實驗試劑及儀器APC-CY7-CD45、BV605-NK1.1、FITC-CD11a、BV421-TNF-α、PE-IL-2、Percp-CY5.5-IFN-γ（Biolegend）；PE-CY7-TIGIT、BV660-TIGIT（eBioscience）；BUV395-CD3、BUV563-CD4、BUV737-CD8α（BD公司）；Percoll（GE Health）；血細(xì)胞分析用紅細(xì)胞裂解液（北京同生時代生物技術(shù)有限公司）；HBsAg放射免疫法試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所）；質(zhì)粒抽提試劑盒NucleoBond Xtra Midi EF kit（MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG）；pAAV-HBV1.2質(zhì)粒（臺灣大學(xué)陳培哲教授贈送）；pAAV-null對照質(zhì)粒（本實驗室構(gòu)建）；13G6抗體（TIGIT阻斷性單克隆抗體，由本實驗室制備純化）；大鼠血清（巨石生物科技有限公司）；PMA、莫能霉素（Merck）；離子霉素（Sigma）；胞內(nèi)細(xì)胞因子染色用固定液與穿膜液（Invitrogen）；胎牛血清（Gibco）；γ-射線計數(shù)儀（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）。

1.2方法

1.2.1 HBV攜帶小鼠模型構(gòu)建將6μg無內(nèi)毒素的pAAV-HBV1.2質(zhì) ?；騪AAV-null質(zhì)粒用PBS稀釋至1.8 ml，通過尾靜脈高壓注射（HDI），即在4~8 s內(nèi)將其注射至5周齡雄性小鼠體內(nèi)。

1.2.2 HBV攜帶小鼠的anti-TIGIT抗體干預(yù)在小鼠尾靜脈高壓注射質(zhì)粒后2 d開始腹腔注射13G6抗體或者對照IgG，1次/周，每次200μg/只小鼠。

1.2.3 放射免疫法檢測小鼠血清HBV表面抗原濃度用生理鹽水稀釋待測血清樣品至200μl。將200μl待測樣品和200μl標(biāo)準(zhǔn)品加入對應(yīng)的HBsAg包被管中，45℃恒溫水浴鍋振蕩孵育2 h。孵育結(jié)束后取出包被管，吸去樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，用純水洗滌包被管3次。洗滌后吸盡管中液體，加入200μl125I標(biāo)記的anti-HBs，室溫孵育過夜。孵育結(jié)束后取出包被管，吸去標(biāo)記液，用純水洗滌包被管3次。洗滌后吸盡管中液體，用γ-射線計數(shù)儀檢測CPM值。

1.2.4 小鼠肝臟單個核細(xì)胞分離放血后脫臼犧牲小鼠，取出肝臟浸泡于預(yù)冷的PBS中。將肝臟置于覆有200目篩網(wǎng)的10 cm培養(yǎng)皿上，加入PBS后研磨肝臟并將研磨液轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中。4℃、50 g離心1 min后棄去沉淀，將上清轉(zhuǎn)移至另一50 ml離心管中，4℃、250 g離心10 min，棄上清。使用4 ml 40%percoll溶液重懸細(xì)胞，輕輕加至含3 ml 70%percoll溶液的15 ml離心管中，常溫750 g離心30 min，離心機轉(zhuǎn)速快升慢降。吸取白膜層細(xì)胞加入至PBS中充分混勻，4℃、400 g離心10 min，棄上清，加入PBS重懸細(xì)胞并計數(shù)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分子吸取1×106個肝臟單個核細(xì)胞于1.5 ml EP管中，加PBS至80μl。加入10μl大鼠血清封閉細(xì)胞表面Fc受體，4℃封閉30 min。加入10 μl稀釋后流式熒光抗體混合液，4℃避光標(biāo)記30 min?？贵w孵育結(jié)束后，向EP管中加入1 ml PBS洗滌1次，4℃、500 g離心5 min，棄上清，沉淀用200μl PBS重懸，過200目濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移至流式管中，上機檢測。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子用含有50 ng/ml PMA、1 μg/ml離子霉素和10 μg/ml莫能霉素的1640完全培養(yǎng)基（含有10%FBS）重懸單個核細(xì)胞，調(diào)整濃度至1×106個/ml，吸取1 ml至24孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后離心收集細(xì)胞于1.5 ml EP管中。同1.2.4進行細(xì)胞表面分子標(biāo)記，在PBS洗滌后加入100 μl固定液重懸細(xì)胞，4℃避光條件下固定30 min。固定結(jié)束后加入1 ml穿膜液洗滌1次，500 g離心5 min，棄上清，用80μl穿膜液重懸細(xì)胞并加入10 μl大鼠血清，4℃避光封閉30 min后加入10μl稀釋后的流式熒光抗體混合液，4℃避光標(biāo)記1 h?？贵w孵育結(jié)束后，向EP管中加入1 ml PBS洗滌1次，4℃、500 g離心5 min，棄上清，沉淀用200 μl PBS重懸，過200目濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移至流式管中，上機檢測。

1.2.7 外周血單個核細(xì)胞分離與流式檢測向100μl抗凝血液中加入1 ml紅細(xì)胞裂解液，常溫裂解10 min。300 g離心10 min后棄上清，加入1 ml PBS重懸細(xì)胞洗滌1次，300 g離心10 min后棄去上清，80μl PBS重懸細(xì)胞。同1.2.5中步驟對得到的單個核細(xì)胞進行抗體標(biāo)記，上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理使用GraphPad prism 8.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，血清HBsAg濃度變化曲線比較采用Two-way ANOVA檢驗，血清HBsAg陽性率變化曲線采用Log-Rank檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV攜帶小鼠NK細(xì)胞和T細(xì)胞上調(diào)表達(dá)TIGIT分 子通 過HDI給 予5周齡WT小鼠6 μg pAAV-HBV1.2質(zhì)?；蛘遬AAV-null對照質(zhì)粒。在HDI后1~5周每周檢測小鼠血清HBsAg濃度，同時檢測其外周血NK細(xì)胞和T細(xì)胞上TIGIT分子的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，HDI pAAV-HBV1.2質(zhì)粒的小鼠血清HBsAg水平在各時間點均顯著增高（圖1A），說明HDI質(zhì)粒的方式可建立HBV攜帶小鼠模型。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示HDI pAAV-HBV1.2質(zhì)粒的小鼠其外周血NK細(xì)胞和T細(xì)胞上TIGIT分子陽性率均顯著高于pAAV-null對照組（圖1B、C），提示HBV攜帶可上調(diào)NK細(xì)胞和T細(xì)胞表面TIGIT分子的表達(dá)水平。

圖1 HDI pAAV-HBV1.2質(zhì)粒促進小鼠外周血NK細(xì)胞和T細(xì)胞上調(diào)表達(dá)TIGIT分子Fig.1 HDI of pAAV-HBV1.2 plasmid up-regulates expression levels of TIGIT on peripheral NK cells and T cells

2.2 抗體阻斷TIGIT分子顯著降低HBV攜帶小鼠血清HBsAg水平進一步利用抗體阻斷技術(shù)探究TIGIT分子在體內(nèi)抗HBV免疫應(yīng)答中發(fā)揮的作用。首先利用TIGIT-Tg小鼠腹腔注射13G6抗體后72 h采集小鼠外周血，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測其NK細(xì)胞和T細(xì)胞上TIGIT分子陽性率，結(jié)果顯示注射13G6抗體后小鼠NK細(xì)胞和T細(xì)胞上TIGIT分子可被有效阻斷（圖2A、B）；且外周血中單個核細(xì)胞數(shù)量以及各細(xì)胞亞群比例無明顯變化（圖2C），證實13G6是TIGIT分子阻斷性單克隆抗體。

圖2 13G6抗體可有效阻斷NK細(xì)胞和T細(xì)胞表面TIGIT分子Fig.2 13G6 mAb effectively blocks TIGIT on surface of NK cells and T cells

在小鼠HDI pAAV-HBV1.2質(zhì)粒2 d后給予13G6抗體或?qū)φ誌gG抗體干預(yù)。實驗結(jié)果顯示，給予13G6抗體干預(yù)后小鼠血清HBsAg濃度顯著低于對照組小鼠（圖3A），且血清HBsAg發(fā)生轉(zhuǎn)陰的時間點提前，轉(zhuǎn)陰率升高（圖3B）。上述結(jié)果表明抗體阻斷TIGIT分子可促進機體排斥HBV。

圖3 13G6抗體阻斷TIGIT顯著降低HDI pAAV-HBV1.2質(zhì)粒小鼠血清HBsAg水平Fig.3 Blocking TIGIT by 13G6 mAb significantly reduces serum levels of HBsAg in pAAV-HBV1.2 plasmid HDI mice

2.3 抗體阻斷TIGIT分子增強小鼠肝臟NK細(xì)胞和T細(xì)胞抗HBV免疫應(yīng)答為進一步闡明抗體阻斷TIGIT分子促進機體排斥HBV的內(nèi)在機制，小鼠經(jīng)13G6抗體干預(yù)23周后分離其肝臟單個核細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)分析其NK細(xì)胞和T細(xì)胞的表型與效應(yīng)功能。結(jié)果顯示，相比于IgG對照組小鼠，13G6抗體干預(yù)的小鼠肝臟中浸潤了更多的NK細(xì)胞、CD4+T及CD8+T細(xì)胞，并且經(jīng)歷TCR信號刺激的抗原特異性CD8αloCD11ahiT細(xì)胞的數(shù)量亦顯著增加（圖4A）；肝臟內(nèi)浸潤的NK細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子的能力顯著增強（圖4B）。

圖4 13G6抗體阻斷TIGIT分子后小鼠肝臟NK細(xì)胞和T細(xì)胞數(shù)量增加且分泌細(xì)胞因子功能增強Fig.4 Blocking TIGIT by 13G6 mAb increases number of intrahepatic NK cells and T cells and enhances their cytokine production

2.4 TIGIT分子缺失促進小鼠對HBV質(zhì)粒的免疫排斥進一步利用TIGIT-KO小鼠驗證TIGIT分子在機體抗HBV免疫應(yīng)答中的作用。給予TIGIT-KO小鼠以及WT小鼠HDI pAAV-HBV1.2質(zhì)粒并在HDI后不同時間點檢測小鼠血清HBsAg濃度。實驗結(jié)果顯示，相比于WT小鼠，TIGIT-KO小鼠血清HBsAg濃度顯著降低（圖5），證實TIGIT分子的缺失增強機體排斥HBV的能力，導(dǎo)致血清HBsAg濃度降低。

圖5 TIGIT-KO小鼠HDI pAAV-HBV1.2質(zhì)粒后血清HBsAg水平顯著低于WT小鼠Fig.5 Serum levels of HBsAg in TIGIT-KO mice after HDI of pAAV-HBV1.2 plasmid was significantly lower than that of WT mice

3 討論

目前臨床上常用核苷酸類似物（NA）以及IFN-α對CHB患者進行抗病毒治療，但是抗病毒治療僅能抑制病毒的復(fù)制、降低血清中HBV標(biāo)志物水平，抗病毒免疫細(xì)胞功能并未完全恢復(fù)，停藥后仍會發(fā)生病毒學(xué)復(fù)發(fā)［14-16］。因此，建立一種新的能夠恢復(fù)機體抗HBV免疫應(yīng)答能力的治療方法至關(guān)重要。靶向免疫檢查點的療法能夠阻斷T細(xì)胞和NK細(xì)胞上的抑制性信號從而恢復(fù)其免疫監(jiān)視功能，為治療CHB提供了一個新的選擇。已有研究發(fā)現(xiàn)HBV特異性T細(xì)胞顯著上調(diào)表達(dá)包括TIGIT分子在內(nèi)的多種免疫抑制性受體［17-18］，這為開發(fā)靶向TIGIT分子的免疫療法奠定了基礎(chǔ)。

目前靶向免疫檢查點治療CHB的研究顯示，體外實驗中阻斷PD-1、CTLA-4、TIM-3和2B4可以恢復(fù)HBV特異性T細(xì)胞的功能，并且相比于其他受體，在體外試驗中阻斷PD-1的響應(yīng)率最高［19］。一項Ⅰb期臨床試驗結(jié)果顯示使用anti-PD-1抗體治療HBeAg陰性的CHB患者，其副作用可控并且可以有效降低患者血清HBsAg水平［20］。本實驗室先前的研究證實阻斷NK細(xì)胞上的抑制性受體NKG2A也能夠促進HBV小鼠模型中NK細(xì)胞和HBV患者外周血NK細(xì)胞的抗HBV功能，進而降低血清HBsAg滴度［21］。本研究發(fā)現(xiàn)HBV能夠使小鼠NK細(xì)胞和T細(xì)胞上的TIGIT分子表達(dá)水平顯著上調(diào)，使用抗體阻斷TIGIT信號后能夠同時增強T細(xì)胞和NK細(xì)胞的效應(yīng)功能，顯著降低血清HBsAg水平，促進機體排斥HBV。盡管已有研究證實靶向免疫檢查點對HBV免疫治療具有一定的效果，但是尚不足以實現(xiàn)機體完全清除HBV病毒。免疫檢查點聯(lián)合阻斷或免疫檢查點阻斷與其他藥物的聯(lián)合使用值得進一步探究，以期獲得更好的免疫治療效果。