蔓荊子黃素通過上調(diào)miR-1193表達(dá)調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡①

鄧明 鄧芳 陳志堅(jiān)

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405）

盡管胃癌的治療取得了重大進(jìn)展，但其仍是全球最致命的癌癥之一。胃癌是一種局部性疾病，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血源性轉(zhuǎn)移是其易位的重要途徑［1-2］?；熓欠乐刮赴┘?xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要手段，然而由于嚴(yán)重的毒副作用、不良反應(yīng)及耐藥性，胃癌患者生活質(zhì)量較差、復(fù)發(fā)率高、五年存活率較低。近年來，從天然產(chǎn)物中尋找有效、安全的抗腫瘤藥物已成為研究的熱點(diǎn)。蔓荊子黃素（vitexicarpin）是從馬鞭草科植物單葉蔓荊果實(shí)中提取的一種多甲氧基黃酮，是蔓荊子的主要活性成分，一直被用于抗炎和癌癥治療［3］?，F(xiàn)有研究表明，蔓荊子黃素通過抑制增殖、誘導(dǎo)周期阻滯和凋亡、抑制侵襲轉(zhuǎn)移在乳腺癌、結(jié)腸癌、食管癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮廣泛的抗癌藥理活性［4-6］。然而，蔓荊子黃素在胃癌中的作用和潛在分子機(jī)制并未完全闡明。微小RNA（miR）-1193是近年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，乳腺癌中miR-1193表達(dá)降低，上調(diào)miR-1193表達(dá)能夠降低癌細(xì)胞的增殖和遷移能力［7］。然而，miR-1193在胃癌中是否具有抑癌作用、蔓荊子黃素如何調(diào)控miR-1193發(fā)揮作用尚不明確。本研究通過探討蔓荊子黃素對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及miR-1193表達(dá)的影響，分析其可能的作用機(jī)制，以期為蔓荊子黃素用于防治胃癌提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料胃癌細(xì)胞AGS購自美國模式培養(yǎng)物保藏所；胎牛血清、青鏈霉素雙抗、RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；蔓荊子黃素（純度≥98%，批號(hào)：20190215）購自四川維克奇生物科技有限公司；miR-1193模擬物（miR-1193 mimics）、模擬物陰性對(duì)照（miR-NC）、miR-1193抑制物（anti-miR-1193）、抑制物陰性對(duì)照（anti-miR-NC）、PCR引物由廣州銳博生物公司提供；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海貝博生物公司；miRNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、通用PCR Master Mix購自北京天根生化科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）、細(xì)胞周期素D1（CyclinD1）兔單克隆抗體（批號(hào)：20190411）、p21兔單克隆抗體（批號(hào)：20190302）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）兔單克隆抗體（批號(hào)：20190111）、Bcl相關(guān)X蛋白（Bax）兔多克隆抗體（批號(hào)：20190408）、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）兔多克隆抗體（批號(hào)：20190322）、羊抗兔IgG二抗（批號(hào)：20190228）購自上海碧云天生物科技研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組AGS細(xì)胞采用補(bǔ)充10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、濕度97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞70%融合時(shí)，胰酶消化，按照1∶3比例傳代，2 d換液1次。收集第3代對(duì)數(shù)期AGS細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。蔓荊子黃素用二甲基亞砜溶解，初始濃度為1.0×104μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆茫瑢?shí)驗(yàn)時(shí)稀釋至所需濃度。用終濃度分別為10、20、40 μmol/L的蔓荊子黃素培養(yǎng)液孵育AGS細(xì)胞48 h，分別命名為蔓荊子黃素-低組、蔓荊子黃素-中組和蔓荊子黃素-高組。對(duì)照組用含同等濃度的二甲基亞砜孵育48 h。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-NC、miR-1193 mimics分別轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞，分別命名為miR-NC組、miR-1193組。將anti-miR-NC、anti-miR-1193分 別轉(zhuǎn) 染 至AGS細(xì)胞，用終濃度為40 μmol/L的蔓荊子黃素培養(yǎng)液轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h，分別命名為蔓荊子黃素+anti-miR-NC組、蔓荊子黃素+anti-miR-1193組。

1.2.2 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力將未轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞接種于96孔板，貼壁后用含10、20、40 μmol/L蔓荊子黃素的培養(yǎng)液（100 μl/孔）培養(yǎng)箱孵育48 h［8］；將轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-1193 mimics的AGS細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)48 h。將轉(zhuǎn)染anti-miR-NC或antimiR-1193的AGS細(xì)胞接于種96孔板，貼壁后用含40 μmol/L蔓荊子黃素的培養(yǎng)液（100 μl/孔）培養(yǎng)箱孵育48 h，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。每孔加入10 μl的CCK-8溶液，再培養(yǎng)2 h。酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光度（A）值。增殖抑制率（%）=（1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組）×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集各組AGS細(xì)胞，PBS洗滌1次。1 500 r/min離心5 min。將細(xì)胞重懸于500 μl 1×結(jié)合緩沖液中，加入5 μl Annexin VFITC和PI在室溫孵育30 min。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞總凋亡率。

1.2.4 Western blot檢測(cè)CyclinD1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)放射緩沖液冰上裂解細(xì)胞，收集上清即為細(xì)胞蛋白。測(cè)定蛋白濃度后，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。5%脫脂牛奶室溫封閉膜30 min，加入針對(duì)CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax和GAPDH的特異性一抗4℃孵育過夜。室溫下將膜與二抗孵育1 h。化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)條帶信號(hào)，Image J軟件通過檢測(cè)各條帶光密度值分析目的蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)miR-1193表達(dá)試劑盒提取miRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，采用通用PCR Master Mix和相應(yīng)引物進(jìn)行RT-qPCR，2-ΔΔCt法分 析miR-1193表 達(dá)水 平。miR-1193 F：5'-GCCGAGGCACTTCATTTA-3'，R：5'-CTCAACTGGT?GTCGTGGA-3'；U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間差異；采用單因素方差法比較多組間差異，進(jìn)一步組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蔓荊子黃素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖的影響與對(duì)照組相比，蔓荊子黃素-低、中、高組AGS細(xì)胞增殖抑制率、p21蛋白表達(dá)顯著升高，CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）。蔓荊子黃素-低、中、高3組間以上指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1、表1。

表1 蔓荊子黃素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖的影響（xˉ±s，n=9）Tab.1 Effect of vitexicarpin on proliferation of gastric cancer AGS cells（xˉ±s，n=9）

圖1 增殖相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.1 Expressions of proliferation-related proteins

2.2 蔓荊子黃素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組相比，蔓荊子黃素-低、中、高組AGS細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）。蔓荊子黃素-低、中、高3組間以上指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2、表2。

表2 蔓荊子黃素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（xˉ±s，n=9）Tab.2 Effect of vitexicarpin on apoptosis and apoptosis related protein expressions of gastric cancer AGS cells（xˉ±s，n=9）

圖2 蔓荊子黃素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of vitexicarpin on apoptosis of gastric cancer AGS cells

2.3 蔓荊子黃素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞中miR-1193表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，蔓荊子黃素-低、中、高組AGS細(xì)胞miR-1193表達(dá)顯著升高（P<0.05）。蔓荊子黃素-低、中、高3組間miR-1193表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 蔓荊子黃素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞中miR-1193表達(dá)的影響（±s）Tab.3 Effect of vitexicarpin on expression of miR-1193 in gastric cancer AGS cells（±s）

表3 蔓荊子黃素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞中miR-1193表達(dá)的影響（±s）Tab.3 Effect of vitexicarpin on expression of miR-1193 in gastric cancer AGS cells（±s）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with Vitexi?carpin-L group，2）P<0.05；compared with Vitexicarpin-M group，3）P<0.05.

Groups Control Vitexicarpin-L Vitexicarpin-M Vitexicarpin-H F P n9 9 9 9 miR-1193 1.00±0.08 1.75±0.161）2.56±0.221）2）3.24±0.281）2）3）214.464<0.01

2.4 上調(diào)miR-1193對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖和凋亡的影響與miR-NC組相比，miR-1193組AGS細(xì) 胞miR-1193表達(dá)、增殖抑制率、凋亡率、Bax和p21蛋白表達(dá)顯著升高，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）。見圖3、表4。

表4 miR-1193過表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖和凋亡的影響（xˉ±s，n=9）Tab.4 Effect of miR-1193 overexpression on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cells（xˉ±s，n=9）

圖3 上調(diào)miR-1193對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.3 Effect of miR-1193 up-regulation on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cells

2.5 下調(diào)miR-1193逆轉(zhuǎn)了蔓荊子黃素（40 μmol/L）對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖和凋亡的作用與蔓荊子黃素+anti-miR-NC組相比，蔓荊子黃素+anti-miR-1193組AGS細(xì) 胞miR-1193組AGS細(xì)胞miR-1193表達(dá)、細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、Bax和p21蛋白表達(dá)顯著降低，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05）。見表5、圖4。

表5 下調(diào)miR-1193逆轉(zhuǎn)了蔓荊子黃素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖和凋亡的作用（±s，n=9）Tab.5 Down-regulation of miR-1193 reversed the effect of vitexicarpin on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cells（±s，n=9）

表5 下調(diào)miR-1193逆轉(zhuǎn)了蔓荊子黃素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖和凋亡的作用（±s，n=9）Tab.5 Down-regulation of miR-1193 reversed the effect of vitexicarpin on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cells（±s，n=9）

Note：Compared with Vitexicarpin+anti-miR-NC group，1）P<0.05.

Groups Vitexicarpin+anti-miR-NC Vitexicarpin+anti-miR-1193 t P miR-1193 1.00±0.07 0.57±0.041）16.000<0.01 Inhibition rate/%54.03±4.66 17.58±1.641）22.135<0.01 Apoptosis rate/%29.13±2.86 11.73±1.101）17.035<0.01 CyclinD1 protein 0.34±0.03 0.71±0.061）16.547<0.01 p21 protein 0.77±0.05 0.41±0.041）16.867<0.01 Bcl-2 protein 0.24±0.02 0.49±0.041）16.771<0.01 Bax protein 0.59±0.05 0.27±0.031）16.464<0.01

圖4 下調(diào)miR-1193逆轉(zhuǎn)了蔓荊子黃素對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖和凋亡的作用Fig.4 Down-regulation of miR-1193 reversed the effect of vitexine on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cells

3 討論

幾千年來，中草藥已被廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療，包括癌癥。蔓荊子黃素作為蔓荊子中主要黃酮類化學(xué)成分，具有明確的抗腫瘤特性，其通過調(diào)節(jié)原癌基因、抑癌基因表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路抑制癌細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有腫瘤治療替代品潛力［9］。研究顯示，蔓荊子黃素可引起口腔癌、肺癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、DNA聚集和損傷，影響DNA修復(fù)進(jìn)而抑制細(xì)胞存活并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［10-11］。蔓荊子黃素通過抑制磷酸肌醇3激酶（PI3K）激活還可抑制鼻咽癌的進(jìn)展［12］。此外，蔓荊子黃素還可抑制DNMT1活性、增加miR-148a-3p表達(dá)進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性［13］。本研究探討蔓荊子黃素在胃癌中的抗腫瘤作用顯示，蔓荊子黃素可顯著抑制AGS增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并呈一定的量效關(guān)系，與XIE等［14］報(bào)道其在口腔鱗癌中抗增殖作用一致。p21是細(xì)胞周期調(diào)控過程中一種負(fù)性調(diào)節(jié)因子，其通過抑制CyclinD1/細(xì)胞周期素依賴激酶（CDK4）復(fù)合體的活性在阻礙細(xì)胞周期從G1到S期中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是重要的抗增殖因子［15］。細(xì)胞凋亡是一個(gè)受多種因素調(diào)控的復(fù)雜過程，Bcl-2位于線粒體外膜，其通過抑制細(xì)胞色素C從線粒體的釋放來阻止細(xì)胞凋亡，而Bax具有相反作用，蔓荊子黃素通過下調(diào)CyclinD1、Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)對(duì)膽管癌細(xì)胞具有顯著的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用［16］。本研究顯示，蔓荊子黃素呈劑量依賴效應(yīng)降低CyclinD1、Bcl-2表達(dá)水平，升高p21和Bax表達(dá)水平，進(jìn)一步證實(shí)蔓荊子黃素在胃癌中的抗增殖和促凋亡作用。

miRNA是一類長度為18~22個(gè)核苷酸的新型非編碼RNA分子，其通過負(fù)性調(diào)控下游基因表達(dá)在細(xì)胞生長、發(fā)育、代謝等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)失衡與胃癌等腫瘤的發(fā)生有關(guān)［17］。miR-1193參與調(diào)控細(xì)胞增殖和遷移，其表達(dá)降低對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌、T細(xì)胞白血病發(fā)生具有促進(jìn)作用［18-19］。本研究顯示，蔓荊子黃素可顯著升高AGS細(xì)胞中miR-1193的表達(dá)水平，提示蔓荊子黃素在胃癌中的抗腫瘤作用可能與上調(diào)miR-1193有關(guān)。分析miR-1193在AGS細(xì)胞中的作用發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-1193可顯著降低AGS細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，下調(diào)miR-1193表達(dá)還可逆轉(zhuǎn)蔓荊子黃素對(duì)AGS細(xì)胞增殖和凋亡的影響。提示蔓荊子黃素對(duì)AGS細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用與上調(diào)miR-1193表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，蔓荊子黃素能夠抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與上調(diào)miR-1193表達(dá)有關(guān)，這豐富了蔓荊子黃素的抗腫瘤機(jī)制，為蔓荊子黃素在胃癌防治中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。