健脾化瘀解毒方調(diào)控能量代謝抑制肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的研究①

魏征 王艷春 李歡 侯留法 崔偉鋒 張俊萍

（河南省中醫(yī)藥研究院，鄭州 450004）

肺癌是目前是病死率最高的癌癥之一，肺癌在癌癥新發(fā)病例和死亡病例中均占據(jù)第一位［1］。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是制約肺癌術(shù)后生存率提高的主要因素，因此尋找和研發(fā)抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的抗腫瘤藥物顯得非常重要［2］。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生能量的方式比較特別，健康細(xì)胞依靠線粒體氧化糖類分子釋放出大量能量，而大多數(shù)腫瘤細(xì)胞則通過產(chǎn)能率相對(duì)較低的糖酵解作用為自身供能，這就是Warburg效應(yīng)［3］。同樣在肺癌之中，Warburg效應(yīng)為其轉(zhuǎn)移提供能量基礎(chǔ)，而miR-143-3p的表達(dá)可以抑制Warburg效應(yīng)，從而阻礙肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移。己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）是催化己糖使之磷酸化，糖酵解途徑的第一個(gè)酶，也是Warburg效應(yīng)的限速酶，HK2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，對(duì)于快速生長(zhǎng)的腫瘤代謝行為來說是至關(guān)重要的［4］。前期研究發(fā)現(xiàn)，健脾化瘀解毒方（Jianpi Huayu Jiedu recipe medicated serum，JHJRMS）處理非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株，可抑制其增殖和侵襲［5］。健脾化瘀解毒方如何調(diào)控miR-143-3p抑制Warburg效應(yīng)從而抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移尚不清楚。本研究擬進(jìn)一步闡明健脾化瘀解毒方通過調(diào)控肺癌細(xì)胞能量代謝抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為健脾化瘀解毒方的臨床運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為肺癌的臨床治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料為了保證試驗(yàn)藥效的一致性，藥物來源使用配方顆粒劑，確保指紋圖譜的一致性。健脾化瘀解毒方配伍為生黃芪30 g（批號(hào)：1019012）、茯苓15 g（批號(hào)：1011882）、白術(shù)15 g（批號(hào)：1011542）、石見穿15 g（1017422）、半枝蓮30 g（批號(hào)：0126832）、夏枯草30 g（批號(hào)：1025232）、全蝎3 g（批號(hào)：1013452）、天龍3 g（批號(hào)：6117692）、三七粉3 g（批號(hào)：7050862），均購(gòu)自廣東一方制藥有限公司。健康SPF級(jí)大耳白兔購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（豫）2015-0004。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（HNZYYYJY2018-0010）。人肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胰蛋白酶消化液（上海碧云天公司）；胎牛血清（Gibco公司）；反轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa公司）；Mix混合酶（羅氏公司）；HK2、E-cadherin、MMP-2、MMP-9抗體、β-actin抗體、HRP-標(biāo)記的二抗（Cell signaling公司）；乳酸檢測(cè)試劑盒（Abcam公司）。SERIES 8000 WJ型恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司）；倒置熒光顯微鏡（Olympus公司）；PCR儀（Roch公司）；Mini X25型垂直電泳儀、Universar HoodⅢ蛋白凝膠分析系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人肺癌A549細(xì)胞用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)在恒溫培養(yǎng)箱中（CO2含量為5%，溫度為37℃）。使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，并重懸成單細(xì)胞懸液備用。

1.2.2 含藥血清的制備將配方顆粒劑生黃芪30 g、茯苓15 g、白術(shù)15 g、半枝蓮30 g、石見穿15 g、夏枯草30 g、全蝎3 g、天龍3 g、三七粉3 g換算成等效生藥量配伍比例后生理鹽水溶解，生藥濃度為6 g/ml，待用。取SPF級(jí)大耳白兔12只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”計(jì)算出大耳兔的灌胃劑量，取8只給予健脾化瘀解毒方藥30 g/（kg·d）劑量灌胃。對(duì)照組4只給予相同劑量的生理鹽水，1次/d，連續(xù)灌胃1周。于末次用藥后1 h，無(wú)菌條件下心臟采血，分離血清（其中包括含藥血清和對(duì)應(yīng)的對(duì)照血清），56℃、30 min下補(bǔ)體滅活，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)前期研究數(shù)據(jù)：JHJRMS對(duì)A549細(xì)胞24 h的IC50=6.5% JHJRMS，后期實(shí)驗(yàn)采用濃度分組：低劑量組（含2%JHJRMS）、中劑量組（含4%JHJRMS）、高劑量組（含8%JHJRMS）和對(duì)照組（含8%對(duì)照組無(wú)藥兔血清）以便于后期深入研究（注：低劑量組和中劑量組分別補(bǔ)充不含藥血清6%和4%使最終每組的血清總含量一致，下同）。

1.2.3 HK2與肺癌患者預(yù)后生信分析選擇TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄網(wǎng)站。從單基因分析方法進(jìn)行研究，單基因選擇：HK2。Survival Plots研究設(shè)置如下篩選標(biāo)準(zhǔn)：Gene=HK2，Methods=Overall Survival，Group Cutoff=Quartile，Hazards Ratio（HR）=No，95% Confidence Interval=Yes，Axis Units=Days，Datasets Selection（Cancer name）=LUAD。按照上述條件導(dǎo)出生存曲線圖進(jìn)行分析。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)JHJRMS對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響先用Marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻劃?rùn)M線，大約每隔0.5~1 cm 1道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。在孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞，掌握為過夜能鋪滿。第2天用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基。放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)，拍照。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)JHJRMS對(duì)miR-143-3p表達(dá)的影響正常培養(yǎng)人肺癌A549細(xì)胞，消化細(xì)胞均勻接種于6孔板中，孵育12 h后。用含不同濃度JHJRMS（2%、4%和8%JHJRMS）的RPMI1640處理，對(duì)照組加入含8%對(duì)照組無(wú)藥血清的培養(yǎng)基。繼續(xù)孵育24 h后，提取RAN，運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)不同組織中miR-143-3p的表情況。miR-143-3p的引物序列為F：5'-GGGGTGAGATGAAGCACTG-3'，R：5'-CAGTGCGT?GTCGTGGAGT-3'；U6引物序列為：F：5'-GCTTCG?GCAGCACATATACTAA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，45個(gè)循環(huán)。對(duì)照組表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為1，取3次實(shí)驗(yàn)均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制相對(duì)RNA表達(dá)量圖。

1.2.6 Western blot檢測(cè)JHJRMS對(duì)肺癌細(xì)胞中HK2蛋白表達(dá)的影響正常培養(yǎng)細(xì)胞，消化后將A549肺癌細(xì)胞均勻接種于6孔培養(yǎng)皿中，用含不同濃度JHJRMS（2%、4%和8%JHJRMS）的RPMI1640處理，對(duì)照組加入含8%對(duì)照組無(wú)藥血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。分別提取每組處理過的細(xì)胞總蛋白質(zhì)，然后用SDS-PAGE在120 V恒定電壓下分離90 min。然后，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，分別用抗體（HK2、E-cadherin、MMP-2、MMP-9和β-actin）進(jìn)行孵育后，用對(duì)應(yīng)的二抗孵育，最后用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶。

1.2.7 乳酸生成速率測(cè)定用含不同濃度JHJRMS（2%、4%和8%JHJRMS）的RPMI1640處理肺癌細(xì)胞24 h后，分別吸取每組細(xì)胞上清待測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋：將100 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋為10、5、2.5、1.25、0.625、0 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將反應(yīng)混合物添加到樣品和標(biāo)準(zhǔn)孔中，37℃孵育30 min，用酶標(biāo)儀分析（波長(zhǎng)450 nm）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均表示為±s，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

2 結(jié)果

2.1 HK2與肺癌患者預(yù)后之間的相關(guān)性為了明確HK2在肺癌預(yù)后中的關(guān)系，利用TCGA和GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)調(diào)取肺癌患者信息進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KH2在肺癌組織中的表達(dá)略高于正常肺組織，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），在肺癌不同分期中的表達(dá)也無(wú)明顯差異（P>0.05）。HK2在生存率高的患者中多數(shù)低表達(dá)（P<0.01）。這提示HK2可能是一個(gè)不良預(yù)后的生物標(biāo)志物之一，抑制其表達(dá)可能會(huì)提高肺癌患者的生存率，如圖1所示。

圖1 HK2與肺癌預(yù)后之間的相關(guān)性圖表Fig.1 Correlation chart between HK2 and lung cancer prognosis

2.2 JHJRMS對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響為了探明JHJRMS對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，劃痕實(shí)驗(yàn)用來檢測(cè)JHJRMS抑制肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，JHJRMS處理后，肺癌細(xì)胞的傷口愈合速度明顯降低，并且呈一定的濃度依賴性，如圖2所示。

圖2 傷口愈合實(shí)驗(yàn)照片F(xiàn)ig.2 Pictures of wound healing experiments

2.3 JHJRMS對(duì)肺癌細(xì)胞中HK2蛋白以及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響為了明確健脾化瘀解毒方對(duì)HK2蛋白表達(dá)的影響和再次驗(yàn)證JHJRMS對(duì)于肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，用不同濃度的JHJRMS處理肺癌細(xì)胞，提取各組細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JHJRMS可顯著降低肺癌細(xì)胞中HK2的表達(dá)水平。侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白N-cadherin、MMP-2和MMP-9等顯著降低（P<0.001），如圖3所示。

圖3 侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Results of invasion and metastasis related protein expression

2.4 JHJRMS可顯著增強(qiáng)miR-143-3p在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)同時(shí)降低乳酸的生成為了進(jìn)一步明確JHJRMS對(duì)miR-143-3p的表達(dá)影響，用不同濃度的JHJRMS對(duì)肺癌細(xì)胞進(jìn)行處理，提取各組細(xì)胞的RNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JHJRMS可以明顯促進(jìn)肺癌細(xì)胞中miR-143-3p的表達(dá)（P<0.01），如圖4A所示，同時(shí)檢測(cè)各組細(xì)胞的乳酸生成水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JHJRMS可以明顯抑制肺癌細(xì)胞的乳酸生成（P<0.05），如圖4A所示。

圖4 JHJRMS對(duì)肺癌細(xì)胞中miR-143-3p表達(dá)和乳酸生成的影響Fig.4 Effect of JHJRMS on miR-143-3p expression and lactate production in lung cancer cells

2.5 miR-143-3p靶向調(diào)控HK2蛋白的有效結(jié)合位點(diǎn)及相關(guān)評(píng)分運(yùn)用相關(guān)軟件（TargetScan，miRBase）預(yù)測(cè)miR-143-3p的靶標(biāo)蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-143-3p和HK2蛋白的mRNA存在多處互補(bǔ)鏈（如圖5），miR-143-3p很可能靶向調(diào)控HK2蛋白的表達(dá)。

圖5 miR-143-3p靶向調(diào)控HK2蛋白的有效結(jié)合位點(diǎn)及相關(guān)評(píng)分Fig.5 miR-143-3p targets and regulates effective binding site and related scores of HK2 protein

3 討論

肺癌是全世界范圍內(nèi)病死率最高的癌癥，占癌癥死亡人數(shù)的21%。傳統(tǒng)中醫(yī)（traditional Chinese medicine，TCM）雖無(wú)肺癌之名，但其在肺癌臨床治療方面接受度越來越高。健脾化瘀解毒方源于中醫(yī)治療腫瘤的“扶正祛邪”法則，作為國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)專科常用院內(nèi)制劑，前期臨床研究取得了良好的臨床療效［6］，前期課題組體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)健脾化瘀解毒方可抑制肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。多項(xiàng)國(guó)內(nèi)外研究表明，中醫(yī)藥可以通過調(diào)控miRNA的表達(dá)水平，抑制肺癌的發(fā)生發(fā)展［7］。miR-143-3p在多種腫瘤中均起到抑癌作用［8-10］，通過調(diào)控Warburg效應(yīng)抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但其中的具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了miR-143-3p抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的靶蛋白HK2。而HK2是糖酵解途徑的第一個(gè)酶，也是Warburg效應(yīng)的限速酶，參與Warburg效應(yīng)［11］。HK2對(duì)于快速生長(zhǎng)的腫瘤代謝行為至關(guān)重要，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，HK2是miR-143-3p的靶標(biāo)蛋白之一，鑒于JHJRMS可以促進(jìn)miR-143-3p的表達(dá)豐度，而miR-143-3p可以負(fù)向調(diào)節(jié)HK2的表達(dá)。推測(cè)JHJRMS是否可以通過此途徑來降低HK2蛋白的表達(dá)從而抑制腫瘤的Warburg效應(yīng)呢？本研究首先分析了HK2與肺癌患者的預(yù)后關(guān)系，從側(cè)面觀察HK2在腫瘤代謝過程中的關(guān)鍵作用。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)HK2與肺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，低表達(dá)HK2的肺癌患者群組擁有更長(zhǎng)的生存期限，這說明HK2在肺癌發(fā)展中的關(guān)鍵作用，很可能是預(yù)測(cè)肺癌患者預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志［13］。傷口愈合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，JHJRMS可明顯降低肺癌細(xì)胞的傷口愈合能力，抑制肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。這說明JHJRMS對(duì)肺癌侵襲轉(zhuǎn)移能力具有明顯的抑制作用。因此推測(cè)JHJRMS是否可以通過調(diào)控miR-143-3p直接作用其靶蛋白HK2的表達(dá)，從而抑制肺癌細(xì)胞的Warburg效應(yīng)來達(dá)到抑制肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移呢？為了明確miR-143-3p和HK2在其中的作用，進(jìn)一步檢測(cè)了miR-143-3p和HK2的表達(dá)情況。運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)JHJRMS對(duì)肺癌細(xì)胞中miR-143-3p表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，隨著JHJRMS的加入，肺癌細(xì)胞中的miR-143-3p表達(dá)水平顯著升高，說明JHJRMS可以增加miR-143-3p的表達(dá)。為了尋找miR-143-3p的靶標(biāo)蛋白，利用TargetScan和miRBase兩個(gè)網(wǎng)站對(duì)其結(jié)合的潛在靶標(biāo)蛋白進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，調(diào)控Warburg效應(yīng)的HK2蛋白的mRNA與miR-143-3p有多個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)，說明能夠有效靶向性調(diào)節(jié)HK2蛋白。為了證實(shí)上述調(diào)控關(guān)系，進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JHJRMS可以明顯抑制HK2蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白N-cadherin和MMPs的表達(dá)。這也就是說，JHJRMS很可能是通過調(diào)控肺癌細(xì)胞中miR-143-3p的水平，抑制HK2蛋白的表達(dá)，從而抑制肺癌細(xì)胞的糖酵解過程進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-143-3p的靶蛋白HK2和肺癌患者預(yù)后之間的關(guān)系，證實(shí)了JHJRMS可以在體外抑制肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能是通過上調(diào)肺癌細(xì)胞中miR-143-3p進(jìn)而抑制其靶蛋白HK2的表達(dá)，抑制細(xì)胞的Warburg效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)其抑制侵襲轉(zhuǎn)移的功能。該研究將為健脾化瘀解毒方的臨床運(yùn)用提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為抗肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的中藥開發(fā)奠定一定基礎(chǔ)。