健脾補(bǔ)腎方調(diào)控激素性股骨頭壞死大鼠促成骨分化因子的研究

于 潼，謝利民，張振南，李玉彬，白 楊

(中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

隨著糖皮質(zhì)激素的大量應(yīng)用，激素性股骨頭壞死的發(fā)生率逐年增加[1]。糖皮質(zhì)激素可能通過多種途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡、增加破骨細(xì)胞活性及促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪化從而引發(fā)股骨頭壞死，但目前關(guān)于激素性股骨頭壞死的機(jī)制尚無確切定論。近年來關(guān)于激素性股骨頭壞死機(jī)制性研究多是圍繞骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)開展的[2]，研究發(fā)現(xiàn)激素可誘導(dǎo)BMSCs成骨能力減弱、成脂肪分化能力增強(qiáng)[3-4]，即抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化而轉(zhuǎn)向促脂肪細(xì)胞分化。但激素影響B(tài)MSCs活性的途徑尚不清楚。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)以健脾利濕、補(bǔ)腎生髓、活血通絡(luò)為法結(jié)合臨床組方的健脾補(bǔ)腎方可有效緩解股骨頭壞死患者臨床癥狀，改善髖關(guān)節(jié)功能[5-6]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)該方可誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)膠原纖維鈣鹽沉積，從而修復(fù)骨組織而扭轉(zhuǎn)骨壞死[7]。而干細(xì)胞分化方向與細(xì)胞因子的調(diào)控作用密切相關(guān)[8-11]，據(jù)此推測健脾補(bǔ)腎方可能通過調(diào)控細(xì)胞因子而誘導(dǎo)促進(jìn)激素性股骨頭壞死BMSCs定向成骨分化。故本研究擬選擇與成骨細(xì)胞分化相關(guān)的細(xì)胞因子，觀察健脾補(bǔ)腎方對上述細(xì)胞因子的影響，從而篩選與健脾補(bǔ)腎方調(diào)控股骨頭壞死BMSCs定向成骨細(xì)胞分化的相關(guān)細(xì)胞因子，并為深入探索健脾補(bǔ)腎方治療激素性股骨頭壞死的機(jī)制研究提供前期基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性Wistar大鼠12只，體重約200 g，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，合格證編號：SCXK( 京 )2019-0010。每籠2只，標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水?dāng)z食喂養(yǎng)，室溫控制在21～24 ℃，濕度維持在40%～70%，光照晝夜交替12 h。

1.2藥品與試劑 健脾補(bǔ)腎方由茯苓、杜仲、菟絲子、炒白術(shù)、炙甘草、川牛膝、醋延胡索、紅花等藥物組成，由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院免煎藥房提供。注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉, 瑞士輝瑞公司，批號:X60837；注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司，批號:D0709203；大腸桿菌內(nèi)毒素L2880，美國Sigma公司，批號：039M4004V。

1.3主要儀器與設(shè)備 精密移液器(Eppendorf)，低溫冷凍離心機(jī)(Heal Force，Neofuge 13R)，酶標(biāo)儀(Biotek，Synergy H4)，搖床(蘇坤，SKY-200B)，漩渦儀(天力，TL96-A),Fresco低溫冷凍離心機(jī)(Thermo),MultiSkan3酶標(biāo)儀(Thermo),Mini P-4電泳槽(Cavoy),濕轉(zhuǎn)電泳槽(Cavoy),電泳儀(Bio-Rad)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、健脾補(bǔ)腎方組, 每組4只 。模型組及健脾補(bǔ)腎方組參考文獻(xiàn)[12-13]建立激素性股骨頭壞死模型：大腸桿菌內(nèi)毒素20 μg/kg 腹腔注射2次，每次間隔24 h；末次注射內(nèi)毒素24 h后，給予甲潑尼龍琥珀酸鈉40 mg/kg 臀肌注射3次，每次間隔24 h，注射激素后給予腹腔注射青霉素鈉4×104IU預(yù)防感染，1次/d?？瞻捉M僅注射等量生理鹽水。造模結(jié)束后，健脾補(bǔ)腎方組每天灌胃2 g/mL健脾補(bǔ)腎湯[根據(jù)人與動(dòng)物體表面積換算公式D鼠=D人×R鼠/R人(D為給藥劑量，R為動(dòng)物與人體表面積比值系數(shù))及前期實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)計(jì)算給藥量[7，14]],灌胃量為10 mL/kg，模型組和空白組每天灌胃等量生理鹽水，3組均連續(xù)灌胃12周。實(shí)驗(yàn)過程中觀察各組大鼠運(yùn)動(dòng)、飲食等一般情況。

1.5樣本采集 灌胃12周后，使用10 mL注射器抽取腹主動(dòng)脈血液，4 ℃ 3 500 r/min離心(離心半徑8.5 cm)15 min，分離出血清備用。處死各組大鼠，取股骨頭，用骨鉗將股骨頭內(nèi)組織夾碎，將夾碎的組織置于研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，加入9倍無菌生理鹽水轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，4 ℃ 3 000 r/min離心(離心半徑8.5 cm)15 min，吸取上清液加入到新的1.5 mL EP管中備用。

1.6檢測指標(biāo)及方法 應(yīng)用雙抗體一步夾心法試劑盒酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和Western blot法分別檢測各組大鼠血清及股骨頭組織中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板衍性生長因子(PDGF)、成骨特異性細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)表達(dá)情況。 ELISA檢測按照說明書操作。Western blot檢測：根據(jù)目的蛋白的分子量，配制12%分離膠，濃縮膠濃度為5%，將檢測蛋白樣品上樣，20 μg/孔，電泳條件：濃縮膠恒壓90 V，約20 min；分離膠恒壓160 V，通過marker來確定電泳停止時(shí)間。轉(zhuǎn)膜：300 mA恒流，0.45 μm孔徑NC膜，轉(zhuǎn)膜1 h，染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果，封閉。一抗孵育：用3%BSA-TBST稀釋一抗，室溫孵育10 min，4 ℃過夜，第2天取出膜，室溫孵育30 min。洗膜：TBST洗膜5次，每次3 min。二抗孵育：用5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗，山羊抗兔IgG(H+L) HRP 或山羊抗小鼠IgG(H+L) HRP，1∶10 000，室溫輕搖 40 min。洗膜：TBST洗膜6次，每次3 min。ECL加到膜上后反應(yīng)3～5 min，膠片曝光10 s～5 min(曝光時(shí)間隨不同光強(qiáng)度而調(diào)整)，顯影2 min，定影。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 在灌胃干預(yù)的前2周，模型組與健脾補(bǔ)腎方組大鼠少動(dòng),步態(tài)輕微跛行，進(jìn)食減少，精神萎靡，毛發(fā)干枯；2周后，健脾補(bǔ)腎方組大鼠活動(dòng)增多，進(jìn)食恢復(fù)，精神逐步好轉(zhuǎn)，毛發(fā)逐漸恢復(fù)正常光澤?？瞻捉M動(dòng)物正常飲食飲水。

2.2各組大鼠ELISA檢測血清及骨組織中相關(guān)細(xì)胞因子水平 健脾補(bǔ)腎方組血清BMP-2、TGF-β、VEGF水平及骨組織中BMP-2水平均明顯高于空白組和模型組(P均<0.05)，空白組均明顯高于模型組(P均<0.05)；其余指標(biāo)各組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1及表2。

表1 空白組和激素性股骨頭壞死各組大鼠ELISA檢測血清相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

表2 空白組和激素性股骨頭壞死各組大鼠ELISA檢測骨組織中相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

2.3各組大鼠Western blot檢測血清及骨組織中相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)情況 條帶圖顯示，健脾補(bǔ)腎方組血清BMP-2表達(dá)量高于空白組和模型組，血清TGF-β表達(dá)量高于模型組，其余指標(biāo)未見明顯不同。見圖1及圖2。

圖1 空白組和激素性股骨頭壞死各組大鼠Western blot檢測血清相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)情況

圖2 空白組和激素性股骨頭壞死各組大鼠Western blot檢測骨組織中相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)情況

3 討 論

《脾胃論·脾胃勝衰論》云：“脾病則下流乘腎，土克水則骨乏無力，是為骨蝕，令人骨髓空虛，足不能履地。”脾陽不足則運(yùn)化傳輸不利，水津敷布失常，聚而生痰化濕；水濕之邪下聚于腎，則致腎之開闔不利，溫煦失職，血失去溫煦，遇寒則凝，聚而成瘀，形成痰瘀阻絡(luò)的病理產(chǎn)物。健脾補(bǔ)腎方中茯苓甘平，善入脾經(jīng)，益脾和胃、利水滲濕化痰；白術(shù)甘溫，歸脾胃經(jīng)，健脾益胃、和中燥濕利水，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)白術(shù)具有增強(qiáng)免疫、促進(jìn)骨生長、抗血小板聚集等功能[15-16]，其與茯苓合用可健脾益氣、化痰滲濕，脾胃健運(yùn)則痰濕得以化無以生，氣血生化有源，精髓充滿。杜仲甘溫，歸肝腎經(jīng)，補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨；菟絲子平微辛，歸肝脾腎經(jīng)，補(bǔ)腎益精、善補(bǔ)腎陽，為平補(bǔ)陰陽之品，與杜仲合用可以溫補(bǔ)腎陽、益精填髓、強(qiáng)筋健骨。胡曉梅等[17]研究發(fā)現(xiàn)，局部運(yùn)用菟絲子總多糖可能通過促進(jìn)Ⅱ型膠原的表達(dá)而修復(fù)家兔關(guān)節(jié)軟骨缺損。杜仲及其提取物可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化成熟以促進(jìn)骨形成和愈合，同時(shí)還可間接抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟，從而抑制骨吸收，以提高骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度[18-21]。牛膝甘苦酸平，入肝腎經(jīng)，功善散瘀血、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，既入血分，又入氣分，引藥下行；延胡索辛苦溫，功善活血、散瘀、理氣、止痛；紅花辛溫，為活血通經(jīng)、祛瘀止痛之要藥；三藥共用以活血祛瘀、行氣止痛，氣為血帥，血為氣母，氣行則推動(dòng)血行，血行則不聚不瘀。甘草甘平，和中緩急，調(diào)和諸藥。方聚補(bǔ)虛化痰祛瘀為一體，諸藥兼施，攻守有度，共奏健脾利濕、補(bǔ)腎生髓、活血通絡(luò)之功。健脾化痰濕，斷痰濕生化傳變之路，痰濕不聚則瘀滯不生；補(bǔ)腎生髓則腎充精足，骨骼筋骨得以濡養(yǎng)；同時(shí)輔以通絡(luò)祛瘀之品，瘀祛新生而開氣血周轉(zhuǎn)運(yùn)行之道，則氣血生化有源，精髓得以充養(yǎng)，骨骼筋脈健運(yùn)有力。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源于中胚層的未分化間充質(zhì)干細(xì)胞[22-23]，具有多向分化潛能，可分化成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞，而各種細(xì)胞因子和生長因子對其分化方向有著重要影響[8-11，24]。前期觀察健脾補(bǔ)腎方對家兔激素性股骨頭壞死模型的影響發(fā)現(xiàn)，健脾補(bǔ)腎方可有效促進(jìn)骨組織修復(fù)，遏制骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的趨勢而轉(zhuǎn)向向成骨細(xì)胞分化，且成骨細(xì)胞分泌的膠原纖維上鈣鹽逐漸沉積、形成明顯的鈣結(jié)節(jié)，從而促進(jìn)骨組織修復(fù)[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ELISA法檢測健脾補(bǔ)腎方組血清BMP-2、TGF-β、VEGF水平及骨組織中BMP-2水平均明顯高于模型組，Western blot法檢測健脾補(bǔ)腎方組血清BMP-2、TGF-β表達(dá)量高于模型組。據(jù)此推測健脾補(bǔ)腎方可能通過對BMP-2和TGF-β因子的調(diào)控而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向成骨分化而促進(jìn)骨壞死修復(fù)。

綜上所述，健脾補(bǔ)腎方可能通過調(diào)控BMP-2、TGF-β表達(dá)而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向成骨分化，從而扭轉(zhuǎn)骨壞死。但本研究為前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，主要目的在于篩選可能與健脾補(bǔ)腎方調(diào)控股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化成骨細(xì)胞相關(guān)的調(diào)節(jié)因子，為后期深入探討健脾補(bǔ)腎方防治股骨頭壞死的機(jī)制研究提供前期理論基礎(chǔ)，其確切機(jī)制還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入研究驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。