自噬在結核菌素誘導破骨細胞形成中的作用及機制

王增順，索南昂秀*，劉立民，周京元，伍 驥

1.青海省人民醫(yī)院骨科，西寧 810000

2. 中國人民解放軍空軍特色醫(yī)學中心骨科，北京 100142

結核病是結核分枝桿菌感染引起的呼吸道傳染病，結核分枝桿菌經血液循環(huán)侵入骨關節(jié)后引起骨關節(jié)結核。脊柱結核是最常見的骨關節(jié)結核，以進行性骨質破壞為主要特征［1-2］。破骨細胞由前體細胞單核巨噬細胞分化而來，并介導骨質吸收，破骨細胞的異常增殖及分化在骨質破壞中起關鍵作用。多項骨關節(jié)結核的細胞實驗研究［3-4］發(fā)現，結核菌素對單核巨噬細胞向破骨細胞的分化過程具有促進作用，但與這一作用相關的分子機制尚不十分清楚。

自噬是近年發(fā)現的與結核分枝桿菌感染、骨質疏松發(fā)生密切相關的生物學過程。在骨質疏松的發(fā)生過程中，自噬對破骨細胞的分化具有促進作用，使用自噬激動劑雷帕霉素干預后，單核巨噬細胞分化為破骨細胞的數量明顯增多［5］。在結核分枝桿菌感染單核巨噬細胞的過程中，自噬激活明顯，多種自噬基因（Atg5、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）的表達增加［6-7］。但結核分枝桿菌激活單核巨噬細胞自噬的作用是否與其促進破骨細胞形成有關并未明確。因此，本研究通過細胞實驗來觀察自噬在結核菌素誘導破骨細胞形成中的作用及機制，旨在為闡明脊柱結核發(fā)生過程中骨質破壞的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠單核巨噬細胞（RAW264.7細胞）購自中國科學院上海細胞資源中心，結核菌素純化蛋白衍生物（PPD）注射液（規(guī)格50 IU/mL、1 mL/支）購自北京祥瑞生物制品有限公司，自噬抑制劑3-甲基腺苷（3-MA）、自噬激動劑雷帕霉素均購自美國Sigma公司，MTS細胞活力檢測試劑盒購自美國Promega公司，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒、TRAP活力檢測試劑盒購自南京建成研究院，Beclin-1、LC3抗體購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

RAW264.7細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行貼壁培養(yǎng)，細胞密度達80% ~ 90%后用0.25%胰蛋白酶消化，傳代后的細胞接種在培養(yǎng)板內并進行分組給藥。對照組用不含藥物的培養(yǎng)基處理，PPD組分別用含有1.0、2.5、5.0、10.0 IU/mL PPD的培養(yǎng)基處理，5.0 IU/mL PPD+激動劑組用含有 5.0 IU/mL PPD+100 nmol/L 雷帕霉素的培養(yǎng)基處理，5.0 IU/mL PPD+ 抑制劑組用含有5.0 IU/mL PPD+2 mmol/L 3-MA的培養(yǎng)基處理。雷帕霉素的劑量參照陸明等［8］的報道，3-MA的劑量參照徐亦文等［9］的報道。每組設置5個復孔。

1.3 細胞存活率的檢測

將RAW264.7細胞接種于96孔培養(yǎng)板內，分組給藥培養(yǎng)24 h后，采用MTS細胞活力檢測試劑盒進行檢測。每孔加入200 μL檢測液，同時設置不接種細胞的檢測液作為空白組，37℃孵育4 h后，在酶標儀上檢測490 nm處的光密度值，細胞活力（%）=（實驗組光密度值-空白組光密度值）/（對照組光密度值-空白組光密度值）×100%。

1.4 破骨細胞形成的檢測

將RAW264.7細胞接種于6孔培養(yǎng)板內，分組給藥培養(yǎng)7 d后，用4%多聚甲醛固定細胞，采用TRAP染色試劑盒進行染色，用蘇木精復染。在顯微鏡下觀察，隨機選擇5個視野，對TRAP陽性染色的破骨細胞進行計數。

1.5 TRAP活力檢測

將RAW264.7細胞接種于6孔培養(yǎng)板內，分組給藥培養(yǎng)7 d后，收集培養(yǎng)基，采用TRAP活性檢測試劑盒進行檢測。加入反應底物后孵育3 h，然后在酶標儀上檢測540 nm波長處的吸光度值。

1.6 自噬小體的檢測

將RAW264.7細胞接種于6孔培養(yǎng)板內，分組給藥培養(yǎng)7 d后，用2.5%戊二醛溶液固定。用1%鋨酸4℃處理1 h，經70%、80%、95%、100%乙醇溶液梯度脫水后，用環(huán)氧樹脂包埋，-80℃聚合24 h，之后用3%檸檬酸鉛染色。在透射電鏡下觀察，隨機選擇5個視野，對自噬小體進行計數。

1.7 自噬相關基因表達的檢測

采用蛋白質印跡法檢測自噬相關基因的蛋白表達。將RAW264.7細胞接種于12孔培養(yǎng)板內，分組給藥培養(yǎng)7 d后，用RIPA裂解液提取細胞蛋白，測定蛋白含量。取30 μg蛋白樣本加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，電泳后電轉移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶在室溫下封閉PVDF膜1 h。PVDF膜用1∶1 000稀釋的 Beclin-1、LC3抗體或1∶2 500稀釋的β-actin抗體4℃孵育過夜，次日洗膜3次后，再用1∶2 000稀釋的二抗室溫孵育1 h。在凝膠成像儀中曝光得到蛋白條帶，測定灰度值，以Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ與β-actin的比值作為蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義的指標用LSD-t法進行兩兩比較；以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 不同濃度PPD對RAW264.7細胞活力的影響

與對照組相比，1.0、2.5、5.0 IU/mL PPD 組細胞活力無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05，圖1）；10.0 IU/mL PPD組細胞活力降低，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05，圖1）。

圖1 不同濃度PPD對細胞活力的影響Fig. 1 Effect of PPD at different concentrations on cell viability

2.2 不同濃度PPD對RAW264.7細胞分化為破骨細胞的影響

與對照組相比，1.0 IU/mL PPD組破骨細胞數量及培養(yǎng)基中TRAP活力增高，但差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05，圖2）；2.5、5.0、10.0 IU/mL PPD 組破骨細胞數量及培養(yǎng)基中TRAP活力均顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05，圖2）。

圖2 不同濃度PPD對RAW264.7細胞分化為破骨細胞的影響Fig. 2 Effect of PPD at different concentrations on differentiation of RAW264.7 cells into osteoclasts

2.3 不同濃度PPD對RAW264.7細胞自噬水平的影響

與對照組相比，1.0、2.5、5.0、10.0 IU/mL PPD組RAW264.7細胞中自噬小體的數量及Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ的表達水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05，圖3、4）。

圖3 不同濃度PPD對RAW264.7細胞中自噬小體數量的影響Fig. 3 Effect of PPD at different concentrations on number of autophagosomes in RAW264.7 cells

圖4 蛋白質印跡法檢測不同濃度PPD誘導后RAW264.7細胞中、LC3的表達Fig. 4 Expression of Beclin-1 and LC3 in RAW264.7 cells induced by PPD at different concentrations detected by Western blotting

2.4 自噬激動劑及抑制劑對PPD誘導后RAW264.7細胞自噬水平的影響

自噬激動劑及抑制劑對RAW264.7細胞活力均無明顯影響（圖5）。與對照組比較，5.0 IU/mL PPD組RAW264.7細胞中自噬小體數量及Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ的表達水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05，圖6、7）。與5.0 IU/mL PPD 組比較，5.0 IU/mL PPD+激動劑組RAW264.7細胞中自噬小體數量及Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ的表達水平均明顯增加，5.0 IU/mL PPD+ 抑制劑組RAW264.7細胞中自噬小體數量及Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ的表達水平均明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P< 0.05，圖6、7）。

圖5 自噬激動劑及抑制劑對5.0 IU/mL PPD誘導后RAW264.7細胞活力的影響Fig. 5 Effects of autophagy agonist and inhibitor on viability of RAW264.7 cells after 5.0 IU/mL PPD induction

圖6 自噬激動劑及抑制劑對5.0 IU/mL PPD誘導后RAW264.7細胞中自噬小體數量的影響Fig. 6 Effects of autophagy agonists and inhibitors on number of autophagosomes in RAW264.7 cells after 5.0 IU/mL PPD induction

圖7 蛋白質印跡法檢測自噬激動劑及抑制劑對5.0 IU/mL PPD誘導后RAW264.7細胞中Beclin-1、LC3表達的影響Fig. 7 Effects of autophagy agonists and inhibitors on expression of Beclin-1 and LC3 in RAW264.7 cells after 5.0 IU/mL PPD induction detected by Western blotting

2.5 自噬激動劑及抑制劑對5.0 IU/mL PPD 誘導后RAW264.7細胞分化為破骨細胞的影響

與對照組比較，5.0 IU/mL PPD 組RAW264.7細胞分化為破骨細胞的數量及培養(yǎng)基中TRAP的活力增高，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05，圖8）；與5.0 IU/mL PPD組比較，5.0 IU/mL PPD+ 激動劑組RAW264.7細胞分化為破骨細胞的數量及培養(yǎng)基中TRAP的活力增高，5.0 IU/mL PPD+ 抑制劑組RAW264.7細胞分化為破骨細胞的數量及培養(yǎng)基中TRAP的活力降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P< 0.05，圖8）。

圖8 自噬激動劑及抑制劑對5.0 IU/mL PPD誘導后RAW264.7細胞分化為破骨細胞的影響Fig. 8 Effect of autophagy agonist and inhibitor on differentiation of RAW264.7 cells after 5.0 IU/mL PPD induction into osteoclasts

3 討 論

進行性的骨質破壞是脊柱結核的特征，主要累及椎體，可引起椎體塌陷、脊髓壓迫，嚴重者出現脊柱后凸畸形或截癱［10］。破骨細胞是體內唯一一種介導骨質吸收功能的終末細胞，在正常組織中含量極少，在病理條件下可由單核巨噬細胞分化而來。在脊柱結核發(fā)生過程中，破骨細胞與骨質破壞密切相關，多項研究發(fā)現PPD能夠促進單核巨噬細胞向破骨細胞分化。梁思敏等［3，11］使用1.0 IU/mL和10.0 IU/mL PPD 誘導RAW264.7細胞形成破骨細胞，但10.0 IU/mL PPD 會影響RAW264.7細胞活力。本研究在此基礎上對1.0 ~ 10.0 IU/mL 的濃度區(qū)間進行了細化，使用1.0、2.5、5.0、10.0 IU/mL的PPD對RAW264.7細胞進行誘導，發(fā)現僅10.0 IU/mL PPD 會使RAW264.7細胞活力降低，其余3種濃度PPD不影響RAW264.7細胞活性 ；1.0 IU/mL PPD 雖不影響細胞活性，但也未能促進RAW264.7細胞形成破骨細胞，而其余3種濃度PPD能夠明顯增加破骨細胞數量，具有促進RAW264.7細胞形成破骨細胞的作用。

目前，PPD誘導破骨細胞形成的作用已經受到廣泛關注，但與之相關的分子機制尚不十分清楚。有研究［12-14］報道，結核分枝桿菌感染對單核巨噬細胞的自噬具有激活作用，自噬的激活可能有利于病原菌的清除，但過度自噬也可能引起組織損傷。本研究采用不同濃度PPD誘導RAW264.7細胞，結果發(fā)現1.0、2.5、5.0、10.0 IU/mL的PPD均能激活自噬，自噬小體數目及自噬基因Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ的表達均明顯增加，與既往研究結果一致。

骨質疏松的多項研究［8-9，15-16］發(fā)現，自噬與骨代謝密切相關，成骨細胞及破骨細胞均受到自噬調控，當自噬發(fā)生抑制時，破骨細胞的分化明顯受阻。為了闡明PPD激活自噬在RAW264.7細胞形成破骨細胞中的作用，本研究分別使用了自噬激動劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-MA進行實驗，在5.0 IU/mL PPD誘導RAW264.7細胞形成破骨細胞的過程中加用雷帕霉素或3-MA，結果發(fā)現，激活自噬能夠增強PPD誘導破骨細胞形成的作用、抑制自噬能夠削弱PPD誘導破骨細胞形成的作用，表明自噬在PPD誘導RAW264.7細胞形成破骨細胞的過程中起重要作用。

綜上所述，PPD誘導破骨細胞形成的作用與自噬激活有關，這為今后研究脊柱結核發(fā)生過程中骨質破壞的發(fā)生機制提供了新思路，也為研究脊柱結核新的防治靶點提供了理論參考。但目前PPD激活自噬的機制尚不十分清楚，有研究［17-18］認為，mTOR、AMPK等經典的自噬調控通路在PPD激活自噬中起調控作用，也有研究［19-20］認為，miR-18a、miR-125b-5p等非編碼RNA在PPD激活自噬中起調控作用，但具體機制仍有待今后更多的研究證實。