肺炎克雷伯菌鐵攝取調(diào)節(jié)蛋白(Fur)的生物學(xué)功能及對(duì)fyuA 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

杜 玲，張加雪，袁靈月，諶麗妃，李迎麗，邱景富

(重慶醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，重慶 400016)

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）是革蘭陰性桿菌，根據(jù)致病性分為2 個(gè)類型：經(jīng)典肺炎克雷伯菌（classicKlebsiella pneumonia，cKP）和高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsiella pneumonia，hvKP）[1-2].K.pneumoniae在臨床上可引起泌尿道感染、菌血癥、化膿性肝膿腫和腦膜炎等疾病，相關(guān)的毒力因子包括莢膜多糖、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、菌毛（fimbriae）及鐵載體（siderophores）等[3]，其中鐵載體包括氣桿菌素、腸桿菌素、沙門菌素和耶爾森菌素4 類.與cKP 相比，hvKP 具有更強(qiáng)的攝鐵能力可分泌更多的鐵載體，是其毒力特征之一[4].

鐵對(duì)于大多數(shù)生物來(lái)說(shuō)是生長(zhǎng)過(guò)程中的必需元素，它作為一些酶的輔因子在物質(zhì)代謝、DNA 的合成和基因調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用[5-6].然而過(guò)量的鐵會(huì)通過(guò)Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生活性氧（ROS），從而對(duì)細(xì)胞大分子造成損害.隨著環(huán)境改變，原核細(xì)胞和真核細(xì)胞均已演變出一系列維持鐵穩(wěn)態(tài)的機(jī)制，其中鐵攝取調(diào)節(jié)蛋白（ferric uptake regulator，F(xiàn)ur）起主導(dǎo)作用[7].當(dāng)胞內(nèi)鐵含量過(guò)高時(shí)，F(xiàn)ur 與Fe2+形成二聚體，結(jié)合在靶基因的啟動(dòng)子區(qū)抑制靶基因轉(zhuǎn)錄和鐵攝取相關(guān)基因的表達(dá)[8]，某些情況下，F(xiàn)ur 也可以起激活劑的作用[9-11]；當(dāng)環(huán)境中的鐵受到限制時(shí)，F(xiàn)ur?Fe2+復(fù)合物解離，形成Fur 單體，進(jìn)而解除其抑制作用.同時(shí)，缺鐵條件下會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌鐵載體合成基因的表達(dá)，生成的鐵載體分泌到環(huán)境中以結(jié)合鐵，細(xì)胞通過(guò)外膜受體和內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將鐵?鐵載體復(fù)合物運(yùn)輸?shù)桨麅?nèi)以滿足生長(zhǎng)需要[12].

強(qiáng)毒力島（high pathogenicity island，HPI）在腸桿菌科中廣泛存在，與致病性及毒力密切相關(guān)，所攜帶的基因主要參與鐵載體耶爾森菌素的合成、調(diào)節(jié)與轉(zhuǎn)運(yùn)[13].HPI 由功能核心區(qū)和可變區(qū)兩部分構(gòu)成，菌群之間會(huì)發(fā)生水平轉(zhuǎn)移[14].目前，已在大腸桿菌、沙門菌、霍亂弧菌及克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)HPI 的存在[15-16].與大腸桿菌序列進(jìn)行比較，K.pneumoniae存在HPI 中的部分基因，即irp2、irp1、ybtU、ybtT、ybtE和fyuA，其中fyuA基因作為耶爾森菌素的受體，是HPI 基因簇的核心基因之一.有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道fyuA與許多腸桿菌科細(xì)菌毒力相關(guān)[17]，而K.pneumoniae中 對(duì)fyuA的研究 卻鮮有報(bào)道.我們通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)K.pneumoniae中fyuA基因啟動(dòng)子區(qū)可能存在Fur 的結(jié)合位點(diǎn).

Fur 蛋白由fur基因編碼，是一個(gè)全局性調(diào)控因子，能與其他調(diào)控系統(tǒng)協(xié)同作用，在維持細(xì)菌鐵穩(wěn)態(tài)時(shí)，也影響著細(xì)菌的生理和代謝[7].大多數(shù)生物體內(nèi)都有Fur 蛋白的存在，并已證明它在物種之間具有高度的序列同源性，且有相似的空間結(jié)構(gòu).在大腸桿菌中，已對(duì)Fur 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式進(jìn)行了深入研究，建立出完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[18].不同細(xì)菌體內(nèi)Fur 功能存在差異，而細(xì)菌的特異性造成敲除fur基因后呈現(xiàn)不同的表型變化[19-21].目前在肺炎克雷伯菌中缺少對(duì)Fur 的研究，F(xiàn)ur 對(duì)fyuA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制也尚不清楚.故本研究采用基因敲除技術(shù)構(gòu)建肺炎克雷伯菌fur基因缺失株，對(duì)其功能進(jìn)行研究；并通過(guò)分子實(shí)驗(yàn)明確Fur 對(duì)fyuA的調(diào)控機(jī)制，為肺炎克雷伯菌的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與材料.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和質(zhì)粒肺炎克雷伯菌NTUH?K2044、溫敏型自殺載體質(zhì)粒pKO3?km（含卡那霉素抗性基因和一個(gè)sacB基因）受贈(zèng)于臺(tái)灣大學(xué)的Jing-Town Wang 教授，熒光質(zhì)粒pPRObe?gfp（卡那霉素抗性）購(gòu)自addgene 公司，菌株E.coliDH5α 和質(zhì)粒pBAD33（氯霉素抗性）由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 主要試劑與引物Pfu DNA聚合酶、ExTaqDNA 聚合酶、dNTPs 均購(gòu)自寶生物工程大連有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶、T4 Buffer為New England Biolabs 公司產(chǎn)品；PCR 純化試劑盒、PrimeScript?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒為Takara 公司產(chǎn)品；RNeasy mini kit 試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒為Qiagen 公司產(chǎn)品；其他常用生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?本實(shí)驗(yàn)所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1.

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Tab.1 Primers used in the experiment

1.3 突變株Δfur 及回補(bǔ)株C?Δfur 的構(gòu)建以野生株NTUH?K2044 總DNA 為模板，采用融合PCR得到敲除fur基因的上下游同源臂拼接片段后，克隆到自殺質(zhì)粒pKO3?Km 上.將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pKO3?km?Δfur電轉(zhuǎn)入NTUH?K2044 的感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)同源重組并利用蔗糖反向篩選出無(wú)痕突變株Δfur.PCR 擴(kuò)增得到fur片段，與pBAD33 表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行酶切連接，通過(guò)電轉(zhuǎn)的方式導(dǎo)入突變株Δfur中篩選出C?Δfur菌株，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[22].

1.4 生長(zhǎng)曲線分別將野生株、突變株、回補(bǔ)株的單菌落接于15 mL LB 培養(yǎng)基中（回補(bǔ)株中加入35 μg/mL 氯霉素），37 ℃，200 r/min 過(guò)夜培養(yǎng).次日，按1∶100 接種量轉(zhuǎn)接至50 mL LB 或含有200 μmol/L 2,2′?dipyridyl 的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)；每隔2 h 測(cè)定培養(yǎng)物的OD600值，持續(xù)檢測(cè)20 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)檢測(cè)3 次取其平均值.使用GraphPad Prism 8.0.1 軟件繪制生長(zhǎng)曲線.

1.5 CAS 檢測(cè)法使用鉻天青S（CAS）瓊脂平板和溶液測(cè)量鐵載體的生成量.從平板上挑取野生株和突變株的單菌落接于15 mL MM9 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，回補(bǔ)株單菌落接于15 mL MM9 培養(yǎng)基中（含氯霉素 35 μg/mL），37 ℃，200 r/min 過(guò)夜培養(yǎng).次日，將細(xì)菌懸液OD600值調(diào)至同一水平，取5 μL 點(diǎn)于CAS平板上，并在37 ℃下培養(yǎng)14 h，通過(guò)細(xì)菌菌落周圍橘黃色螯合圈大小初步判定鐵載體的生成.為了定量測(cè)定鐵載體的產(chǎn)生，將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按1%轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至OD600為1.5.每株菌各取0.5 mL 細(xì)菌懸液離心10 min，將上清液稀釋30 倍后加入0.5 mL CAS 檢測(cè)液，再加入10 μL Shuttle 溶液，混勻反應(yīng)30 min 后，使用分光光度計(jì)測(cè)量630 nm 處的吸光度，重復(fù)測(cè)定3 次.鐵載體的生成計(jì)算如下：

鐵載體相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)=[(Ar?As)/Ar]×100%，其中As和Ar分別代表樣品組和對(duì)照組的吸光度.

1.6 結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)野生株、突變株和回補(bǔ)株的單菌落接于15 mL LB 培養(yǎng)基中（回補(bǔ)株中含氯霉素35 μg/mL），28 ℃，200 r/min 過(guò)夜培養(yǎng).次日，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至OD600為1.0，再1∶100 稀釋至裝有2 mL MM9 肉湯的玻璃試管中28 ℃靜置培養(yǎng).將培養(yǎng)24、36、48 h 生物膜的試管取出，吸出菌液后用ddH2O 潤(rùn)洗3 次，烘箱靜置15 min 烘干；加入0.1%結(jié)晶紫溶液染色30 min，ddH2O 潤(rùn)洗5 次；加入DMSO，每管2 mL，放置1～2 h 溶解結(jié)晶紫.

生物膜 的相對(duì) 形成量=1 000×OD570/(OD600×V1×V2)[23]，其中，V1為初始菌液體積(mL)，V2為DMSO 體積(mL).

1.7 GFP 報(bào)告基因融合實(shí)驗(yàn)將NTUH?K2044中fyuA基因啟動(dòng)子區(qū)域的片段經(jīng)PCR 擴(kuò)增后克隆到pPROBE?gfp質(zhì)粒gfp基因上游.再通過(guò)電轉(zhuǎn)將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPROBE?fyuA導(dǎo)入K2044 和Kp∶Δfur中，pPROBE?gfp電轉(zhuǎn)入K2044 中.所得菌株分別接入MM9 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（含Kan 50 μg/mL），37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)；次日，按1∶100 轉(zhuǎn)接至MM9 培養(yǎng)基或含有100 μmol/L FeSO4的MM9 培養(yǎng)基中（含Kan 50 μg/mL 培養(yǎng)6 h.測(cè)量菌液OD600值并將其調(diào)至同一水平0.2 左右，每個(gè)菌株做3 份，用ELx808酶標(biāo)儀測(cè)定相對(duì)熒光量（RFU），計(jì)算RFU/OD600的值.

1.8 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT?qPCR)從平板上挑取K2044 和Kp∶Δfur的單菌落于15 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 過(guò)夜培養(yǎng).按1∶100 將菌株分別轉(zhuǎn)接于含F(xiàn)eSO4（終濃度為100 μmol/L）的LB培養(yǎng)基中至OD600為1.0，使用試劑盒裂解細(xì)菌后提取總RNA.通過(guò)分光光度計(jì)對(duì)RNA 進(jìn)行定量，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性.逆轉(zhuǎn)錄按PrimeScript?試劑盒要求操作，使RNA 轉(zhuǎn)化為cDNA.使用CFX96 Real?Time PCR 系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng)，以rho基因作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt計(jì)算fyuA基因的相對(duì)表達(dá)量.

1.9 數(shù)據(jù)處理每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3 次，應(yīng)用GraphPad Prism 8.0.1 軟件作圖，SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.定量資料以xˉ±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn).P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 突變株的構(gòu)建用PCR 篩選出無(wú)痕突變株.以突變株基因組DNA 作為模板，KP1_fur?A/D 為引物對(duì)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物大小為1 135 bp（圖1 泳道3），對(duì)應(yīng)的條帶低于以野生株為模板擴(kuò)增獲得的大小為1 590 bp（圖1 泳道1）的片段.以野生株基因組DNA 作為模板，內(nèi)引物對(duì)KP1_fur?RT?F/R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增時(shí)，得到大小為191 bp（圖1泳道4）的片段，而突變株無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物.結(jié)果(圖1)表明電泳結(jié)果符合預(yù)期，成功構(gòu)建突變株Δfur.

圖1 突變株Δfur 的PCR 鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of mutant strain Δfur by PCR

2.2 回補(bǔ)株的構(gòu)建以NTUH?K2044 和C?Δfur基因組DNA 為模板，KP1_fur?HB?KpnI?F/KP1_fur?HB?HindⅢ?R 為引物進(jìn)行驗(yàn)證.結(jié)果見(jiàn)圖2，以回補(bǔ)株作為模板的PCR 產(chǎn)物大小（泳道2）與野生株作為模板時(shí)產(chǎn)物大小一致，表明成功構(gòu)建回補(bǔ)株C?Δfur.

圖2 回補(bǔ)株C?Δfur 的PCR 鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of complementation strain C?Δfur by PCR

2.3 生長(zhǎng)曲線為了探究敲除fur基因是否對(duì)菌株的生長(zhǎng)速率產(chǎn)生影響，在有鐵和缺鐵環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)菌，通過(guò)測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的OD600值繪制生長(zhǎng)曲線（圖3）.結(jié)果顯示，2 種環(huán)境下3 株菌株的生長(zhǎng)趨勢(shì)整體一致，但不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的菌濃度（以O(shè)D600值計(jì)算）存在差異.通過(guò)t檢驗(yàn)可知，無(wú)論是有鐵環(huán)境還是缺鐵環(huán)境，野生株和回補(bǔ)株的生長(zhǎng)速度均快于突變株且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明fur基因?qū)?xì)菌的生長(zhǎng)具有一定影響.

圖3 不同環(huán)境下菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curves of strains under different environments

2.4 鐵載體生成能力測(cè)定

2.4.1 CAS 平板檢測(cè) 利用CAS 平板檢測(cè)野生株、突變株及回補(bǔ)株鐵載體生成量.從圖4 中可以看出，幾株菌均能產(chǎn)生橘黃色螯合圈，但是螯合圈直徑大小各異，表明鐵載體生成量有所差異.在藍(lán)色CAS 平板上能明顯看到Δfur菌株周圍的螯合圈最大，回補(bǔ)株C?Δfur產(chǎn)生的黃色螯合圈大小介于突變株Δfur與野生株WT 之間.在野生株中導(dǎo)入空質(zhì)粒構(gòu)建WT?vector 重組質(zhì)粒，所產(chǎn)生的螯合圈大小與野生株相同，排除質(zhì)粒所產(chǎn)生的影響.因此，實(shí)驗(yàn)表明fur與細(xì)菌鐵載體合成相關(guān).

圖4 CAS 平板檢測(cè)細(xì)菌產(chǎn)鐵載體的能力Fig.4 The ability of bacteria to produce siderophores detected by CAS plate

2.4.2 CAS 液體檢測(cè) 通過(guò)CAS 液體檢測(cè)對(duì)4株菌生成的鐵載體進(jìn)行定量分析，利用630 nm 處測(cè)得的吸光度計(jì)算鐵載體的相對(duì)形成量.結(jié)果見(jiàn)圖5，可以看出突變株生成的鐵載體多于野生株和回補(bǔ)株，而回補(bǔ)株低于突變株.結(jié)果與定性實(shí)驗(yàn)CAS 平板檢測(cè)結(jié)果一致，即Fur 會(huì)影響肺炎克雷伯菌鐵載體的形成.

圖5 鐵載體的相對(duì)形成量Fig.5 Relative content of siderophores

2.5 Fur 影響生物膜的形成生物膜的形成對(duì)肺炎克雷伯菌的生存及感染起重要作用.通過(guò)結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)計(jì)算分析，發(fā)現(xiàn)24、36 h 處野生株形成生物膜的量明顯多于突變株，培養(yǎng)至48 h 野生株與回補(bǔ)株形成生物膜的能力均強(qiáng)于突變株（圖6）.結(jié)果表明Fur 正向調(diào)控肺炎克雷伯菌生物膜的生成.

圖6 生物膜的相對(duì)形成量Fig.6 The relative amount of biofilm formation

2.6 Fur 通過(guò)作用于fyuA 啟動(dòng)子區(qū)域調(diào)控基因的表達(dá)Fur 作為鐵響應(yīng)調(diào)控因子，參與胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)并影響相關(guān)基因的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)通過(guò)改變環(huán)境中的鐵含量探索Fur 對(duì)fyuA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控.將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPROBE?fyuA分別電轉(zhuǎn)入Kp2044 與Kp：Δfur中，經(jīng)GFP 報(bào)告基因融合實(shí)驗(yàn)測(cè)定其相對(duì)熒光量并分析目的基因的表達(dá).結(jié)果如圖7，菌株在MM9 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，Kp2044/pPROBE?fyuA和Kp：Δfur/pPROBE?fyuA的熒光表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；添加100 μmol/L FeSO4至MM9 培養(yǎng)基中，在鐵充足條件下，Kp2044/pPROBE?fyuA與Kp：Δfur/pPROBE?fyuA相比熒光表達(dá)量顯著降低；添加250 μmol/L Dip 至MM9 培養(yǎng)基時(shí)，Kp2044/pPROBE?fyuA和Kp：Δfur/pPROBE?fyuA的熒光表達(dá)量雖有差異，但均高于有鐵環(huán)境下的表達(dá)量，表明鐵充足條件下Fur 抑制fyuA基因的表達(dá).提取細(xì)菌總RNA 通過(guò)RT-qPCR進(jìn)一步證明，在鐵充足環(huán)境中，F(xiàn)ur 負(fù)調(diào)控fyuA的表達(dá).

圖7 Fur 對(duì)fyuA 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控Fig.7 Transcriptional regulation offyuA by Fur

3 討論

Fur 作為病原菌中存在的整體調(diào)控子，在鐵代謝中扮演了重要角色.同時(shí)，不同菌株間Fur 發(fā)揮的功能不盡相同，比如：金黃色葡萄球菌fur基因的缺失使菌株表現(xiàn)出生長(zhǎng)缺陷和對(duì)H2O2的高敏性，生物膜的形成量也隨之增加[19]；銅綠假單胞菌fur的缺失使其生長(zhǎng)受損，生物膜的形成卻無(wú)影響[21]；而同屬革蘭氏陰性菌的霍亂弧菌敲除fur基因后，生物膜的形成增加，定殖能力減弱[20].本研究經(jīng)生長(zhǎng)曲線分析可知，fur基因的缺失使菌株的生長(zhǎng)受到抑制，表明Fur 影響K.pneumoniae的生長(zhǎng)增殖.通過(guò)對(duì)fur基因敲除株鐵載體的形成能力進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)Δfur突變株產(chǎn)生的螯合圈最大，fur基因的缺失使菌株鐵載體的分泌量增加，說(shuō)明Fur 影響肺炎克雷伯菌鐵的攝取，進(jìn)而對(duì)其毒力產(chǎn)生影響.

肺炎克雷伯菌生物膜的形成能力與耐藥性及致病性密切相關(guān)，且受多種調(diào)控因子及靶基因的影響[24].當(dāng)環(huán)境改變時(shí)，微生物可通過(guò)分泌、釋放一些特定的信號(hào)分子調(diào)控生理功能，這種適應(yīng)環(huán)境變化的交流機(jī)制稱群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）[25]，它貫穿K.pneumoniae生物膜形成的整個(gè)過(guò)程.Wu等[26]研究結(jié)果表明，37 ℃下培養(yǎng)肺炎克雷伯菌fur基因敲除株會(huì)減少生物膜的形成.本研究在37 ℃下培養(yǎng)野生株NTUH?K2044、突變株Δfur及回補(bǔ)株C?Δfur，3 株菌的生物膜形成量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；將溫度降至28 ℃，發(fā)現(xiàn)Fur 對(duì)K.pneumoniae生物膜的形成起正調(diào)控作用，與Wu 等[26]結(jié)果一致.溫度對(duì)生物膜的形成產(chǎn)生影響，猜測(cè)Fur 及群體感應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生的某些分子共同調(diào)控K.pneumoniae生物膜的形成.值得注意的一點(diǎn)，試管壁生物膜不斷加厚，使得生物膜的活性及粘附受到影響，外力作用下可引起其部分脫落丟失.這是實(shí)驗(yàn)中觀察到野生株生物膜形成量為不斷增加的過(guò)程，但實(shí)際測(cè)得36、48 h 處生物膜的生成量相對(duì)減少的原因.

本研究通過(guò)RT?qPCR 和GFP 報(bào)告基因融合實(shí)驗(yàn)明確了Fur 對(duì)fyuA的調(diào)控，鐵充足條件下Fur 抑制fyuA的表達(dá).Fur 可與其他調(diào)控因子共同作用影響菌株的生理活動(dòng)及代謝，如環(huán)磷酸腺苷受體蛋白（cAMP receptor protein，CRP）對(duì)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)、生物膜形成及毒力因子產(chǎn)生都有一定的調(diào)控作用[27].故培養(yǎng)基中加入鐵螯合劑Dip 造成鐵缺乏時(shí)，野生株與突變株之間fyuA的表達(dá)量存在差異.然而，F(xiàn)ur對(duì)fyuA的調(diào)控方式以及是否對(duì)K.pneumoniae的毒力產(chǎn)生影響需進(jìn)一步深入研究.因HPI 具有可移動(dòng)性，轉(zhuǎn)移過(guò)程會(huì)發(fā)生部分基因缺失或修飾，故不同菌株之間HPI 可能存在差異[14]，它在K.pneumoniae中轉(zhuǎn)移及功能也有待探索.

4 結(jié)論

本研究采用同源重組的基因敲除技術(shù)成功構(gòu)建突變株，并通過(guò)生長(zhǎng)曲線、CAS 檢測(cè)和結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌的生長(zhǎng)、鐵載體及生物膜的形成均與fur基因相關(guān).Fur 作為一個(gè)重要的調(diào)控因子，當(dāng)環(huán)境中的鐵充足時(shí)，F(xiàn)ur 負(fù)調(diào)控耶爾森菌素受體fyuA基因的表達(dá).這為后續(xù)深入探索Fur 在肺炎克雷伯菌中的功能和調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)并提供新思路.