蛋氨酸負(fù)荷對(duì)去卵巢大鼠氧化應(yīng)激的改變及葉酸對(duì)其的影響

田盼麗，尚 濤，李紅梅

近年血漿同型半胱氨酸(Hcy)的研究受到廣泛關(guān)注。多項(xiàng)研究表明血漿同型半胱氨酸水平升高可引起冠心病等動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管疾病，但其中發(fā)病機(jī)制尚未明確。我們研究在大鼠去勢(shì)后，血漿同型半胱氨酸水平升高是否可通過(guò)氧化應(yīng)激途徑發(fā)揮致動(dòng)脈粥樣硬化作用效應(yīng)及葉酸治療是否具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料：FA (folic acid,上海玉博生物科技有限公司)，F(xiàn)A純度>99%；Hcy ELISA 試劑盒：上海玉博生物科技有限公司，批號(hào)為CSB-E08896r；TAC、GSH-Px及MDA試劑盒:南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型建立：于蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院購(gòu)買(mǎi)健康SD大鼠32只，均為4月齡雌性鼠，體重220～260 g。在無(wú)菌條件下，OVX組、MET組、FA組實(shí)驗(yàn)大鼠被給予戊巴比妥鈉60 mg/kg腹腔注射麻醉后，雙側(cè)卵巢通過(guò)下腹正中切口被切除，以上3組的輸卵管及卵巢伴行血管被結(jié)扎，沖洗閉合傷口。其余8只保留卵巢，只切除相同大小的卵巢周?chē)窘M織，作為SHAM組。

1.2.2 分組及處理：①假手術(shù)組(SHAM組);②去勢(shì)組(OVX組);③蛋氨酸負(fù)荷組(MET組)：大鼠摘除卵巢后一周，使用蛋氨酸1 mg/(kg·d)灌胃;④葉酸治療組(FA組)：去卵巢+蛋氨酸灌胃，給予葉酸20 mg/(kg·d)腹腔注射。去勢(shì)1周后，SHAM、OVX組給予蒸餾水灌胃，剩余2組給予蛋氨酸灌胃，F(xiàn)A組給予葉酸干預(yù)治療，共持續(xù)9周。

1.2.3 血清同型半胱氨酸測(cè)定：以上干預(yù)10周后行腹主動(dòng)脈穿刺取血，分離血清，-20 ℃保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定。本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中同型半胱氨酸水平。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD)，計(jì)算樣品濃度，按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)具體操作。

1.2.4 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定均按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清Hcy水平：與SHAM組比較，OVX組血清同型半胱氨酸濃度顯著升高(P<0.05)；給予蛋氨酸灌胃，MET組的Hcy濃度進(jìn)一步升高(P<0.05)；葉酸治療可顯著降低血清Hcy濃度(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清Hcy水平

2.2 各組大鼠血清TAC、GSH-Px和MDA的變化：與SHAM組相比，OVX組血清TAC、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)，MDA濃度明顯升高(P<0.05)；給予蛋氨酸負(fù)荷，MET組血清TAC、GSH-Px活性進(jìn)一步降低(P<0.05)，而MDA濃度進(jìn)一步升高，葉酸治療可增強(qiáng)TAC、GSH-Px活性，降低MDA濃度(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清TAC、GSH-Px、MDA濃度的比較

3 討論

女性進(jìn)入更年期后，血漿雌二醇水平下降的同時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥(HHcy)[1-2]。大鼠去卵巢后給予蛋氨酸負(fù)荷，蛋氨酸在體內(nèi)通過(guò)腺苷轉(zhuǎn)移酶及甲基轉(zhuǎn)移酶等作用代謝為同型半胱氨酸而使血漿中同型半胱氨酸水平進(jìn)一步升高[3]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)HHcy是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可致動(dòng)脈粥樣硬化[4-5]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，摘除卵巢后雌性大鼠的血漿Hcy濃度升高，去卵巢大鼠給予蛋氨酸負(fù)荷9周，可充分誘導(dǎo)高同型半胱氨酸血癥。

抗氧化與促氧化之間的失衡可引起氧化應(yīng)激。TAC及GSH-Px是抗氧化的指標(biāo)，前者反映機(jī)體總的抗氧化能力；后者可以使氧化型谷胱甘肽轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型谷胱甘肽；MDA是氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，其水平上升說(shuō)明脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)。HHcy等因素可降低機(jī)體抗氧化作用，促進(jìn)氧化反應(yīng)的發(fā)生，損傷全身多處組織細(xì)胞[6]，通過(guò)多種途徑促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，并可抑制細(xì)胞內(nèi)的正常信號(hào)傳導(dǎo)及加快細(xì)胞的死亡和凋亡等。有實(shí)驗(yàn)表明[7]同型半胱氨酸可降低細(xì)胞內(nèi)GSH-Px的濃度，增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化物與H2O2的細(xì)胞損傷效應(yīng)。目前認(rèn)為[7]Hcy可能通過(guò)以下途徑誘導(dǎo)ROS生成：①Hcy結(jié)構(gòu)中的巰基活性較強(qiáng)，可氧化產(chǎn)生H2O2和O2-；②Hcy可能通過(guò)線粒體途徑、NADPH氧化酶途徑促進(jìn)活性氧生成；③Hcy降低超氧化物歧化酶及谷胱甘肽過(guò)氧化酶的數(shù)量和活性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠去卵巢后抗氧化指標(biāo)總抗氧化力、谷胱甘肽過(guò)氧化酶下降，而丙二醛升高，即去卵巢本身即可導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激的發(fā)生。切除卵巢的大鼠再給予蛋氨酸負(fù)荷后，血清總抗氧化力、過(guò)氧化酶谷胱甘肽的水平進(jìn)一步下降，而丙二醛進(jìn)一步升高，說(shuō)明蛋氨酸負(fù)荷加重了去卵巢大鼠的氧化應(yīng)激損傷。經(jīng)相關(guān)分析表明，大鼠血清同型半胱氨酸濃度與抗氧化物血清總抗氧化力、谷胱甘肽過(guò)氧化酶呈顯著負(fù)相關(guān)，與丙二醛呈顯著正相關(guān)。近年來(lái)，葉酸的研究及臨床使用受到了廣泛的關(guān)注，其作為一種新型的抗氧化劑，在顯著降低血漿Hcy水平的同時(shí)，也改善了機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與MET組大鼠比較，葉酸可顯著升高TAC、GSH-Px水平，顯著降低MDA水平，增強(qiáng)抗氧化體系能力，具有抗氧化作用。這與國(guó)內(nèi)學(xué)者蔣興亮等[8]發(fā)現(xiàn)血漿同型半胱氨酸水平升高的患者中，其超氧化物歧化酶水平低于正常對(duì)照組，血漿丙二醛水平則明顯高于正常對(duì)照組的結(jié)論一致。

綜上所述，本研究觀察了去勢(shì)大鼠給予蛋氨酸負(fù)荷后，血漿同型半胱氨酸及氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平的改變以及給予抗氧化劑葉酸后上述指標(biāo)的改變。結(jié)果表明去卵巢大鼠經(jīng)蛋氨酸負(fù)荷后血漿Hcy水平及氧化產(chǎn)物升高，抗氧化能力下降，葉酸可逆轉(zhuǎn)高同型半胱氨酸癥引起的氧化應(yīng)激損傷。同時(shí)也證明了去卵巢大鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生進(jìn)展中有氧化應(yīng)激的參與，故葉酸作為一種新型抗氧化劑可能為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供了一個(gè)新思路。