超聲輔助堿溶酸沉法提取雞腿菇蛋白質工藝優(yōu)化

李惟棟，王永霞，孫敏，王娜，韓春超*

山東中醫(yī)藥大學藥學院（濟南 250355）

雞腿菇（Coprinus comatus）學名毛頭鬼傘，屬真菌門、擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、鬼傘科、鬼傘屬。雞腿菇廣泛分布于世界各地，在我國主要產于北方各省[1]?，F代研究表明雞腿菇具有抗氧化[2]、降血糖[3]、減輕肝損傷[4]、抗腫瘤[5]、提高免疫力[6]等功效，且雞腿菇栽培容易，適應性廣，因此針對雞腿菇的開發(fā)和應用前景廣闊[7]。

雞腿菇干品中蛋白質含量占比11.8%～29.5%，其中氨基酸種類齊全，包含人體必需的8種氨基酸，值得強調的是，像雞腿菇這樣的蘑菇中的蛋白質也很容易消化，通常消化率在71%～90%。2 g蘑菇蛋白質等于1 g肉蛋白質。因此，在東歐的蘑菇有時被稱為“森林肉”[8]。

針對雞腿菇蛋白質提取的研究較少，試驗采用響應面優(yōu)化超聲波輔助堿溶酸沉法提取雞腿菇蛋白質的工藝，并測定雞腿菇蛋白質提取率和純度，為雞腿菇蛋白質功能性研究及保健食品的開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞腿菇子實體鮮品（徐州菇馨蘑菇農場）；考馬斯G-250（天津市科密歐化學試劑有限公司）；牛血清標準蛋白（北京奧科斯科技有限公司）；氫氧化鈉（NaOH）、鹽酸（HCI）、磷酸（H3PO4）、95%乙醇、硫酸銅（CuSO2·5H2O）、硫酸鉀（K2SO4）、硫酸（H2SO4）、對硝基苯酚（C6H5NO3）、乙酸鈉（CH3COONa·3H2O）、無水乙酸鈉（CH3COONa）、乙酸（CH3COOH）、37%甲醛（HCHO）、乙酰丙酮（C5H8O2）：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

WD-9415F型超聲波清洗器（北京六一生物科技有限公司）；EU-2000A紫外可見分光光度計（上海昂科拉儀器有限公司）；PHS-3C PH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；101型電熱鼓風干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；TDL-5-A旋轉離心機（上海安亭科學儀器廠）；FD-1A-50冷凍干燥機（杭州川一實驗儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

取新鮮雞腿菇置于40 ℃電熱鼓風干燥箱中烘干，烘干后將雞腿菇置于超高速多功能粉碎機中粉碎并過0.180 mm（80目）孔徑篩，將雞腿菇粉末保存于真空干燥器中備用。

1.3.2 雞腿菇蛋白質提取

取5 g雞腿菇粉末置于燒杯中，按照相應料液比（1∶10～1∶30 g/mL）加入蒸餾水溶解，用0.1 mol/L NaOH溶液調節(jié)雞腿菇溶液pH 9～13，將燒杯置于超聲中，選擇相應的超聲頻率0～200 W，恒溫30～70 ℃振蕩一定時間（20～100 min）。常溫下冷卻后離心10 min（4 000 r/min），取上清液，用0.1 mol/L HCl調節(jié)pH至等電點，在4 ℃靜置沉淀12 h后，離心10 min（4 000 r/min），取沉淀用蒸餾水溶解后用0.1 mol/L NaOH調至中性，使用超濾除去鹽和小分子雜質，最后用真空冷凍干燥機冷凍干燥得到雞腿菇蛋白質粉末。

1.3.3 雞腿菇蛋白質提取率測定

1.3.3.1 配制考馬斯亮藍溶液

取100 mg考馬斯亮藍G-250溶于50 mL 95%乙醇中，加100 mL 85%磷酸，加水稀釋至1 L，棕色瓶保存。

1.3.3.2 牛血清蛋白標準曲線繪制

用 標準的結晶牛血清白蛋白（BSA）配制成20 mg/100 mL的標準蛋白溶液，取6支試管，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL的標準蛋白質溶液，用水補足到1 mL，加入4 mL雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（20～25 ℃）下放置15 min，在595 nm處進行比色測定。用未加蛋白質溶液的第1支試管作為空白對照液，以蛋白質的含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.3.3 雞腿菇提取液蛋白含量測定

取2～3支試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質含量。

1.3.3.4 雞腿菇粉末蛋白質含量測定

采用GB 5009.5—2016凱氏定氮法測定雞腿菇粉末蛋白質含量。

1.3.3.5 雞腿菇蛋白質提取率計算

根據式（1）計算雞腿菇蛋白質提取率。

1.3.4 單因素試驗

雞腿菇蛋白提取工藝中，固定提取工藝條件：pH 11、提取溫度40 ℃、提取時間40 min、料液比1∶20 g/mL、超聲頻率50 W，每次單因素試驗取5 g雞腿菇粉末，分別考察pH（9，10，11，12和13）、提取溫度（30，40，50，60和70 ℃）、料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30 g/mL）、提取時間（20，40，60，80和100 min）、超聲頻率（0，50，100，150和200 W）這5個因素對雞腿菇蛋白質提取率的影響，選擇pH、提取溫度、提取時間、料液比、超聲頻率5個因素中最優(yōu)的水平進行后續(xù)的響應面試驗。

1.3.5 響應面優(yōu)化

在1.3.4單因素試驗的基礎上，運用軟件設計專家（Design-Expert 12）中的響應面優(yōu)化設計，以A（pH）、B（提取時間）、C（超聲頻率）、D（提取溫度）這4個單因素為自變量，以雞腿菇蛋白質提取率為響應值進行工藝條件優(yōu)化，相關試驗因素水平編碼見表1。

表1 響應面因素水平編碼

1.3.6 等電點測定

用移液槍吸取5組雞腿菇提取液（pH 11），每組10 mL。分別用0.1 mol/L鹽酸調節(jié)各組提取液pH至2.5，3.0，3.5，4.0和4.5，在4 ℃靜置2 h后，離心（4 000 r/min，10 min），取上清液。用移液槍吸取1 mL上清液，加入4 mL考馬斯亮藍溶液，振蕩混勻5 min后，在595 nm處測定吸光度，吸光度的最小值為雞腿菇蛋白質等電點。

1.3.7 雞腿菇蛋白質純度測定

將最優(yōu)條件下的雞腿菇提取液調節(jié)至雞腿菇蛋白質等電點，靜置1 h后離心取沉淀，將沉淀進行超濾后，冷凍干燥后得到雞腿菇蛋白質粉末。采用GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法測定雞腿菇蛋白質粉末的蛋白質含量。雞腿菇蛋白質純度根據式（2）計算。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 pH對雞腿菇蛋白質提取率的影響

固定提取時間40 min、超聲頻率50 W、提取溫度40 ℃、料液比1∶20 g/mL，不同pH對蛋白質提取率影響如圖1所示。隨著提取液pH不斷升高，蛋白質提取率呈現先上升后下降趨勢，其中在pH 9～12的范圍內，蛋白質提取率增幅明顯，pH 12時提取率達到最大的30.3%，這可能是因為在堿性環(huán)境中，蛋白質分子之間相互排斥，同時蛋白質分子的次級鍵被破壞，從而促進蛋白質溶解度增加[9-10]。pH繼續(xù)升高時，蛋白質提取率反而下降，這可能是由于過高的pH導致蛋白質過度水解和變性，從而降低了蛋白質溶解度[11]。因此，選擇pH 11，12和13進行后續(xù)的響應面優(yōu)化試驗。

圖1 pH對雞腿菇蛋白質提取率的影響

2.1.2 提取時間對雞腿菇蛋白質提取率的影響

固定提取pH 11、超聲頻率50 W、提取溫度40 ℃、料液比1∶20 g/mL，不同提取時間對蛋白質提取率影響如圖2所示。在一定范圍內，雞腿菇蛋白質提取率隨提取時間的延長，提取率呈上升趨勢，在60 min時提取率達到最大值27.31%，但是超過60 min后蛋白質提取率逐步下降，這可能是由于提取時間短，蛋白質溶出不充分，而時間過長導致蛋白質在堿溶液中過度水解和變性，從而使提取率降低，同時增加多余雜質溶出[12]。因此選擇提取時間40，60和80 min進行后續(xù)響應面優(yōu)化試驗。

圖2 提取時間對雞腿菇蛋白質提取率的影響

2.1.3 超聲頻率對雞腿菇蛋白質提取率的影響

如圖3所示，隨著超聲頻率增加，蛋白質提取率呈現先上升后下降趨勢，超聲頻率100 W時，蛋白質提取率達到最大值27.56%，這可能是因為隨著超聲頻率增大，空化作用和機械作用愈加強烈，分子擴散速度加快，促進蛋白質溶出[13]，同時超聲頻率過大，可能促進某些蛋白酶溶出或蛋白質變性，導致蛋白質提取率下降[14]。因此選擇超聲頻率50，100和150 W進行響應面優(yōu)化試驗。

圖3 超聲頻率對雞腿菇蛋白質提取率的影響

2.1.4 溫度對雞腿菇蛋白質提取率的影響

如圖4所示，隨著溫度升高，蛋白提取率也隨之增大，溫度超過40 ℃時，呈現明顯下降趨勢。溫度低于40 ℃時，溫度較低，反應速度較慢，隨著溫度的上升，分子間運動加劇，有效碰撞次數增多，反應速率的提升導致提取率的上升。40 ℃時蛋白提取率達到最高值，為24.76%，溫度超過40 ℃時，高溫會破壞蛋白質的空間構象，蛋白質疏水基團展開暴露，蛋白質變性使提取率下降[15-16]。因此選取30，40和50 ℃進行后續(xù)的響應面優(yōu)化試驗。

圖4 提取溫度對雞腿菇蛋白質提取率的影響

2.1.5 料液比對雞腿菇蛋白質提取率的影響

如圖5所示，隨著提取料液比中液體比例增加，蛋白質提取率不斷增大，在1∶25 g/mL后蛋白質提取率趨于平穩(wěn)。

圖5 料液比對雞腿菇蛋白質提取率的影響

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應面試驗設計及結果

根據單因素試驗結果，以影響雞腿菇蛋白提取率的提取液pH、提取時間、超聲頻率、提取溫度為自變量，以蛋白提取率為響應面的響應值，利用Box- Behnken共設計29組試驗，因素水平見表1，試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計方案及結果

2.2.2 響應面模型的建立及分析

Box-Behnken試驗設計及結果如圖1所示，利用Design-Expert 12.0進行二次多元回歸擬合，得到pH（A）、時間（B）、超聲頻率（C）和提取溫度（D）與響應值提取率（Y）的關系。多元二次回歸方程為：Y=29.68+3.43A-0.752 6B+3.03C+1.08D+2.52AB+ 0.540 4AC+1.5AD+1.3BC-1.03BD+1.19CD-3.85A2-1.95B2-4.18C2-4.94D2。

根據表3的方差分析結果可知，該響應面模型差異極顯著（p＜0.000 1），模型失擬項不顯著（p= 0.331 7＞0.05），說明試驗方法與設計可靠、合理，且其他未知因素對該試驗結果影響較小。方程模型的確定系數R2=0.941 5，模型擬合良好，模型成立。由p值可知：一次項A、C，二次項A2、B2、C2和D2和交互項AB對蛋白得率影響極顯著（p＜0.01）；一次項D的p值小于0.05，作用顯著；一次項B，交互項AC、AD、BC、BD、CD的p值大于0.05，交互作用不顯著。由F值可知各因素對蛋白提取率影響的大小為A＞C＞D＞B，即pH＞超聲頻率＞提取溫度＞提取時間。

表3 回歸模型方差分析結果

2.2.3 交互作用對蛋白提取率影響的響應面分析

響應面曲面和等高線共同反映各因素對雞腿菇蛋白質提取率的影響大小[17]。如圖6所示，pH與提取時間的交互作用顯著，其中pH的變化對雞腿菇蛋白質提取率影響最大。結合圖6可知，提取溫度、提取時間、超聲頻率兩兩之間的交互作用相對較小，提取率對超聲頻率改變的敏感程度大于提取溫度，提取率對提取時間改變的敏感程度最低。因此4個因素對雞腿菇蛋白質提取率影響次序為pH＞超聲頻率＞提取溫度＞提取時間。與方差分析結果一致。

圖6 各因素交互對雞腿菇蛋白提取率影響的響應面圖

2.2.4 最佳工藝驗證試驗

利用Desig-Expert 12.0軟件優(yōu)化回歸模型進行的工藝參數，確定提取雞腿菇蛋白質的最適工藝條件：pH 12.62、提取時間66.27 min、超聲頻率124.23 W、提取溫度42.31 ℃，預測蛋白質提取率為31.49%。為證明響應面優(yōu)化設計的合理性與可靠性，進行試驗驗證?？紤]到實際操作的可行性，將工藝條件修改為pH 12.6、提取時間66 min、超聲頻率125 W、提取溫度42 ℃。進行3次驗證試驗，得到的蛋白提取率為32.02%±0.35%。這與模型預測值的相對偏差為1.6%，說明該提取條件參數可靠，具有較好的可行性。

2.3 雞腿菇蛋白質等電點

如圖7所示，pH 3時，上清液的吸光度最低，為曲線的最低點，說明此時上清液中蛋白質含量最低。蛋白質處于等電點時，蛋白質分子所帶的正電荷與負電荷恰好相等，相同電荷間作用力抵消，因此極易發(fā)生碰撞而產生沉淀，導致蛋白質容易析出。所以pH 3為雞腿菇蛋白質等電點。

圖7 雞腿菇蛋白質等電點

2.4 雞腿菇蛋白質凍干粉含量測定

按照1.3.7的方法測定雞腿菇凍干粉中蛋白質含量，經過測定，蛋白質雞腿菇凍干粉末中蛋白質含量為84.51%。

3 結論

采用超聲輔助堿溶酸沉法提取雞腿菇蛋白質，并結合響應面優(yōu)化設計得到雞腿菇蛋白提取的最佳工藝，確定最佳提取工藝：pH 12.6、提取溫度42 ℃、提取時間66 min、超聲頻率125 W。在此條件下進行3次核對檢驗試驗，雞腿菇蛋白質提取率為32.02%± 0.35%，這與模型預測值的相對偏差為1.6%，說明該模型對試驗擬合程度較高，工藝合理可靠。同時經過試驗檢測雞腿菇蛋白質凍干粉含量為84.5%，說明經過該法提取的雞腿菇蛋白質含量占比較高，進一步純化成本低。該試驗結果可為雞腿菇提供利用途徑。