大柴胡湯治療結(jié)石性膽囊炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究及分子對(duì)接驗(yàn)證

張濤 周春宇 楊成城 張少輝 門(mén)斯燁 錢(qián)嘉惠 馬亦湘 安佳琳

摘要 目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法探討大柴胡湯治療膽囊炎（Cholecystitis）的作用機(jī)制。方法：通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）檢索相關(guān)文獻(xiàn)獲得大柴胡湯所含中藥的主要化學(xué)成分，收集其相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn);膽囊炎疾病靶點(diǎn)來(lái)源于GeneCards、在線(xiàn)人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳（OMIM）、PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)。結(jié)合Cytoscape 3.8.0構(gòu)建藥物-核心靶點(diǎn)-有效成分網(wǎng)絡(luò)、靶標(biāo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。利用Bioconductor中的R包對(duì)核心靶標(biāo)進(jìn)行基因本體（GO）富集和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路分析。結(jié)果：獲得大柴胡湯活性成分151個(gè)，藥物靶點(diǎn)260個(gè);疾病靶點(diǎn)485個(gè);交集基因55個(gè);PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，核心蛋白涉及TNF-α、CCK、EGFR、AKT1、VEGFA;GO富集分析得到2 307個(gè)GO條目。大柴胡湯包含細(xì)胞組分92個(gè)，生物過(guò)程2 126個(gè)，分子功能89個(gè)，主要有受體配體活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、磷酸酶結(jié)合等;KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)大柴胡湯主要涉及AGE-RAGE信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17信號(hào)通路以及HIF-1信號(hào)通路等。結(jié)論：通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，大柴胡湯多成分、多靶點(diǎn)調(diào)控機(jī)體，通過(guò)多途徑起到治療結(jié)石性膽囊炎的作用。

關(guān)鍵詞 大柴胡湯;膽囊炎;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);靶點(diǎn);蛋白;信號(hào)通路;分子對(duì)接

Abstract Objective：To explore the mechanism of Dachaihu Decoction in the treatment of cholecystitis based on network pharmacology and molecular docking.Methods：the main chemical constituents of Dachaihu Decoction were obtained from TCMSP and related literature，and the corresponding targets were collected; the targets of cholecystitis were from GeneCards，OMIM and PharmGKB databases.Combined with Cytoscape 3.8.0，the drug core target active component network was constructed，and the target protein interacted with PPI network.The r-packet of Bioconductor was used to enrich go and analyze KEGG pathway.Results：A total of 151 active components and 260 drug targets of Dachaihu Decoction were obtained; 485 disease targets were obtained; 55 intersection genes were obtained; PPI protein network analysis showed that core proteins involved TNF-α，CCK，EGFR，AKT1，VEGFA; and 2 307 go entries were enriched in go.There were 92 cell components，2 126 biological processes and 89 molecular functions，mainly including receptor ligand activity，cytokine activity，cytokine receptor binding，phosphatase binding，etc.; KEGG pathway enrichment analysis found that it mainly involved age-rage signaling pathway，interleukin-17 signaling pathway and HIF-1 signaling pathway.Conclusion：through the analysis of network pharmacology，Dachaihu Decoction has the effect of treating calculous cholecystitis by multi-component and multi-target regulation.

Keywords Dachaihu Decoction; Cholecystitis; Network pharmacology; Target; Protein; Signal pathway; Molecular docking

中圖分類(lèi)號(hào)：R285文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.01.011

隨著人們生活水平的不斷提高，結(jié)石性膽囊炎的發(fā)病也逐漸呈上升趨勢(shì)。據(jù)報(bào)道膽囊結(jié)石的患病率為10%～15%，且有逐年升高的趨勢(shì)。手術(shù)切除膽囊一直是治療本病的根本措施。手術(shù)雖有根治作用，但是由于術(shù)后體內(nèi)產(chǎn)生膽石的微環(huán)境并未改變，術(shù)后膽石復(fù)發(fā)率仍居高不下，難免存在諸多后遺癥，如膽管殘留結(jié)石、膽漏、膽管擴(kuò)張、肝外膽管損傷等，不易被患者接受。

中醫(yī)認(rèn)為結(jié)石性膽囊炎當(dāng)屬于中醫(yī)學(xué)“脅痛”“膽脹”“黃疸”等范疇，認(rèn)為其與肝膽氣郁有密切關(guān)系。以大柴胡湯為代表的處方治療結(jié)石性膽囊炎取得了良好的臨床療效。在實(shí)驗(yàn)研究中，大柴胡湯的藥理學(xué)研究也相對(duì)成熟。但是當(dāng)前針對(duì)大柴胡湯治療結(jié)石性膽囊炎的作用機(jī)制研究尚未清楚。故我們基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法探討大柴胡湯治療結(jié)石性膽囊炎的治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 大柴胡湯藥物化學(xué)成分收集及藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

登錄中藥系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）[1]（網(wǎng)址http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）。數(shù)據(jù)庫(kù)（Database）選擇TCMSPTM，設(shè)置搜索條目為Herb name。為篩選大柴胡湯的有效化學(xué)成分（Ingredients），在搜索條目下分別輸入大柴胡湯的藥物組成：柴胡、黃芩、大黃、枳實(shí)、半夏、白芍、生姜、大棗。設(shè)置篩選條件為口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類(lèi)藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18[2]。完整復(fù)制各中藥符合篩選條件的所有Ingredients于文本文檔中。為篩選大柴胡湯各中藥目標(biāo)靶點(diǎn)（Targets Information），在輸入界面選擇Related Targets，完整復(fù)制各中藥符合篩選條件的所有Targets information于文本文檔中。因甘草為佐使藥，所含有效化學(xué)成分多且復(fù)雜，為保證真實(shí)有效性，按OB≥60%篩選有效化學(xué)成分及靶點(diǎn)。數(shù)據(jù)庫(kù)所獲得的藥物有效化學(xué)成分及靶點(diǎn)信息應(yīng)用Drugbank[3]（https：//www.drugbank.ca/）使其格式標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 疾病靶點(diǎn)來(lái)源

登錄GeneCards人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)[4]（網(wǎng)址https：//www.genecards.org/）、在線(xiàn)人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，網(wǎng)址https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）數(shù)據(jù)庫(kù)[5]、國(guó)際遺傳藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（PharmGkb）（網(wǎng)址https：//www.pharmgkb.org），設(shè)置搜索條目為關(guān)鍵詞搜索。搜索條目下以“Cholecystitis、Calculous cholecystitis”為關(guān)鍵詞篩選，設(shè)置物種為人，獲取結(jié)石性膽囊炎相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。對(duì)3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行合并去重，作為最終的疾病靶點(diǎn)來(lái)源。

1.3 獲取交集基因與化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

選擇R軟件，安裝Draw Venn Diagrams程輯包，運(yùn)行以獲得交集基因靶點(diǎn)作為大柴胡湯治療結(jié)石性膽囊炎的潛在作用靶點(diǎn)并繪制韋恩圖。將獲取到的交集基因?qū)刖W(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape 3.8.0，構(gòu)建化學(xué)成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)。對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，以度值參數(shù)作為評(píng)價(jià)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中重要性的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 大柴胡湯治療結(jié)石性膽囊炎的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心蛋白篩選

人類(lèi)生命體蛋白質(zhì)之間存在著相互作用的直接或間接聯(lián)系。為觀察大柴胡湯治療結(jié)石性膽囊炎的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）以及篩選核心蛋白，登錄String數(shù)據(jù)庫(kù)（網(wǎng)址https：//string-db.org/），選擇Multiple proteins，在搜索條目下輸入獲取到的交集基因，限定物種為Homo Sapiens，其余設(shè)置保持不變，構(gòu)建PPI功能網(wǎng)絡(luò)，并繪制網(wǎng)絡(luò)圖。為篩選核心蛋白，將STRING數(shù)據(jù)庫(kù)得到的string_interactions.txt文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0，應(yīng)用Network Analyse插件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，選擇CytoNCA插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯Y選網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。核心蛋白篩選參數(shù)：Betweenness Centrality，Closeness Centrality，Degree Centrality，Eigenvector Centrality，Local Average Connectivity-based method。篩選條件：應(yīng)用R軟件的在線(xiàn)程輯包，對(duì)交集基因下的Betweennes Centrality、Closeness Centrality、Degree Centrality、Eigenvector Centrality、Local Average Connectivity-based method數(shù)值進(jìn)行測(cè)算，各組數(shù)值中大于本組中位值的基因予以保留，運(yùn)行2次R腳本，篩選核心蛋白基因。應(yīng)用CytoHubba插件計(jì)算構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)的Betweennes、Closeness、Degree、Eigenvector、LAC數(shù)值，并對(duì)計(jì)算過(guò)的數(shù)值基因進(jìn)行可視化處理。

1.5 基因本體和京都基因與基因組百科全書(shū)通路富集分析

基于R語(yǔ)言對(duì)獲取到的交集基因進(jìn)行富集分析。在R語(yǔ)言中Bioconductor（https：//www.bioconductor.org/）網(wǎng)站安裝所需要的Biocmanager，org.Hs.eg.db，Colorspace，Stringi，ggplot2，DOSE，ClusterProfiler，enrichplot，Pathview等程輯包。首先將基因Symbol轉(zhuǎn)化為基因ID，選擇物種為人（Homo spanies），設(shè)定閾值為P<0.05，輸出基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集結(jié)果并繪制條形圖與氣泡圖。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

登錄Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//zinc.docking.org/）查詢(xún)“1.3”中大柴胡湯關(guān)鍵成分結(jié)構(gòu)，保存格式選擇為mol并優(yōu)化結(jié)構(gòu)。登錄PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/），搜索“1.4”中篩選出的核心交集基因蛋白，下載核心蛋白的3D結(jié)構(gòu)，保存格式選擇PDB。使用PyMol軟件刪除蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的水分子和小分子配體，并導(dǎo)入AutoDockTools進(jìn)行加氫等預(yù)處理，將有效成分和核心蛋白均轉(zhuǎn)換成pdbqt格式文件。運(yùn)行AutoDockTools對(duì)有效成分和核心蛋白分別進(jìn)行對(duì)接，保存最低結(jié)合能數(shù)據(jù)作為分子對(duì)接的結(jié)果。結(jié)合能越低，表明活性成分與靶蛋白的結(jié)合力越強(qiáng)。一般認(rèn)為結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol的藥物分子與靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方化學(xué)成分及藥物靶點(diǎn)

本研究共收集大柴胡湯藥物化學(xué)成分151個(gè)，其中數(shù)據(jù)庫(kù)收集151個(gè);中藥預(yù)測(cè)靶點(diǎn)1 190個(gè)，合并去重后收集260個(gè)，通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)藥物靶基因進(jìn)行校正，使其名稱(chēng)格式標(biāo)準(zhǔn)化。大柴胡湯各中藥化學(xué)成分及預(yù)測(cè)靶點(diǎn)數(shù)量見(jiàn)表1。

2.2 疾病靶點(diǎn)的獲取

在GeneCards、OMIM-NCBI、PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Cholecystitis、Calculous chole-cystitis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，經(jīng)合并去重共獲得485個(gè)候選靶標(biāo)。

2.3 獲取復(fù)方-疾病交集基因

基于R語(yǔ)言3.6.0，在R語(yǔ)言中Bioconductor（https：//www.bioconductor.org/）網(wǎng)站安裝VennDiagram程輯包，運(yùn)行程序獲取交集基因并繪制韋恩圖。見(jiàn)圖1。共獲得復(fù)方-疾病交集基因55個(gè)，交集基因見(jiàn)表2。

2.4 構(gòu)建有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

運(yùn)用Cytoscape 3.8.0中Import Network插件構(gòu)建復(fù)方有效化學(xué)成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)。見(jiàn)圖2。復(fù)方有效化學(xué)成分見(jiàn)表3。網(wǎng)絡(luò)共有123個(gè)節(jié)點(diǎn)，357條邊。方形代表交集基因，三角形代表有效化學(xué)成分?；瘜W(xué)成分所屬藥物用顏色顯示，其中綠色代表柴胡，草綠色代表黃芩，淺紅色代表大黃，淺藍(lán)色代表大棗，深藍(lán)色代表半夏，紫色代表枳實(shí)，紅色代表白芍，生姜所含有效成分被共有化學(xué)成分所覆蓋。網(wǎng)絡(luò)中化合物與靶點(diǎn)的關(guān)系用每條邊來(lái)顯示。網(wǎng)絡(luò)圖說(shuō)明大柴胡湯治療結(jié)石性膽囊炎的過(guò)程是多成分、多靶點(diǎn)起效的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，這也與中藥作用的復(fù)雜性不謀而合。

2.5 核心PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心蛋白篩選

對(duì)交集基因初步構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖3。網(wǎng)絡(luò)圖包括57個(gè)節(jié)點(diǎn)，551條邊。節(jié)點(diǎn)代表蛋白質(zhì)，邊代表蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的作用關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)連接程度越高說(shuō)明蛋白質(zhì)之間關(guān)系越密切。篩選核心蛋白基因，核心蛋白見(jiàn)表4（按度值排列前20的蛋白）。篩選流程見(jiàn)圖4。計(jì)算構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)的Betweennes、Closeness、Degree、Eigenvector、LAC數(shù)值，按數(shù)值的大小進(jìn)行同心圓排列，數(shù)值越大顏色越深且位于中心位置。見(jiàn)圖5。

2.6 交集基因的GO功能富集分析

基于R軟件3.6.0對(duì)大柴胡湯治療結(jié)石性膽囊炎的55個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析。富集內(nèi)容包括細(xì)胞組分，生物過(guò)程，分子功能。富集條件為P≤0.05且Q≤0.05。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，富集到了2 307個(gè)GO條目。細(xì)胞組分92個(gè)，主要有膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、囊腔、胞質(zhì)小泡腔、小凹、質(zhì)膜筏、分泌顆粒腔、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶全酶復(fù)合物等。生物過(guò)程2 126個(gè)，主要涉及腺體發(fā)育、氧化應(yīng)激反應(yīng)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的正調(diào)控、對(duì)金屬離子的反應(yīng)、活性氧代謝過(guò)程、對(duì)活性氧的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)活性氧的反應(yīng)、對(duì)鎘離子的響應(yīng)等。分子功能89個(gè)，主要有受體配體活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、生長(zhǎng)因子活性、激素受體結(jié)合、抗氧化活性、蛋白酶結(jié)合、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合等。選取各排名前10的富集條目，繪制條形圖。見(jiàn)圖6。

2.7 交集基因的KEGG通路富集分析

基于R語(yǔ)言的“Pathview”在線(xiàn)程輯包，對(duì)交集基因進(jìn)行KEGG通路富集分析。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，55個(gè)復(fù)方-疾病交集基因共富集到了150條通路（P<0.05），主要涉及AGE-RAGE信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路。選取富集基因數(shù)目前20的通路進(jìn)行可視化處理，顏色表示通路富集到的數(shù)目，數(shù)目越大顏色越偏向紅色，數(shù)目越小則越偏向藍(lán)色。見(jiàn)圖7。各通路富集基因數(shù)目所占百分比見(jiàn)圖8。

2.8 分子對(duì)接分析

通過(guò)有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖顯示，槲皮素（MOL000098）、木犀草素（MOL000006）、柚皮素（MOL004328）、β-谷甾醇（MOL000358）是大柴胡湯治療結(jié)石性膽囊炎的有效化學(xué)成分。通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)分析，TNF-α、CCK、EGFR、AKT1、VEGFA是大柴胡湯治療結(jié)石性膽囊炎的核心蛋白。將有效化學(xué)成分與核心蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示，TNF-α與槲皮素、木犀草素、柚皮素;CCK與槲皮素、β-谷甾醇;EGFR與槲皮素、木犀草素;AKT1與槲皮素、木犀草素、柚皮素;VEGFA與槲皮素、木犀草素均有較好的結(jié)合活性。大柴胡湯中的槲皮素、木犀草素等核心有效成分能夠與TNF-α、CCK等核心蛋白發(fā)生相互作用，治療結(jié)石性膽囊炎。分子對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表5，圖9。

3 討論

中醫(yī)并無(wú)膽囊炎的記載，但根據(jù)其發(fā)作時(shí)引起右上腹劇烈疼痛，伴有黃疸等臨床特征，將其歸為“脅痛”“膽脹”“黃疸”等范疇，多因飲食不節(jié)，損傷脾胃，情志不暢，肝氣郁結(jié)，導(dǎo)致濕熱內(nèi)蘊(yùn)，肝膽?zhàn)鰷l(fā)病[6]。大柴胡湯是《傷寒雜病論》中表里雙解的代表方劑，具有和解少陽(yáng)，內(nèi)瀉熱結(jié)的作用[7-8]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，大柴胡湯復(fù)方能通過(guò)保肝、利膽、抗血小板聚集、抑制離體平滑肌來(lái)治療膽石癥[9]。黃敏等[10]發(fā)現(xiàn)大柴胡湯能調(diào)整黃疸大鼠MRP2蛋白的表達(dá)，加速膽汁和膽紅素的排泄，促進(jìn)膽汁的排出，改善黃疸癥狀的功效。徐迎濤和孫雪萍[11]發(fā)現(xiàn)加味大柴胡湯可明顯降低血漿WBC數(shù)目及膽囊局部TNF-α含量。在臨床上大柴胡湯被廣泛應(yīng)用于膽囊炎的治療。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法[12]，研究大柴胡湯治療膽囊炎的作用機(jī)制。結(jié)果表明，槲皮素（MOL000098 quercetin）、β-谷甾醇（MOL000358 beta-sitosterol）、木犀草素（MOL000006 luteolin）、柚皮素（MOL004328 naringenin）等是其主要的化學(xué)成分。既往的研究表明，槲皮素是一種能夠有效抑制腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素等炎癥介質(zhì)表達(dá)的黃酮類(lèi)化合物，在抗氧化、消炎鎮(zhèn)痛等方面療效顯著[13-15]。劉威良等[16]、肖志彬等[17]發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇具有類(lèi)激素樣抗炎的作用并能夠降低機(jī)體內(nèi)腫瘤壞死因子水平。木犀草素能調(diào)控炎癥反應(yīng)，抑制IL-6、IL-1B、TNF-α等炎癥介質(zhì)的表達(dá)[18]。柚皮素作為一種黃烷酮類(lèi)物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗炎及抗氧化作用。邱琦等[19]研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素可以激活P13K/AKT信號(hào)通路，增加SOD的活性，提高細(xì)胞的增殖率。在大柴胡湯的主要化學(xué)成分里，槲皮素主要來(lái)源于柴胡、大棗。β-谷甾醇主要來(lái)源于大黃、黃芩、半夏、白芍、大棗、生姜。木犀草素、柚皮素主要來(lái)源于枳實(shí)。這說(shuō)明，大柴胡湯可能是通過(guò)多味中藥中的槲皮素，β-谷甾醇，木犀草素，柚皮素等主要化學(xué)成分來(lái)限制腫瘤壞死因子等炎癥介質(zhì)的高表達(dá)，降低膽囊局部炎癥反應(yīng)，增加膽囊收縮運(yùn)動(dòng)來(lái)達(dá)到治療膽囊炎的目的。

核心蛋白篩選結(jié)果顯示，TNF-α（腫瘤壞死因子）、CCK（膽囊收縮素）、EGFR（表皮生長(zhǎng)因子受體）、AKT1（AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1）、VEGFA（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A）的Degree值較大，在網(wǎng)絡(luò)中連接程度較高。TNF-α是一種多態(tài)性激素，是機(jī)體炎癥及免疫反應(yīng)與增強(qiáng)單核細(xì)胞活力的重要調(diào)節(jié)因子，參與機(jī)體多種局部和全身的炎癥反應(yīng)[20]。當(dāng)機(jī)體局部TNF-α含量增加時(shí)，可以刺激機(jī)體分泌IL-1，IL-6等炎癥介質(zhì)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，也可作為內(nèi)源性致熱源引起發(fā)熱[21]。當(dāng)結(jié)石性膽囊炎發(fā)病時(shí)，機(jī)體內(nèi)TNF-α含量升高，膽囊局部發(fā)生炎癥反應(yīng)，引起發(fā)熱。膽囊局部的炎癥反應(yīng)是引起膽囊炎發(fā)病的重要基礎(chǔ)，當(dāng)膽囊炎發(fā)生時(shí)，機(jī)體釋放大量的TNF-α，引起發(fā)熱，膽囊局部滲出增多，發(fā)生右上腹疼痛。CCK作為一種人體分泌的腦腸肽激素，能促進(jìn)膽囊的收縮運(yùn)動(dòng)以利膽，促進(jìn)膽汁排泄;降低食管括約肌張力，抑制胃排空[22]。機(jī)體內(nèi)的CCK含量降低，導(dǎo)致膽囊運(yùn)動(dòng)功能障礙，膽汁排泄障礙，淤積于膽囊內(nèi)易形成結(jié)石，導(dǎo)致結(jié)石性膽囊炎發(fā)病。大柴胡湯中的有效化學(xué)成分可以作用于機(jī)體中CCK受體，調(diào)節(jié)膽囊的收縮運(yùn)動(dòng)，達(dá)到治療結(jié)石性膽囊炎的目的。EGF是EGFR主要配體之一，能夠刺激周?chē)窠?jīng)修復(fù)和再生[23]。另外，Daniela M[24]研究發(fā)現(xiàn)EGFR可以通過(guò)促進(jìn)配體EGF的高表達(dá)來(lái)促進(jìn)血管淋巴管的再生，刺激周?chē)窠?jīng)的修復(fù)和再生。當(dāng)結(jié)石性膽囊炎發(fā)病時(shí)，會(huì)造成膽囊局部發(fā)生炎性病變，局部淋巴管及血管通透性受阻。大柴胡湯通過(guò)作用于EGFR以介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，修復(fù)受損的周?chē)窠?jīng)及血管來(lái)達(dá)到治療結(jié)石性膽囊炎的目的。AKT又稱(chēng)PKB（Protein Kinase B），是絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞的生長(zhǎng)及凋亡中起到重要作用。AKT1作為AKT的亞型之一，廣泛表達(dá)于人體各個(gè)組織，參與了細(xì)胞的成活及生長(zhǎng)調(diào)控[25]。AKT1可能是通過(guò)提高細(xì)胞因子活性促進(jìn)膽囊局部病變細(xì)胞的凋亡來(lái)達(dá)到治療膽囊炎的目的。VEGFA是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的一個(gè)亞型，通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞遷移并抑制凋亡，在血管生成及內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)中扮演著重要角色[26]。結(jié)石性膽囊炎發(fā)病時(shí)導(dǎo)致膽囊系統(tǒng)發(fā)生炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)局部缺血缺氧，甚者出現(xiàn)微血管血栓形成，發(fā)生微循環(huán)障礙。VEGFA能促進(jìn)血管生成，從而改善膽囊炎癥時(shí)的局部缺血缺氧狀態(tài)，以緩解疼痛，抑制炎癥，達(dá)到治療疾病的目的。

交集基因KEGG通路富集分析，其通路主要包括AGE-RACE信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17信號(hào)通路等。既往的研究表明，楊超茅等[27]發(fā)現(xiàn)AGE-RACE信號(hào)通路能夠激活逆轉(zhuǎn)錄因子核因子κB（Nuclear Factor-κB），從而使得細(xì)胞核表達(dá)和釋放大量的黏附因子、生長(zhǎng)因子、炎癥介質(zhì)（白細(xì)胞介素-6，腫瘤壞死因子-α）等，從而導(dǎo)致機(jī)體損傷。核因子κB又可以增強(qiáng)AGE-RACE信號(hào)通路的表達(dá)，使得該通路能夠持久作用于細(xì)胞[28]。HIF-1是介導(dǎo)機(jī)體對(duì)缺氧環(huán)境適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活因子，能夠隨著細(xì)胞中氧濃度的變化而改變基因表達(dá)[29]。局部炎癥反應(yīng)是膽囊炎病變的基礎(chǔ)，有效地控制炎癥對(duì)治療膽囊炎具有明顯的促進(jìn)作用。在膽囊炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中會(huì)釋放大量的炎癥介質(zhì)，IL-17信號(hào)通路能夠調(diào)控IL-4、IL-6、TNF-α、COX2等炎癥介質(zhì)，阻斷IL-17信號(hào)通路能夠有效抑制炎癥介質(zhì)的釋放，達(dá)到治療疾病的目的。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，分析大柴胡湯治療膽囊炎的機(jī)制。結(jié)果顯示，大柴胡湯治療膽囊炎主要是通過(guò)槲皮素、β-谷甾醇等多種潛在化學(xué)成分作用于腫瘤壞死因子、膽囊收縮素、表皮生長(zhǎng)因子受體、AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1等基因，從而調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能以及多條通路來(lái)達(dá)到治療目的。本研究為后續(xù)進(jìn)一步探討機(jī)制和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供支持，同時(shí)，本研究也為中藥及其復(fù)方治療某種疾病的機(jī)制分析提供了研究方法。

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（2020-12-09收稿 本文編輯：楊燕）