補(bǔ)腎益肺消癥方對肺纖維化上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中瘦素相關(guān)因子的影響

金譯涵 張迪 賀晉芳 鄭佳昆 李金桐 張亞楠 宋潔 晏軍

摘要 目的：明確肺纖維化上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）對瘦素相關(guān)因子的影響，對瘦素加速EMT的分子機(jī)制進(jìn)行初探，并觀察補(bǔ)腎益肺消癥方對EMT過程中瘦素相關(guān)因子的作用。方法：將A549細(xì)胞根據(jù)干預(yù)手段不同分為正常組、模型組[轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）]、中藥組（TGF-β1+補(bǔ)腎益肺消癥方）、尼達(dá)尼布組（TGF-β1+尼達(dá)尼布），免疫熒光觀察α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、E-鈣黏附蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測細(xì)胞上清中的瘦素水平，Western Blotting檢測瘦素受體（LEPR）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）的蛋白含量以及STAT3的活化程度。結(jié)果：與正常組比較，模型組細(xì)胞上清中瘦素水平升高（P<0.01），中藥組、尼達(dá)尼布組出現(xiàn)不同程度的下降（P<0.001）;與正常組比較，模型組LEPR蛋白表達(dá)升高（P<0.001），PPAR-γ表達(dá)下降（P<0.05），STAT3活化水平降低，中藥組、尼達(dá)尼布組LEPR蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.001），PPAR-γ表達(dá)上調(diào)（P<0.05），中藥組STAT3活化程度與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），尼達(dá)尼布組與模型組比較，STAT3活化水平升高（P<0.01）。結(jié)論：EMT可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)源性肺瘦素的分泌，增加細(xì)胞表面LEPR的表達(dá)，下調(diào)與瘦素有拮抗作用的PPAR-γ的含量，減少STAT3的活化，為瘦素加速EMT進(jìn)程提供物質(zhì)基礎(chǔ)。而補(bǔ)腎益肺消癥方則可能通過降低內(nèi)源性肺瘦素分泌，減少LEPR，提高PPAR-γ的水平逆轉(zhuǎn)此過程。

關(guān)鍵詞 補(bǔ)腎益肺消癥方;肺纖維化;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;瘦素;A549細(xì)胞;瘦素受體;過氧化物酶體增殖物激活受體γ;轉(zhuǎn)化生長因子-β1

Abstract Objective：To clarify the effect of epithelial mesenchymal transition（EMT） on leptin-related factors in pulmonary fibrosis，explore the molecular mechanism of leptin accelerating EMT，and observe the effects of Bushen Yifei Xiaozheng Formula on leptin-related factors in the process of EMT.Methods：A549 cells were divided into a control group，a model group（TGF-β1），a Chinese medicinal group（TGF-β1+Bushen Yifei Xiaozheng Formula），and Nintedanib group（TGF-β1+Nintedanib） according to different intervention methods.The expressions of α-smooth muscle actin（α-SMA） and E-cadherin were observed by immunofluorescence.The leptin level in cell supernatant was detected by ELISA，and the protein content of LEPR，PPAR-γ and the activation degree of STAT3 were detected by Western blot.Results：Compared with control group，leptin level in cell supernatant of model group was increased（P<0.01），and decreased in Chinese medicine group and Nintedanib group（P<0.001）.Compared with control group，the expression of LEPR protein in model group was increased（P<0.001），the expression of PPAR-γ was decreased（P<0.05），the activation level of STAT3 was decreased，the expression of LEPR protein in Chinese medicine group and Nintedanib group was down-regulated（P<0.001），and the expression of PPAR-γ was up-regulated（P<0.05）.The activation level of STAT3 in Chinese medicinal group was not significantly different from that in model group（P>0.05），but the activation level of STAT3 in Nintedanib group was increased compared with that in model group（P<0.01）.Conclusion：This study confirmed that EMT can promote the secretion of endogenous lung leptin，increase the expression of LEPR on the cell surface，down-regulate the content of PPAR-γ，which has the antagonistic effect of leptin，and reduce the activation of STAT3，providing material basis for leptin to accelerate the process of EMT.However，Bushen Yifei Xiaozheng Formula may reverse this process by reducing endogenous leptin secretion，reducing LEPR and increasing PPAR-γ level.

Keywords Bushen Yifei Xiaozheng Formula; Pulmonary fibrosis; Epithelial mesenchymal transition; Leptin; A549 cell; LERP; PPAR-γ; TGF-β1

中圖分類號：R289.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.01.013

肺纖維化是慢性肺部疾病的基本病理過程或是最終轉(zhuǎn)歸，由肺部損傷過度修復(fù)形成細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）堆積，阻礙肺泡毛細(xì)血管屏障氣血交換，并導(dǎo)致肺順應(yīng)性下降，引發(fā)限制性通氣障礙，出現(xiàn)肺換氣和肺通氣功能雙重癱瘓，不可逆轉(zhuǎn)，從而對患者生命健康構(gòu)成威脅[1]。

瘦素是一種由ob基因編碼，產(chǎn)生于脂肪組織，具有降低食欲、增加機(jī)體能耗、在固定范圍內(nèi)維持脂肪量穩(wěn)定的激素[2]。近年來已被證實(shí)在肝纖維化、腎纖維化中發(fā)揮重要作用。瘦素可與瘦素受體（Leptin Receptor，LEPR）結(jié)合后，激活肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)庫普弗細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）的合成，加速ECM沉積[3-4];在腎纖維化中，瘦素刺激腎內(nèi)皮細(xì)胞增殖，上調(diào)系膜細(xì)胞表面TGF-β Ⅱ型受體，使得Ⅳ型膠原和纖維連接蛋白表達(dá)增加[5]。與此同時，瘦素因高度參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial Mesenchymal Transformation，EMT），是一種驅(qū)動EMT的關(guān)鍵生物分子[6]。眾所周知，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（Alveolar Type Ⅱ Cell，AT Ⅱ）EMT是肺纖維化早期的基本病理過程之一，Gui等[7]研究表明瘦素通過抑制自噬，通過PI3K/AKT/mTOR途徑加速A549細(xì)胞的EMT，促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展。而瘦素與AT Ⅱ EMT的具體關(guān)系尚未完全清楚，且以往研究多著重于瘦素加重EMT的分子機(jī)制，EMT對瘦素的分泌和瘦素相關(guān)因子表達(dá)的影響不甚明晰。本研究旨在明確EMT對瘦素相關(guān)因子的影響，對瘦素加速EMT的分子機(jī)制進(jìn)行初探，并觀察補(bǔ)腎益肺消癥方對EMT過程中瘦素相關(guān)因子的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

A549細(xì)胞，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫提供。

1.1.2 試劑與儀器

重組人TGF-β1活性蛋白（Abcam公司，美國，貨號：ab50036）;尼達(dá)尼布（BIBF1120）（Medchem Express，美國，貨號：14002）;蛋白質(zhì)常規(guī)分子量標(biāo)記（10～180 kDa）（Proteintech，貨號：PL00001）;LEPR多克隆抗體（Proteintech，貨號：20966-1-AP）;PPARγ單克隆抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab178860）;p-STAT3單克隆抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab76315）;STAT3單克隆抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab68153）;山羊抗小鼠IgG H&L（HRP）（Abcam公司，美國，貨號：ab6789）;山羊抗兔IgG H&L（HRP）（Abcam公司，美國，貨號：ab6721）;BCA試劑盒（Thermo公司，美國，貨號23227）;α-SMA（Abcam公司，美國，貨號：ab124964）;CD324（E-cadherin）單克隆抗體（eBioscience公司，美國，貨號：Cat.53-3249-80）;人瘦素ELISA試劑盒（FineTest公司，貨號：EH0216）。

倒置相差顯微鏡（OLYMPUS公司，日本，型號：BX60）;二氧化碳培養(yǎng)箱（SANYO公司，日本，型號：MCO-5M）;垂直層流潔凈工作臺（ESCO公司，新加坡，型號：ACB-6E1）;低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司，德國，型號：5424）（離心半徑為8.46 cm）;全自動連續(xù)光譜酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國，型號：MULTISKANMK3）;電泳儀（北京六一公司，型號：DYCZ-25D）;電轉(zhuǎn)儀（北京六一公司，型號：DYCZ-40D）;倒置熒光顯微鏡（Nikon公司，日本，型號：Eclipse Ti-SR）;全景掃描儀（3D HISTECH公司，匈牙利，型號：PannoramicMIDI）。

1.2 方法

1.2.1 中藥凍干粉的制備

將飲片（補(bǔ)腎益肺消癥方，內(nèi)含當(dāng)歸、熟地黃、陳皮、法半夏、浙貝母、水蛭、炙甘草）置于雙蒸水中，充分浸泡，納入煎藥壺中煎煮至沸騰，并持續(xù)30 min后倒出藥液，重復(fù)以上操作得到二煎。合并2次藥液過濾后上鍋濃縮。將放涼至室溫的藥液加入無菌培養(yǎng)皿中，平放于-20 ℃ 24 h后，轉(zhuǎn)移至-80 ℃繼續(xù)冷凍24 h。迅速從低溫冰箱中取出培養(yǎng)皿，置于真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥。當(dāng)水分完全蒸發(fā)后，收集凍干粉密封保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分組及造模、給藥

收集對數(shù)生長期A549細(xì)胞，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，換成基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓過夜。棄基礎(chǔ)培養(yǎng)基，不同組別加入不同藥物。正常組：基礎(chǔ)培養(yǎng)基;模型組：TGF-β1（終濃度為5 ng/mL，下同）;中藥組：TGF-β1+中藥凍干粉溶液（終濃度為200 μg/mL）;尼達(dá)尼布組：TGF-β1+尼達(dá)尼布（終濃度為3 μmol/L），作用24 h。

1.2.3 免疫熒光檢測細(xì)胞中α-SMA、E-cadherin表達(dá)情況

取出指數(shù)生長期的A549細(xì)胞，消化后將細(xì)胞懸液種在激光共聚焦培養(yǎng)皿中。干預(yù)后，棄上清液，磷酸鹽緩沖液（Phosphate-buffered Saline，PBS）清洗3次。取用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS清洗3次。5%BSA封閉細(xì)胞1 h后，更換封閉液為E-鈣黏附蛋白（E-cadherin）一抗，室溫孵育1 h。隨后PBS清洗3次。0.1%TritonX100透膜15 min，PBS清洗3次。孵育α-平滑肌肌動蛋白（α-Smooth Muscle Actin，α-SMA）一抗，室溫孵育1 h，PBS清洗3次。加入TRITC熒光二抗避光孵育1 h。PBS清洗3次后加入DAPI染核，5 min后取出，PBS清洗，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。利用Image J軟件測算熒光密度值。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測細(xì)胞上清液中瘦素含量

樣品制備同前。收集細(xì)胞上清液，離心除去不溶性雜質(zhì)和細(xì)胞碎片后備用。將標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、對照（空白）孔分別置于預(yù)涂板上，記錄其位置。在加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和對照（空白）孔之前，清洗預(yù)涂板2次。分別從0管、1管、2管、3管、4管、5管、6管及空白管中取出100 μL液體，加入標(biāo)準(zhǔn)孔中。向樣品孔中加入100 μL適當(dāng)稀釋過的樣品。37 ℃孵育90 min。棄板中液體，用洗滌緩沖液清洗2次。在標(biāo)準(zhǔn)、樣品及對照（空白）孔每孔加入100 μL生物素標(biāo)記抗體工作液。37 ℃孵育60 min。用洗滌緩沖液清洗孔板3次。在標(biāo)準(zhǔn)、樣品及對照（空白）孔每孔加入100 μL SABC工作液，37 ℃孵育30 min。用洗滌緩沖液清洗孔板5次。在標(biāo)準(zhǔn)、樣品及對照（空白）孔每孔加入90 μL TMB底物。37 ℃避光孵育10～20 min。然后每孔加入50 μL停止溶液。將孔板置于酶標(biāo)儀中，波長設(shè)定為450 nm，測量OD值。再根據(jù)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出樣品濃度。

1.2.5 Western Blotting檢測細(xì)胞中LEPR、PPAR-γ、STAT3、p-STAT3表達(dá)水平

取出干預(yù)后的細(xì)胞，提取并變性蛋白樣品。配制SDS-PAGE凝膠。上樣后，于電泳液中電泳，電壓值設(shè)定為70 V，穩(wěn)壓電泳30 min，直至溴酚藍(lán)提示蛋白樣品已經(jīng)越過積層膠，將電壓改為110 V，繼續(xù)穩(wěn)壓電泳。隨后取出凝膠，制作電轉(zhuǎn)三明治，于電轉(zhuǎn)液中穩(wěn)流冰上電轉(zhuǎn)2 h，電流值設(shè)定為200 mA。TBST中漂洗后在合適的封閉液中室溫封閉1 h。隨后更換目標(biāo)蛋白一抗4 ℃孵育過夜。TBST清洗3次，室溫孵育對應(yīng)二抗1 h。TBST漂洗清除多余抗體，在避光的情況下，將充分浸泡過曝光液的PVDF膜置于發(fā)光儀中曝光，獲得條帶。應(yīng)用Image J軟件獲得曝光后條帶上各樣品的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布并通過方差齊性檢驗，則適用單因素方差分析，反之則采用非參數(shù)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎益肺消癥方對肺纖維化EMT模型α-SMA、E-cadherin表達(dá)量的影響

模型組的α-SMA含量明顯高于正常組（P<0.05），而E-cadherin則相反（P<0.05），TGF-β1干預(yù)A549細(xì)胞制作EMT模型成功。中藥組及尼達(dá)尼布組α-SMA表達(dá)量低于模型組（P<0.05），E-cadherin較之增高（P<0.05）。見表1，圖1～2。

2.2 補(bǔ)腎益肺消癥方對肺纖維化EMT模型細(xì)胞上清中瘦素含量的影響

模型組細(xì)胞上清液瘦素含量高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。中藥組與模型組比較，細(xì)胞上清所含瘦素較低（P<0.01），尼達(dá)尼布組亦然（P<0.01）。補(bǔ)腎益肺消癥方可降低AT Ⅱ因EMT釋放的瘦素水平。見表2。

2.3 補(bǔ)腎益肺消癥方對肺纖維化EMT模型LEPR及PPAR-γ蛋白表達(dá)量、p-STAT3/STAT3比值的影響 模型組PPAR-γ表達(dá)水平明顯低于正常組（P<0.05）。而中藥組（P<0.05）、尼達(dá)尼布組（P<0.05）與模型組比較，PPAR-γ表達(dá)水平升高。見表3，圖3。

正常組LEPR蛋白相對表達(dá)量明顯低于模型組（P<0.001）。與模型組比較，中藥組、尼達(dá)尼布組LEPR蛋白含量有所降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。見表4，圖4。

模型組p-STAT3/STAT3比值明顯低于正常組（P<0.01）。而與模型組比較，尼達(dá)尼布組p-STAT3/STAT3比值較高（P<0.01），中藥組p-STAT3/STAT3比值與模型組相當(dāng)（P>0.05）。見表5，圖5。

3 討論

EMT是肺纖維化病理演變中的重要一環(huán)，是AT Ⅱ因各種原因引起的肺部損傷而出現(xiàn)細(xì)胞連接斷裂（E-cadherin減少），出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞表型（α-SMA增加），進(jìn)一步影響下游成纖維細(xì)胞增殖，分化為肌成纖維細(xì)胞的過程[8]。研究證實(shí)瘦素可加速EMT，以促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。

晏軍主任醫(yī)師依據(jù)多年臨床經(jīng)驗，基于“肺絡(luò)微型癥瘕”的學(xué)說，認(rèn)為肺纖維化的基本病機(jī)為肺腎兩虛，痰瘀互結(jié)為癥瘕，痹阻肺絡(luò)，治療肺纖維化應(yīng)以補(bǔ)益肺腎為本，自擬補(bǔ)腎益肺消癥方，包含當(dāng)歸、熟地黃、陳皮、法半夏、浙貝母、水蛭、炙甘草7藥。該方以景岳名方“金水六君煎”為底方，當(dāng)歸、熟地黃為君滋陰養(yǎng)血，補(bǔ)腎培元;陳皮、半夏、浙貝母化痰止咳;水蛭、浙貝散結(jié)消癥;炙甘草培土生金，調(diào)和諸藥，以奏補(bǔ)腎益肺、化痰消癥之功。基礎(chǔ)實(shí)驗表明“補(bǔ)腎益肺消癥方”可通過調(diào)控炎癥[9-10]、凋亡[11-13]、自噬[14]通路以延緩肺纖維化病理學(xué)發(fā)展，從而達(dá)到治療的目的。

瘦素作為一種參與甚至可以調(diào)節(jié)先天性及適應(yīng)性免疫，自身分子結(jié)構(gòu)與IL-6相似的細(xì)胞因子[15]，硅沉著病大鼠肺纖維化組織中瘦素的表達(dá)明顯升高，外源瘦素的添加可以增加膠原蛋白在肺組織中的沉積，瘦素與HIF-1α正相關(guān)[16]。使用博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺損傷，模型組小鼠支氣管灌洗液中瘦素含量高于db/db組（瘦素受體基因缺陷）。在體外實(shí)驗中，瘦素可上調(diào)人肺成纖維細(xì)胞通過TGF-β介導(dǎo)產(chǎn)生的幾種纖維化基因的表達(dá)，并能誘導(dǎo)TGF-β本身的自分泌[17]。由此可見瘦素與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。由于在肝纖維化中發(fā)現(xiàn)，活化的肝星狀細(xì)胞可自分泌瘦素以進(jìn)一步加重肝損傷及肝纖維化[18]，而AT Ⅱ被證實(shí)是肺瘦素的來源之一，因此本研究用ELISA法檢測細(xì)胞上清液中瘦素的含量以觀察TGF-β1誘導(dǎo)下，A549細(xì)胞瘦素分泌情況。結(jié)果提示模型組細(xì)胞上清液瘦素明顯高于正常組，可見EMT可能促進(jìn)AT Ⅱ自分泌瘦素。而中藥組、尼達(dá)尼布組低于模型組，表明補(bǔ)腎益肺消癥方及尼達(dá)尼布可抑制EMT中自分泌瘦素水平。LEPR是分布于細(xì)胞表面的瘦素受體，AT Ⅱ表面也存在它的蹤影，肺瘦素通過與LEPR結(jié)合方可影響細(xì)胞功能。PPAR-γ是Smad依賴性的TGF-β通路的關(guān)鍵抑制劑，功效包括抑制TGF-β表達(dá)、膠原蛋白合成、成肌纖維細(xì)胞分化和EMT[17]。瘦素與PPAR-γ則在功效上相互拮抗[19]。Western Blotting檢測模型組LEPR水平高于正常組，可知EMT可導(dǎo)致A549細(xì)胞表面LEPR表達(dá)增多，更多瘦素可與之結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng);PPAR-γ水平下降，可見EMT抑制了PPAR-γ的功能，為肺瘦素進(jìn)一步干預(yù)AT Ⅱ功能提供幫助。而補(bǔ)腎益肺消癥方可降低EMT模型中細(xì)胞表面LEPR的含量、提高PPAR-γ的表達(dá)，可能在一定程度上阻止肺瘦素加速EMT的進(jìn)程。以往的研究證實(shí)瘦素于胞外與LERP結(jié)合，激活STAT3，發(fā)揮作用[20]，但是結(jié)果提示與正常組比較p-STAT3/STAT3比值降低，這看起來不符合常理。然而Wang等[21]發(fā)現(xiàn)EMT模型中，STAT3和Smad3直接相互作用，干擾其與Smad4結(jié)合，抑制TGF-β1信號通路，敲低STAT3基因可促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT標(biāo)志蛋白的表達(dá)。所以有別于癌癥中針對瘦素干預(yù)腫瘤細(xì)胞EMT需要激活STAT3，TGF-β1誘導(dǎo)的EMT模型中STAT3反而是被抑制的。而中藥組似乎與STAT3的磷酸化無關(guān)。

以往的文獻(xiàn)研究證實(shí)瘦素可以促進(jìn)肺纖維化EMT進(jìn)程，而EMT對瘦素相關(guān)因子的影響尚未可知。本研究通過實(shí)驗證實(shí)EMT可增加細(xì)胞表面LEPR的表達(dá)，下調(diào)與瘦素有拮抗作用的PPAR-γ的含量，減少STAT3的活化，為瘦素加速EMT提供物質(zhì)基礎(chǔ)。而補(bǔ)腎益肺消癥方則可能通過降低內(nèi)源性肺瘦素分泌，減少LEPR，提高PPAR-γ的水平逆轉(zhuǎn)此過程。

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（2021-06-08收稿 本文編輯：張雄杰）