溫經(jīng)通脈法對奧沙利鉑致外周神經(jīng)毒性大鼠瞬時受體電位通道的影響

程 赟，包玉花

(江蘇省腫瘤醫(yī)院,江蘇 南京 210000)

奧沙利鉑作為第3代鉑類抗腫瘤化療藥物，臨床療效較順鉑和卡鉑更為突出，且具有毒副作用更少、抗癌譜更廣的優(yōu)勢，在肝癌、結(jié)腸癌等消化系統(tǒng)腫瘤的輔助和姑息治療中占據(jù)主要地位[1]。然而，奧沙利鉑外周神經(jīng)毒性(Oxaliplatin-induced neurotoxicity, OXIN)發(fā)生率高達85%～95%，且具有劑量相關(guān)性，常使化療方案被迫更換至二線而影響患者生存[2]。由于其發(fā)生機制尚未明晰，現(xiàn)代醫(yī)學針對OXIN尚無公認的有效藥物，目前臨床主要以抗氧化、提高疼痛閾值、營養(yǎng)神經(jīng)等作為治療思路[3]。在減輕化療不良反應(yīng)、緩解癥狀和延長患者生存期等方面，中醫(yī)藥具有其特色優(yōu)勢。中醫(yī)理論中，OXIN屬于“痹證”范疇，以寒凝血瘀、氣血虧虛為病機特點，溫經(jīng)通脈法治以溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血通脈、活血化瘀，臨床應(yīng)用可有效防治OXIN，緩解患者癥狀，但其作用機制不明。近年研究發(fā)現(xiàn)，奧沙利鉑可通過增加瞬時受體電位(TRP)通道的敏化作用引發(fā)OXIN，其相關(guān)拮抗劑可預(yù)防OXIN所致的炎癥和痛覺過敏，以TRPA1和TRPM8為主的5種TRP成為治療OXIN的新靶點[4-5]。本實驗采用奧沙利鉑腹腔注射建立OXIN大鼠模型，以不同劑量溫經(jīng)通脈方灌胃干預(yù)，探討其對OXIN大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRP通道的影響，為其防治OXIN提供實驗理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠60只，體重(180±20)g，由南京醫(yī)科大學提供，動物合格證號：SYXK(蘇)2021-0065。于相對恒溫(22±2)℃、恒濕(濕度75%)的SPF級實驗動物房中飼養(yǎng)，室內(nèi)保持12 h照明與黑暗交替。實驗內(nèi)容經(jīng)江蘇省腫瘤醫(yī)院實驗動物倫理委員會審核通過(20210527015)。

1.2實驗藥物及試劑 溫經(jīng)通脈法藥物組方：當歸12 g、黃芪9 g、桂枝9 g、白芍9 g、川芎6 g、細辛3 g、大棗 9 g、通草6 g、生甘草6 g，換算大鼠灌胃等效劑量為6.21 g/kg，以此作為低劑量，高劑量為12.42 g/kg；奧沙利鉑購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，用5%葡萄糖溶解為終濃度1 mg/mL的溶液，置于4 ℃冰箱待用；甲鈷胺注射液購自海南斯達制藥有限公司。DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司；神經(jīng)元特異性烯醇化物酶(NSE)抗體、FITC熒光標記IgG購自Sigma 公司，Hochest 33342染料購自Biosharp公司；TRPA1、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4一抗購自Abcam公司；RT-PCR試劑盒購自ABI公司，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司提供。

1.3實驗方法 60只Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機分為空白組、模型組、甲鈷胺組、溫經(jīng)通脈低劑量組、溫經(jīng)通脈高劑量組，每組10只。模型組、甲鈷胺組及溫經(jīng)通脈低、高劑量組大鼠均給予奧沙利鉑4 mg/kg腹腔注射，每周的前2 d每天注射1次，連續(xù)注射4周，空白組大鼠給予等體積5%葡萄糖溶液腹腔注射。實驗期間，甲鈷胺組同時給予甲鈷胺注射液0.135 mg/kg腹腔注射，2次/周(每周的前2 d)，連續(xù)4周；溫經(jīng)通脈低、高劑量組分別給予溫經(jīng)通脈湯劑6.21 g/kg、12.42 g/kg灌胃，1次/d，連續(xù)4周。

1.4觀察指標

1.4.1大鼠一般情況及體重 實驗期間每日觀察各組大鼠飲食飲水、大小便、活動等情況，測定各組大鼠實驗前及實驗第7,14,21,28天的體重。

1.4.2大鼠機械性縮足閾值(MWT) 采用動態(tài)足底觸覺儀分別于實驗前及實驗第7,14,21,28天測定各組大鼠MWT：將大鼠單獨放置于有金屬網(wǎng)格的透明測試籠，適應(yīng)15 min待大鼠探究活動消失后，使用Von Frey纖維細絲刺激大鼠后肢雙足足底中心，刺激壓力從2 g開始逐漸增加，以200 g作為切斷壓力，大鼠出現(xiàn)抬足、舔足等動作為有反應(yīng)，每只重復(fù)測量5次，每次刺激間隔5 min，5次中有3次及以上出現(xiàn)陽性反應(yīng)則為有機械性痛敏，取測定力度的平均值即為大鼠MWT。

1.4.3大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPA1、TRPM8陽性表達情況 實驗結(jié)束后各組隨機選5只大鼠，經(jīng)腹腔注射麻醉后采用10%福爾馬林溶液行腹主動脈灌注，大鼠頸部僵硬后取L4～5段背根神經(jīng)節(jié)，于10%福爾馬林溶液中固定48 h，經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明后制備5 μm石蠟切片。切片進行脫蠟，二甲苯透明，梯度酒精脫水，0.3%過氧化氫孵育20 min，再經(jīng)抗原熱修復(fù)，BSA封閉20 min，一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育20 min，SABC 37 ℃孵育20 min，DAB顯色，倒置光學顯微鏡于400倍下觀察拍照。TRPA1和TRPM8陽性表達分布于胞質(zhì)，呈棕黃色，采用Image J軟件隨機選取5個視野，計數(shù)TRPA1和TRPM8陽性細胞數(shù)量，取平均值。

1.4.4大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞提取及鑒定 各組剩余5只大鼠同法取出L4～5段背根神經(jīng)節(jié)后，放入含有1%青鏈霉素的PBS 緩沖液中，清洗表面血漬和多余組織后，用顯微鑷逐一摘取椎間孔中的神經(jīng)節(jié)，放入預(yù)冷的DMEM/F12 常規(guī)培養(yǎng)基中，更換培養(yǎng)基，洗滌3遍后收集放入離心管，于1 400 r/min下離心5 min，小心棄去上清，加入0.25%胰蛋白酶于水浴鍋中37 ℃消化20 min，每隔5 min晃動1次，隨后于冰上輕柔吹打20 min，滴加胎牛血清以終止消化，1 400 r/min下離心5 min，棄去消化液后加入DMEM/F 12培養(yǎng)基制成細胞懸液，以2×105個/mL密度接種，于5%CO2、37 ℃恒溫的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取空白組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞，采用NSE免疫熒光法鑒定細胞：取對數(shù)期生長的背根神經(jīng)節(jié)細胞接種于事先放入無菌蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)至貼壁后按NSE試劑盒步驟避光染色，同時加入Hochest 33342 熒光染料染細胞核，甘油封片后于熒光顯微鏡下觀察染色情況，NSE標記的細胞發(fā)綠色熒光，細胞核發(fā)藍色熒光。

1.4.5大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞中TRP通道蛋白表達檢測 取各組對數(shù)生長期的背根神經(jīng)節(jié)細胞，接種于6孔板，培養(yǎng)48 h后，加入裂解液于冰上裂解，提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，蛋白樣本于水浴鍋中煮沸變性，經(jīng)蛋白上樣，凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%封閉液封閉后，滴加一抗于4 ℃冰箱過夜，TBST 清洗，加入二抗，室溫孵育2 h，洗膜，滴加ECL，化學發(fā)光系統(tǒng)曝光，以GAPDH為內(nèi)參，用Image J 軟件分析條帶灰度值，計算TRPA1、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4蛋白相對表達量。

1.4.6大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞中TRP通道m(xù)RNA表達檢測 取各組對數(shù)生長期的背根神經(jīng)節(jié)細胞，接種于6孔板，培養(yǎng)48 h后提取細胞總RNA，紫外分光光度儀測定總RNA 濃度，將RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，按RT-PCR試劑盒步驟檢測TRPA1、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4 mRNA表達情況。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)。以 GAPDH 作為內(nèi)參，mRNA相對表達量采用2ΔΔCt方法計算。TRP通道各基因引物序列見表1。

表1 瞬時受體電位(TRP)通道各基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況及體重比較 大鼠在注射奧沙利鉑后出現(xiàn)行動遲緩、腹瀉、進食減少、舔足、抬足活動等現(xiàn)象；各藥物干預(yù)組灌胃后，大鼠行動較前活躍，進食、腹瀉等情況逐漸恢復(fù)。模型組大鼠實驗第14，21,28天的體重均明顯低于同期空白組(P均<0.05)；溫經(jīng)通脈低、高劑量組和甲鈷胺組大鼠實驗第21,28天的體重均明顯高于同期模型組(P均<0.05)，各藥物組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 空白組和奧沙利鉑外周神經(jīng)毒性造模各組大鼠體重比較

2.2各組大鼠MWT比較 空白組大鼠MWT較穩(wěn)定，模型組大鼠實驗第14,21,28天的MWT均明顯低于同期空白組(P均<0.05)；溫經(jīng)通脈低、高劑量組和甲鈷胺組大鼠相應(yīng)時間點的MWT均明顯高于同期模型組(P均<0.05)，各藥物組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3 空白組和奧沙利鉑外周神經(jīng)毒性造模各組大鼠機械性縮足閾值比較

2.3各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPA1、TRPM8表達情況 免疫組化檢測顯示，空白組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中僅見少量TRPA1、TRPM8陽性表達；模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPA1、TRPM8陽性表達增多，陽性表達量均明顯高于空白組(P均<0.05)；溫經(jīng)通脈低、高劑量組和甲鈷胺組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPA1、TRPM8陽性表達減少，陽性表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖1及圖2。

圖1 空白組和奧沙利鉑外周神經(jīng)毒性造模各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPA1、TRPM8陽性表達情況(免疫組化染色，×400)

圖2 空白組和奧沙利鉑外周神經(jīng)毒性造模各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPA1、TRPM8陽性表達量

2.4大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞鑒定情況 NSE免疫熒光染色顯示，NSE在背根神經(jīng)節(jié)細胞胞漿中表達，染色呈綠色熒光，Hochest染在細胞核中呈現(xiàn)藍色熒光，兩者融合后，計算出背根神經(jīng)節(jié)純度大于90%。見圖3。

圖3 免疫熒光染色鑒定大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞(×400)

2.5各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞中TRP通道相關(guān)蛋白表達情況 實驗結(jié)束后，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞中TRPA1、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4蛋白相對表達量均明顯高于空白組(P均<0.05)，溫經(jīng)通脈低、高劑量組和甲鈷胺組大鼠各指標均明顯低于模型組(P均<0.05)，各藥物組間各指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖4。

圖4 空白組和奧沙利鉑外周神經(jīng)毒性造模各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞中TRP通道相關(guān)蛋白表達情況

2.6各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞TRP通道相關(guān)mRNA表達情況 實驗結(jié)束后，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞中TRPA1、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4 mRNA相對表達量均明顯高于空白組(P均<0.05)，溫經(jīng)通脈低、高劑量組和甲鈷胺組大鼠各指標均明顯低于模型組(P均<0.05)，各藥物組間各指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表4。

表4 空白組和奧沙利鉑外周神經(jīng)毒性造模各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞中TRP通道相關(guān)mRNA相對表達量比較

3 討 論

奧沙利鉑作為惡性腫瘤一線化療中的關(guān)鍵藥物，所引起的周圍神經(jīng)病變也愈加受到關(guān)注。奧沙利鉑致神經(jīng)毒性分為急性和慢性兩種形式，急性多為短暫、可逆的肌肉痙攣，感覺遲鈍或異常；慢性則為持續(xù)的肢端對稱性麻木，“手套、襪套樣分布”，感覺障礙，肌力減弱，可伴有肌肉痛性痙攣、萎縮，自主神經(jīng)損傷等，常導(dǎo)致治療中斷，影響患者生活質(zhì)量和臨床獲益[6-7]。國內(nèi)外針對此類不良反應(yīng)已開展相關(guān)研究，但目前尚無明確有效藥物。近年來，中醫(yī)藥的神經(jīng)保護作用逐漸受到許多研究者的關(guān)注，應(yīng)用中藥復(fù)方可有效緩解化療患者外周神經(jīng)毒性，縮短癥狀持續(xù)時間，顯示出中醫(yī)療法的特色與優(yōu)勢[8-9]。

結(jié)合OXIN手足麻木或疼痛，遇冷加重的臨床特征，可將其歸屬于中醫(yī)學“痹證”范疇。疾病本質(zhì)為本虛標實，以氣血虧虛為本，寒凝血瘀為標。惡性腫瘤患者機體功能較為低下，化療后氣血受阻，四末不榮，而致手足末端麻木、感覺異常；正氣虛敗，寒邪乘虛侵入則加重，更有血虛而筋肉不榮，以致肢體功能障礙[10]。溫經(jīng)通脈法方藥組成中當歸性甘溫而入肝，其氣輕而辛，既能溫補肝經(jīng)，養(yǎng)血和血，又可行血通經(jīng)，使行中有補，補而不滯；黃芪甘溫補益脾肺，固體表之衛(wèi)氣；桂枝辛溫通經(jīng)，散寒通痹；白芍養(yǎng)血和營，和血通經(jīng)，既助當歸調(diào)補營血，又與桂枝相和以調(diào)和營衛(wèi)；川芎祛風活血，行氣止痛；細辛辛溫散寒，通達表里，內(nèi)溫臟而外溫經(jīng)，與桂枝同用以溫陽除寒邪，暢通血脈；通草通經(jīng)脈而暢血行；大棗、甘草健脾益氣，調(diào)和諸藥，重用大棗以助黃芪、當歸、白芍益氣補血之效，又可防桂枝、細辛燥烈傷及陰血；全方合用，使陰血充養(yǎng)，經(jīng)脈通暢，手足溫而客寒除。

本實驗通過奧沙利鉑腹腔注射建立OXIN大鼠模型，觀察了溫經(jīng)通脈方灌胃干預(yù)的作用。結(jié)果顯示，大鼠給予奧沙利鉑后體重明顯下降，出現(xiàn)腹瀉等癥狀，MWT降低，而溫經(jīng)通脈法可增加大鼠體重及改善腹瀉癥狀，提高大鼠MWT。提示溫經(jīng)通脈法可促進OXIN大鼠消化功能恢復(fù)和體重的增加，能有效提高OXIN大鼠的疼痛閾值?，F(xiàn)代研究表明，Ca2+的超負荷在慢性O(shè)XIN發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，作為鈣離子滲透性的TRP通道成為OXIN治療的新靶點[11]。其中3種熱敏TRP通道(TRPV1、TRPV2、TRPV4)和2種冷敏TRP通道(TRPA1、TRPM8)已確定在化療所引起的神經(jīng)性疼痛背根神經(jīng)節(jié)中呈現(xiàn)高表達[12-13]。TRPA1和TRPM8可作為“冷傳感器”導(dǎo)致機械痛增加，是誘發(fā)OXIN的主要因素[14]。相關(guān)實驗研究表明，奧沙利鉑可上調(diào)大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPA1和TRPM8的表達水平，通過敲除TRPA1和TRPM8基因或應(yīng)用拮抗劑可減輕或消除OXIN所致的冷痛和痛覺過敏[15-17]；在大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中，奧沙利鉑可通過激活TRPV1破壞神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，從而增加外周神經(jīng)敏感性[18]。此外，TRPV1和TRPA1在背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中有30%～50%共定位，二者在背根神經(jīng)節(jié)通道的激活中發(fā)揮協(xié)同作用[19]。高溫所誘導(dǎo)的外周神經(jīng)元痛覺敏感中可見TRPV2 蛋白表達增多，在順鉑作用的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中亦可見TRPV2 表達升高[20-21]。本實驗免疫組化結(jié)果顯示，OXIN大鼠背根神經(jīng)節(jié)中可見TRPA1和TRPM8陽性表達明顯增多，溫經(jīng)通脈法干預(yù)后二者陽性表達明顯減少，提示溫經(jīng)通脈法可通過抑制TRPA1和TRPM8通道減輕OXIN。進一步檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞中TRP通道的表達發(fā)現(xiàn)，OXIN大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞中TRPA1、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4蛋白和mRNA表達均明顯增加，溫經(jīng)通脈法干預(yù)后均明顯降低，表明溫經(jīng)通脈法可抑制OXIN大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRP通道的激活。綜上所述，溫經(jīng)通脈法可明顯提高OXIN大鼠疼痛閾值，改善大鼠行為學改變，其作用機制可能與抑制大鼠背根神經(jīng)節(jié)及背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中TRP通道的激活相關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。