氧化苦參堿調(diào)控FOXO1表達對TNF-α誘導HaCaT細胞炎癥因子分泌的影響*

高瓊, 劉昱昕, 陳冬梅, 尚元元, 司佳薇, 施惠娟△

1寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院皮膚科(寧夏銀川 750004)； 2銀川市婦幼保健院皮膚科(寧夏銀川 750001)； 3寧夏醫(yī)科大學(寧夏銀川 750004)

銀屑病是一種易于復發(fā)的慢性炎癥性皮膚病，病情可控制，難根治，目前尚無特效療法，對患者的身心健康造成嚴重影響，其主要特征是表皮角質(zhì)細胞增生和炎癥因子分泌。HaCaT細胞為人永生化的角質(zhì)形成的細胞株，來源于人表皮細胞，與角質(zhì)細胞的特性極為相似，且易于培養(yǎng)，是目前銀屑病體外培養(yǎng)的模式細胞[1]。目前用于治療銀屑病的藥物存在一些缺陷，如快速復發(fā)、高成本和不良反應(yīng)等，氧化苦參堿逐漸出現(xiàn)在治療銀屑病的研究中。氧化苦參堿在我國用于治療肝炎和癌癥已有悠久的歷史，對皮膚損傷性細胞增殖有抑制作用[2]，可有效改善嚴重斑塊型銀屑病，且不良反應(yīng)小[3]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O亞族1(forkhead box transcription factorO1，F(xiàn)OXO1)在銀屑病皮損組織中表示水平顯著高于正常皮膚組織，與角質(zhì)形成細胞的異常增殖密切相關(guān)[4]。其中，促炎信號分子Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是FOXO1的下游基因靶點[5]，而抑制蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/FoxO1信號通路可減輕炎癥反應(yīng)[6]。另外，銀屑病患者皮損處腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達顯著升高，采用TNF-α誘導HaCaT細胞增殖，可模擬銀屑病患者皮損處角質(zhì)形成細胞異常增殖的病理特征[7]。所以，2019年1月至2020年6月，本研究通過體外培養(yǎng)HaCaT細胞，以TNF-α刺激HaCaT細胞，建立銀屑病細胞模型，使用氧化苦參堿和FOXO1激活劑干預(yù)該模型，旨在探究氧化苦參堿調(diào)控FOXO1表達對TNF-α誘導HaCaT細胞炎癥因子分泌的影響，為銀屑病患者的治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株及藥品 人永生化表皮細胞株(HaCaT細胞)購自北京協(xié)和醫(yī)學院細胞資源庫。氧化苦參堿(純度≥98%，規(guī)格：20 mg)購自正大天晴公司。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核通過(寧醫(yī)總院醫(yī)倫審[2018]0610B)。

1.1.2 主要試劑及儀器 胰蛋白酶和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均購自美國Giboc公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)購自北京安必奇生物科技有限公司；96孔板購自上海生工生物工程有限公司；RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Genecopoeia公司；FOXO1、β-actin引物以及陰性對照空病毒載體(LV-NC-GFP)和FOXO1過表達慢病毒載體(LV-CA-FOXO1)均由上海生工生物科技有限公司構(gòu)建；腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、蛋白marker、β-actin鼠抗和PVDF膜均購自美國Sigma公司；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自嘉美生物技術(shù)有限公司；IL-6、TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒和ECL顯色試劑盒均購自北京中山金橋生物科技有限公司；TLR-4、FOXO1、AKT、p-AKT鼠抗和辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗均購自美國Abcam公司。酶標儀Fax-20100購自美國INStat公司；尼康SMZ745光學顯微鏡購自于上海普赫生物科技有限公司；FACSCanto流式細胞儀購自美國Beckman公司；全能型凝膠成像分析系統(tǒng)ChemiDoc-MP購自山東三瑞科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HaCaT細胞使用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于25 cm2培養(yǎng)瓶中，在37℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8法檢測不同濃度TNF-α對HaCaT細胞增殖活性的影響 取對數(shù)生長期HaCaT細胞，調(diào)整細胞濃度為5×104個/mL，用移液器吸取每孔100 μL接種至96孔板中，每組設(shè)立6個復孔。將96孔板置于37℃，含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，至細胞貼壁生長。分別加入終濃度為0、10、25、50 μg/L的TNF-α，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入濃度為10%的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，取出96孔板，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔在波長為450 nm處的吸光度值。OD值越大表明細胞增殖活性越高。

1.2.3 細胞分組與處理 根據(jù)細胞存活情況，篩選出終濃度為25 μg/L的TNF-α處理HaCaT細胞24 h為誘導濃度和時間。隨后將誘導后的HaCaT細胞分為模型組(培養(yǎng)基中加終濃度為25 μg/L的TNF-α)、氧化苦參堿組(HaCaT細胞未轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)基中加終濃度為25 μg/L的TNF-α和終濃度為40 mg/mL氧化苦參堿[8])、氧化苦參堿+LV-NC-GFP組(HaCaT細胞轉(zhuǎn)染LV-NC-GFP，培養(yǎng)基中加終濃度為25 μg/L的TNF-α和終濃度為40 mg/mL氧化苦參堿)、氧化苦參堿+LV-CA-FOXO1組(HaCaT細胞轉(zhuǎn)染LV-CA-FOXO1，培養(yǎng)基中加終濃度為25 μg/L的TNF-α和終濃度為40 mg/mL氧化苦參堿)，根據(jù)預(yù)實驗確定的病毒感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)加入適量LV-NC-GFP或LV-CA-FOXO1進行轉(zhuǎn)染：接種HaCaT細胞于96孔板中，調(diào)整細胞密度為1.3×105/孔，轉(zhuǎn)染時采用不加血請的培養(yǎng)基與聚凝胺混合物稀釋病毒，控制聚凝胺濃度為8 mg/L，病毒濃度為1×1011TU/L。另取正常培養(yǎng)的HaCaT細胞為對照組。

1.2.4 qRT-PCR檢測各組細胞中FOXO1 mRNA表達水平 各組細胞培養(yǎng)24 h后，采用RNA抽提試劑盒提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒說明書配置PCR反應(yīng)體系：2×SYBR mix 10 μL，H2O 8 μL，上下游引物各0.5 μL，10×cDNA模板1 μL。反應(yīng)條件設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性5 min、95 ℃變性15 s、60 ℃退火50 s、40個循環(huán)、72 ℃延伸10 min。以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt算法，計算FOXO1 mRNA表達水平。FOXO1和β-actin引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5 CCK-8法檢測各組細胞增殖活性 收集各組培養(yǎng)24 h的細胞，使用上述1.2.2中CCK-8法檢測細胞細胞增殖活性。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率 收集各組培養(yǎng)24 h的細胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，用PBS洗滌2次后，加入400 μL結(jié)合緩沖液懸浮細胞，再加入5 μL Annexin V染液，輕輕混勻后置于2～8 ℃避光條件下孵育15 min；然后加入10 μL PI輕輕混勻，于2～8 ℃避光下繼續(xù)孵育5 min后，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復6次。

1.2.7 ELISA法檢測各組細胞中炎性因子含量 取培養(yǎng)24 h后的各組細胞，嚴格按照IL-6、TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒說明書進行檢測，每組設(shè)置6個重復。

1.2.8 Western blot法檢測各組細胞中AKT、TLR-4和FOXO1蛋白表達水平 收集培養(yǎng)24 h后各組細胞，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量。然后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜、5%脫脂奶粉封閉1 h、1∶1 000濃度稀釋后的p-AKT、AKT、TLR-4、FOXO1和β-actin鼠抗4 ℃過夜孵育、含辣根過氧化物酶綴合的二抗室溫孵育2 h，用ECL顯色試劑盒顯色，全能型凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，以β-actin為內(nèi)參，分析各組蛋白表達水平，每組設(shè)置6個重復。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TNF-α對HaCaT細胞增殖活性的影響 0 μg/L TNF-α相比，10、25、50 μg/L TNF-α均可顯著提高HaCaT細胞增殖活性(P<0.05)，其中25 μg/L TNF-α組的細胞增殖活性最高。見表2。所以后續(xù)將采用25 μg/L TNF-α處理24 h誘導HaCaT細胞。

表2 不同濃度TNF-α對HaCaT細胞增殖活性的影響

2.2 氧化苦參堿對HaCaT細胞FOXO1 mRNA表達的影響 與對照組相比，模型組HaCaT細胞FOXO1 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，氧化苦參堿組和氧化苦參堿+LV-NC-GFP組HaCaT細胞FOXO1 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，與氧化苦參堿+LV-NC-GFP組相比，氧化苦參堿+LV-CA-FOXO1組HaCaT細胞FOXO1 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組HaCaT細胞FOXO1 mRNA表達水平比較

2.3 氧化苦參堿對HaCaT細胞增殖活性和凋亡率的影響 與對照組相比，模型組HaCaT細胞增殖活性顯著升高，凋亡率顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，氧化苦參堿組和氧化苦參堿+LV-NC-GFP組HaCaT細胞增殖活性顯著降低，凋亡率顯著升高(P<0.05)，與氧化苦參堿+LV-NC-GFP組相比，氧化苦參堿+LV-CA-FOXO1NC組HaCaT細胞增殖活性顯著升高，凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表4和圖1。

注：A為對照組；B為模型組；C為氧化苦參堿組；D為氧化苦參堿+LV-NC-GFP組；E為氧化苦參堿+LV-CA-FOXO1NC組圖1 各組細胞凋亡情況

表4 各組HaCaT細胞增殖活性、凋亡率比較

2.4 氧化苦參堿對HaCaT細胞中炎性因子的影響 與對照組相比，模型組HaCaT細胞TNF-α、IL-6和IL-1β含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，氧化苦參堿組和氧化苦參堿+LV-NC-GFP組HaCaT細胞TNF-α、IL-6和IL-1β含量顯著降低(P<0.05)；與氧化苦參堿+LV-NC-GFP組相比，氧化苦參堿+LV-CA-FOXO1組HaCaT細胞TNF-α、IL-6和IL-1β含量顯著升高(P<0.05)。見表5。

表5 各組HaCaT細胞炎性因子含量比較

2.5 氧化苦參堿對HaCaT細胞中TLR-4、FOXO1蛋白表達及AKT磷酸化水平的影響 與對照組相比，模型組HaCaT細胞TLR-4、FOXO1蛋白表達及AKT磷酸化水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，氧化苦參堿組和氧化苦參堿+LV-NC-GFP組HaCaT細胞TLR-4、FOXO1蛋白表達及AKT磷酸化水平顯著降低(P<0.05)；與氧化苦參堿+LV-NC-GFP組相比，氧化苦參堿+LV-CA-FOXO1組HaCaT細胞TLR-4、FOXO1蛋白表達及AKT磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。見表6和圖2。

表6 各組細胞TLR-4、FOXO1蛋白表達及AKT磷酸化水平比較

3 討論

銀屑病俗稱牛皮癬，是一種頑固性的慢性炎癥性皮膚病，病程長，易復發(fā)，甚至部分患者會出現(xiàn)終生不愈，該病臨床表現(xiàn)以紅斑、鱗屑為主，全身均可發(fā)病，但以頭皮、四肢處較為常見，多在冬季加重，對患者的身心健康造成嚴重影響，其病理表現(xiàn)為角質(zhì)形成細胞過度增殖且出現(xiàn)炎性細胞浸潤[9]，由于現(xiàn)有藥物的不良反應(yīng)或治療費用昂貴，目前可用于治療銀屑病的方法并不令人滿意[10]。而TNF-α是炎癥性皮膚病中的關(guān)鍵因子[11]，誘導HaCaT細胞中TNF-α的表達可通過引起HaCaT細胞異常增殖[12]，促進銀屑病的發(fā)生進程[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，25 μg/L TNF-α誘導HaCaT細胞24 h，可顯著提高細胞增殖活性、TNF-α、IL-6、IL-1β炎性因子含量，降低細胞凋亡率，提示TNF-α可促進HaCaT細胞炎性因子分泌，引起細胞過度增殖。

氧化苦參堿又名苦參素，是從豆科植物苦參或平科植物廣豆根中分離出來色生物堿，具有抗增殖、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和促凋亡等作用，臨床適應(yīng)癥包括慢性乙型病毒肝炎的治療和腫瘤放療和療效引起的白細胞低下或其他原因引起的白細胞減少癥。氧化苦參堿是一種較強的免疫抑制劑，使用氧化苦參堿治療銀屑病，可顯著降低患者病情嚴重程度，且氧化苦參堿在體外可明顯抑制人角質(zhì)形成細胞的活力、增殖和分化能力，對維持人皮膚角質(zhì)形成細胞的正常功能十分重要[14]。Xiang等[15]研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿具有緩解銀屑病瘙癢和炎癥的作用，另外，Groma等[16]研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿具有抗纖維化和抗病毒的作用，已被證明是一種治療銀屑病的潛在藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，氧化苦參堿組HaCaT細胞增殖活性、TNF-α、IL-6、IL-1β含量顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，提示氧化苦參堿可減輕細胞炎性因子分泌，緩解HaCaT細胞過度增殖并誘導細胞凋亡，但其中的機制尚需進一步研究。

Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)AKT/FoXO1信號通路參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程，Berthelot等[18]研究發(fā)現(xiàn)FoXO1基因可選擇性地促進部分炎性因子的生成，而銀屑病患者血清中AKT和Foxo1表達水平顯著升高[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組HaCaT細胞FOXO1蛋白和mRNA表達水平顯著升高，提示FoXO1在銀屑病中可能處于過表達狀態(tài)，而FOXO1下游因子AKT磷酸化水平和TLR-4蛋白表達水平顯著升高，提示FOXO1下游信號通路在銀屑病中可能處于激活狀態(tài)。本研究使用氧化苦參堿干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿可顯著降低TLR-4蛋白表達水平，Akt磷酸化水平以及FOXO1 mRNA和蛋白表達水平，提示氧化苦參堿可能通過抑制FOXO1及其下游因子表達，減少細胞炎性因子分泌。Arbiser等[20]研究發(fā)現(xiàn)螺藻素類似物可通過使皮膚增生正?；瑴p少炎性細胞浸潤、逆轉(zhuǎn)銀屑病中TLR4的上調(diào)，使皮膚屏障恢復正常。為進一步探討氧化苦參堿調(diào)控FOXO1表達對TNF-α誘導HaCaT細胞炎癥因子分泌的影響，本研究將HaCaT細胞轉(zhuǎn)染過表達FOXO1載體后，使用氧化苦參堿培養(yǎng)和TNF-α誘導，發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染空載體相比，轉(zhuǎn)染FOXO1過表達載體后，HaCaT細胞FOXO1 mRNA表達水平、細胞增殖活性、TNF-α、IL-6、IL-1β含量以及TLR-4、FOXO1蛋白表達和AKT磷酸化水平顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，提示氧化苦參堿對降低TNF-α誘導HaCaT細胞炎性因子分泌及促進細胞凋亡、抑制細胞增殖的作用，可被FOXO1過表達逆轉(zhuǎn)，進一步揭示了氧化苦參堿可能通過抑制FOXO1表達，減少炎性因子分泌并促進細胞凋亡、抑制細胞增殖。

綜上所述，氧化苦參堿可能通過抑制FOXO1表達，減少TNF-α誘導的HaCaT細胞炎癥因子分泌，且可促進細胞凋亡，抑制細胞增殖。但氧化苦參堿對TNF-α誘導HaCaT細胞的作用機制較為復雜，尚需深入研究。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻說明：高瓊負責實驗設(shè)計、論文撰寫；劉昱昕、司佳薇負責實驗；陳冬梅、尚元元負責數(shù)據(jù)分析、修改；施惠娟負責指導。