CAR-T細胞免疫療法治療兒童急性淋巴細胞白血病的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢

謝麗春， 陳運彬， 馬廉△

1深圳市兒童醫(yī)院血液腫瘤科(廣東深圳 518038)； 2廣東省婦幼保健院 (廣東廣州 511442)

白血病是兒童最常見的惡性腫瘤，超過3/4的為急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)[1]。在過去的50年，兒童ALL的治療效果有了顯著的提高，5年生存率約為80%，但隨之而來的治療負擔是巨大的，例如短期和長期藥物毒不良反應(yīng)，另外，兒童復發(fā)和難治性(R/R)ALL的比例為20%，這部分預后非常差，盡管加大治療強度，生存率也沒有明顯改善[2-4]。雖然異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplant，allo-HSCT)可以使一部分復發(fā)ALL患兒受益，但仍有部分是無效的[5]。因此，臨床上迫切需要新的治療方法來改善ALL的預后，并有可能取代細胞毒性化療藥物。用CD19或CD22嵌合抗原受體修飾的T細胞(CAR-T)細胞免疫治療成人和兒童R/R ALL的突破性成績，被認為是R/R ALL的治愈性療法[6-7]?，F(xiàn)有兩款獲得FDA批準上市的CAR-T細胞生物免疫治療產(chǎn)品，即Axicabatgene-ciloleucel(KTE-C19)和Tisageneleceluel(CTL019)，兩者都被批準用于治療成人復發(fā)或難治性彌漫大B細胞淋巴瘤，后者是FDA批準的唯一可用于治療成人和兒童R/R B-ALL，兩者在靶向治療誘導B-ALL和彌漫性大B細胞淋巴瘤疾病緩解甚至長期無病生存方面顯示出巨大的潛力，是細胞療法的代表[8-9]?，F(xiàn)CAR-T細胞免疫療法的臨床試驗項目數(shù)量也是激增。本中心除了開展CD19 CAR-T治療B-ALL外，也是國內(nèi)最先一批開展抗CD7 CAR-T在兒童R/R T-ALL臨床研究的單位[10]。CAR-T細胞免疫治療改變兒童ALL的整個治療領(lǐng)域，但其嚴重的毒性反應(yīng)及耐藥等限制了發(fā)展和廣泛傳播，仍然面臨許多挑戰(zhàn)。

1 多藥聯(lián)合規(guī)范化化療方案及支持性治療，提高了兒童ALL的生存率

兒童ALL治療效果的突破是全球各個血液協(xié)作組精心策劃努力的結(jié)果，盡管各中心使用的化療方案可能略有不同，但現(xiàn)有證據(jù)未能證明某一種方案優(yōu)于另一種方案[11]?；煼桨傅脑瓌t是多藥聯(lián)合輪換化療，在過去20年許多藥物在劑量和順序上都有所增加。最近的研究表明，常規(guī)藥物的劑量進一步增加不能提高無病生存率，反而會導致相當大的毒副作用。兒童R/R ALL的預后非常差，對傳統(tǒng)治療藥物產(chǎn)生耐藥性，對兒童腫瘤學家提出了治療挑戰(zhàn)[3]。

2 CAR-T細胞的生物制備、靶點選擇、不良反應(yīng)及治療監(jiān)測

CAR-T細胞是一種在兒童ALL治療上具有廣闊應(yīng)用前景的新型生物免疫細胞制劑，CAR-T細胞與腫瘤抗原結(jié)合，不僅激發(fā)其細胞毒性作用，而且可促進CAR-T細胞體內(nèi)增殖，延長CAR-T細胞壽命[8,12]。CAR-T細胞廣泛分布于全身，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)，使其成為髓外復發(fā)的一個非常有前景的治療選擇[13]。

2.1 CAR-T細胞生物制備 患者首先接受白細胞分離術(shù)獲得自體T細胞，然后送往臨床實驗室對其進行體外重組，第1代CAR在臨床試驗中表現(xiàn)不佳后，研究人員相繼開發(fā)了第2代、第3代和第4代CAR，并對其進行了改造，以包含額外的共刺激結(jié)構(gòu)域(如CD28、4-1BB或OX40)[14]。在共刺激結(jié)構(gòu)域中，4-1BB已被證明可以改善T細胞衰竭，并促進CAR在體內(nèi)的壽命；而CD28則對T細胞活化更有影響力，目前大多數(shù)臨床試驗都使用第2代和第3代CAR，因為它們具有更優(yōu)越的功效[15-16]。CAR基因的基因組整合位點也發(fā)揮了作用，CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)有可能選擇有利的插入位點，指導細胞信號傳導和染色質(zhì)修飾的基因位點整合與腫瘤反應(yīng)相關(guān)[17]。最近，研究人員發(fā)現(xiàn)T細胞記憶相關(guān)基因(包括IL-6/STAT3信號)表達的CAR-T細胞在CD19 CAR-T細胞治療的慢性淋巴細胞白血病患者中產(chǎn)生了更好的治療反應(yīng)[18]。另外，CAR-T細胞制造過程中CD4+和CD8+的比例不同所發(fā)揮的抗腫瘤效應(yīng)也是不同的，據(jù)Finney等[19]報道，分泌 TNF-α的CD8+CAR-T細胞數(shù)量較多的，兒童和年輕成人B-ALL的治療反應(yīng)更好。

2.2 淋巴細胞清除性化療方案 現(xiàn)淋巴細胞清除性化療的標準方案是基于氟達拉濱和環(huán)磷酰胺。美國國家癌癥研究所開展了一項包括53例兒童和青少年R/R ALL的臨床試驗，根據(jù)腫瘤負荷不同，分別使用不同的化療方案。但結(jié)果顯示，根據(jù)疾病負荷調(diào)整化療方案并無益處，并且接受氟達拉濱/環(huán)磷酰胺方案的總生存期明顯長于接受其他方案的受試者。一些臨床研究則對由于疾病本身或之前治療導致淋巴細胞計數(shù)低和(或)全血細胞減少的患者沒有進行化療，從風險-收益角度考慮可能是合適的，但目前數(shù)據(jù)有限，需要更多后續(xù)研究[20]。

2.3 橋接化療方案 接受CAR-T細胞治療的R/R ALL患者處于腫瘤活躍期，在CAR-T細胞制備完成之前、白細胞分離收集T細胞后需進行適當?shù)臉蚪踊焷砜刂萍膊〉倪M展，目的側(cè)重于控制疾病進展，同時盡量減少器官毒性和感染的風險。選擇方案取決于患者的既往治療史，CAR-T制備和治療機構(gòu)的配合，避免延遲CAR-T細胞輸注。下表是歐洲血液和骨髓移植學會(EBMT)和美國血液和骨髓移植學會(ASBMT)的橋接化療建議方案(表1)[21]。

表1 白細胞分離后和CAR-T細胞輸注前之間的橋接化療建議方案

2.4 CAR-T細胞常用靶點 CD19 CAR-T治療CR的患者1年內(nèi)復發(fā)的比例為43%～55%[22]，存在CD19缺失或突變的患者，無法輸注二次CD19 CAR-T細胞；部分鼠源CAR-T細胞在人體內(nèi)被免疫介導清除，即使白血病細胞上高表達CD19，二次輸注也未能成功[21]。因此，對于接受CD19 CAR-T細胞治療失敗的患者，需要新的治療方法例如HSCT或用抗其他B細胞抗原的CAR-T細胞產(chǎn)品[16,23]。

CD22在正常B細胞上限制性表達，而在大多數(shù)白血病細胞上高表達，是可替代CD19的靶點抗原。美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health, NIH)開發(fā)了具有4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的新型CD22-CAR[24]。研究顯示大多數(shù)患者在輸注CD22 CAR-T細胞后仍面臨復發(fā)的難題，無法從根本上解決免疫逃逸的問題[25]。

CAR-T對T細胞惡性腫瘤臨床療效顯著，但一些因素限制其臨床可行性。首先，正常T細胞和惡性腫瘤CAR-T細胞表達共同抗原譜會導致自相殘殺；第二、獲取足夠數(shù)量無癌細胞污染的自體正常T細胞是一項技術(shù)挑戰(zhàn)，成本高昂；第三、異體來源的CAR-T細胞可能會導致危及生命的GVHD。現(xiàn)有研究使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)來制備CD7 CAR-T細胞，有望構(gòu)建有效靶向殺死惡性腫瘤的CAR-T細胞，又可避免“自相殘殺”[26]。

2.5 CAR-T細胞療法的不良反應(yīng) CAR-T細胞治療的不良反應(yīng)發(fā)生率約為95%，大部分是自限性的，但有一些是危及生命的嚴重毒性反應(yīng)，最常見的并發(fā)癥是細胞因子釋放綜合征(CRS)、神經(jīng)毒性和B細胞再生障礙[27]。

2.5.1 CRS CRS是最嚴重的并發(fā)癥，CAR-T細胞溶解B細胞時釋放的細胞因子(包括IL-6)引起的，與治療反應(yīng)相關(guān)，通常發(fā)生在細胞輸注后幾天內(nèi)，最晚發(fā)生時間是3周，通常是可逆的[28]，但是也有發(fā)生嚴重難治性休克伴致命性多器官衰竭，具有類似噬血細胞性淋巴組織細胞增多的臨床表現(xiàn)和細胞因子特征[29]。

CRS的臨床表現(xiàn)為：發(fā)熱、缺氧、毛細血管滲漏伴血流動力學不穩(wěn)定、多器官功能障礙包括神經(jīng)功能障礙。危險因素包括：高腫瘤負荷(骨髓白血病細胞>50%)、環(huán)磷酰胺和氟達拉濱的淋巴細胞清除化療方案、輸注CAR-T細胞劑量、基于CD28的CAR-T結(jié)構(gòu)和存在活動性感染等。患兒接受淋巴細胞清除性化療后，髓外疾病仍在迅速發(fā)展或存在活動性感染，建議避免輸注CAR-T細胞[27]。

CRS分級系統(tǒng)現(xiàn)已報道的至少有6種，為了協(xié)調(diào)各個分級系統(tǒng)，美國血液和骨髓移植學會(ASBMT)發(fā)布了一個分級共識[30]。該共識提出，CRS的必要癥狀是：不可歸因于其他任何因素的發(fā)熱，級別取決于低血壓和(或)缺氧的程度。迄今為止，尚無有效的模型可預測CRS的嚴重程度，許多已鑒定的生物標志物(如CRP、IL-15)未能得到很好的復制，其預測價值仍處于探索階段，未來研究方向是在更大規(guī)模的臨床研究中去預測和驗證。

托珠單抗是一種重組人源化抗人白細胞介素-6 (IL-6)受體單克隆抗體。2017年FDA批準用于治療2歲以上兒童接受CAR-T細胞治療的CRS相關(guān)毒性，可阻斷IL-6迅速改善 CRS 癥狀，并且不會影響CAR-T細胞的擴增、功能或持久性[31]。

預防CRS策略：(1)探索CAR-T細胞給藥劑量策略，在不影響療效的情況下，分次爬坡式給藥。(2)腫瘤高負荷患者早期使用托珠單抗，評價4級CRS的發(fā)生率以及CAR-T細胞的療效(ClinicalTrials.gov NCT02906371)[32]。

2.5.2 神經(jīng)毒性 第二常見毒性是免疫效應(yīng)細胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征(immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS)，血腦屏障通透性增加導致高濃度的促炎細胞因子(如IL-6、IFN-γ和TNF-α)進入腦脊液[27]。

臨床表現(xiàn)涵蓋了各種神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如頭痛、震顫、言語障礙、譫妄和意識混亂等，最常見的是神志不清，占66%；最嚴重的是癲癇和腦水腫。美國移植與細胞治療學會(American Society of Transplant and Cellular，ASTCT)制定了一個基于康奈爾大學兒童譫妄篩查工具的兒童ICANS分級標準化體系[30]。類固醇激素和支持性治療是主要治療手段，大多數(shù)患者康復后沒有任何長期神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。CRS發(fā)生通常先于ICAN，兩者出現(xiàn)時間重疊也是常見的，但沒有發(fā)生嚴重CRS而出現(xiàn)嚴重ICAN的情況是罕見的[21]。

2.5.3 B細胞生成障礙 患者B細胞再生障礙持續(xù)時間超過6個月預示較好預后， B細胞早期恢復的復發(fā)風險更高，因此監(jiān)測B細胞可指導患者后續(xù)是否需HSCT[8]。

2.6 CAR-T后HSCT鞏固治療選擇 患者CD19 CAR-T細胞治療后CR的，如果從未接受過HSCT，是否需要后續(xù)進行HSCT來鞏固CR，EBMT和ASBMT的專家共識指出：建議根據(jù)患者個體因素(可用供體、并發(fā)癥)、疾病相關(guān)因素(MRD和B細胞再生障礙)和CAR-T相關(guān)因素(共刺激域和持久性)來評估其是否接受HSCT作為鞏固療法[30]。

2.7 監(jiān)測CAR-T治療反應(yīng) 建議3～4周后進行治療反應(yīng)評估，4周后出現(xiàn)治療反應(yīng)的可能性非常小。評估項目與傳統(tǒng)化療療效評估相似，包括：血常規(guī)、骨髓活檢和骨髓細胞學、腰椎穿刺(有或無中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累史)。MRD的檢測方法包括：二代測序免疫球蛋白重鏈基因重排檢測法和流式細胞術(shù)檢測法，兩者各有優(yōu)缺點，流式細胞術(shù)檢測有助于確定具有治療意義的表面標志物(尤其是CD19，但也包括CD22和CD20)，而NGS的檢查敏感度更高，最高可達10-6，并可以追蹤導致復發(fā)的小亞克隆，檢測更深層次的MRD有助于評估復發(fā)風險。

在腦脊液中觀察到的形態(tài)異常細胞可能是CAR-T細胞，而不是白血病幼稚細胞，流式細胞術(shù)可能有助于區(qū)分CAR-T細胞和殘留的白血病幼稚淋巴細胞。

對于CD19 CAR-T細胞治療后未接受后續(xù)治療的患者，推薦的監(jiān)測方案為：隨訪監(jiān)測時長至少3個月，有許多臨床試驗長達1年。前6個月每月1次檢測血常規(guī)、骨髓活檢、骨髓細胞學和MRD；6～12個月內(nèi)每3個月1次[21]。

3 CAR-T細胞治療面臨的挑戰(zhàn)

3.1 制備時間長和工藝復雜 在tisagenlecleucel的Ⅱ期臨床研究中，7例患者因“產(chǎn)品相關(guān)問題”未輸注細胞，而另外7例患者則因疾病進展死亡未能輸注，因此需對CAR-T制造和運輸過程進行改進，加快產(chǎn)品周轉(zhuǎn)時間[8]。

3.2 價格昂貴 CAR-T細胞價格非常昂貴，tisagenlecleucel單次輸注的標價是47.5萬美元，這不包含托珠單抗或其他維持持久緩解治療(例如HSCT)的支持性治療費用，將給患者、醫(yī)療保障系統(tǒng)和保險公司帶來挑戰(zhàn)[33]。

3.3 CAR-T細胞治療后耐藥復發(fā)機制及相應(yīng)對策 CD19 CAR-T細胞療法在治療R/R B-ALL的成功是突破性的，但復發(fā)比例超過50%，主要原因是抗原丟失免疫逃逸和CAR-T細胞功能喪失[21]。

抗CD19 CAR-T細胞抗原丟失最常見的原因是CD19剪接變異體和突變導致錯誤折疊的蛋白質(zhì)被困在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[21,34]。另外持續(xù)暴露于免疫治療可能通過應(yīng)激進化誘導抵抗，CAR-T細胞體內(nèi)持續(xù)時間較長的，CD19陰性表型復發(fā)比率較高，但即使是短期靶向也可能導致足夠的壓力來誘導這種形式的復發(fā)[20,35]?？笴D22 CAR-T細胞復發(fā)的則是抗原密度降低而不是完全丟失[24]。第2種機制是譜系轉(zhuǎn)換，主要見于MLL重排、BCR-ABL1+、ZNF384重排和其他亞型ALL，前兩個亞型即使CD19 CAR-T細胞體內(nèi)持續(xù)存在，其復發(fā)風險也是增高的，需要額外的鞏固治療[36-37]。

另一種機制是胞啃(trogocytosis)作用，即白血病細胞將靶抗原轉(zhuǎn)移到CAR-T細胞表面，進而導致CAR-T細胞之間相互攻擊，自相殘殺[16]。CD19陰性復發(fā)的還有個罕見機制是在CAR-T細胞制備過程中，CAR基因整合到白血病細胞中，CAR-T的svFv與白血病細胞上的 CD19結(jié)合，使其無法識別白血病細胞[38]。

許多研究者采用了多種靶抗原的先發(fā)制人療法。例如探索CD19 CAR-T和CD22 CAR-T聯(lián)合治療，通過依次輸注CD19和CD22 CAR-T細胞的“雞尾酒”或雙靶點CAR-T細胞來實現(xiàn)[14]。在20例R/R ALL患兒中，連續(xù)性輸注CD19和CD22 CAR-T細胞，效果令人驚喜，治療反應(yīng)持久性強，18個月的無病生存率為79.5%，遠高于以前單個靶抗原CAR-T細胞。雙靶點CD19/CD22 CAR-T細胞的的制備雖具有挑戰(zhàn)性現(xiàn)已經(jīng)完成，現(xiàn)在臨床試驗階段(NCT03448393)[39]。

通過抑制腫瘤相關(guān)抑制信號以及微環(huán)境的免疫抑制作用可增強CAR-T細胞有效性，但是會導致T細胞衰竭和缺乏長期持久性?，F(xiàn)正在進行將CAR-T細胞和免疫檢查點阻斷抑制劑組合的研究，但這種結(jié)合可能會引發(fā)過度的免疫刺激。修改CAR-T細胞以分泌程序性細胞死亡蛋白-1 (PD-1) 阻斷scFv和細胞因子(例如 IL-12、IL-18 等)，將局部微環(huán)境轉(zhuǎn)化為促炎狀態(tài)，因為分泌的scFv仍然可定位于腫瘤，保護CAR-T細胞免受PD-1抑制，這可避免全身免疫檢查點抑制相關(guān)的毒性，提高安全性[40]。

4 展望

CAR-T細胞療法是目前最具應(yīng)用前景的靶向免疫治療，未來應(yīng)著眼于開發(fā)更好的預后模型，包括關(guān)鍵的生物標志物、CAR-T產(chǎn)品的特點、細胞劑量和細胞因子血清濃度等。CRS和ICANS實驗?zāi)Ｐ?如人源化小鼠、非人靈長類動物)的開發(fā)將確定靶向通路并指導未來的臨床試驗。

可以控制CAR-T細胞免疫治療的毒性反應(yīng)，轉(zhuǎn)移到一線治療是臨床試驗的焦點，不僅可改善常規(guī)治療，而且可取代細胞毒性治療的組成部分，改善預后和減少長期影響。

2021年6月，中國NMPA正式批準國內(nèi)首個靶向人CD19自體CAR-T細胞治療產(chǎn)品奕凱達上市，CAR-T治療在兒童B-ALL的臨床研究前景廣闊，適用于兒童ALL的CAR-T產(chǎn)品在國內(nèi)上市也是指日可待。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻說明：謝麗春執(zhí)筆撰寫; 陳運彬及馬廉通信作者構(gòu)思設(shè)計及指導論文撰寫。