低量水鐵礦促進稻田梭菌Clostridium sp.BY-1產(chǎn)氫效率

張亞平，陳慧敏, ，吳志宇, ，湯佳，謝章彰*，劉芳華*

1.廣東工業(yè)大學環(huán)境科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省科學院生態(tài)環(huán)境與土壤研究所/華南土壤污染控制與修復國家地方聯(lián)合工程研究中心/廣東省農(nóng)業(yè)環(huán)境綜合治理重點實驗室，廣東 廣州 510650；3.煙臺大學生命科學學院，山東 煙臺 264003

氫氣作為一種重要的還原力和氣態(tài)分子，在水稻土生態(tài)系統(tǒng)中扮演了重要的角色。首先，氫氣的擴散能力強，容易滲透進入微生物細胞（Morita，1999），常作為電子供體被水稻土中的產(chǎn)乙酸菌、產(chǎn)甲烷菌、硫酸鹽還原菌等微生物利用，如同型產(chǎn)乙酸菌可以利用氫氣固定二氧化碳產(chǎn)生乙酸鹽，后者可作為碳源被周圍微生物群落利用（Muller，2003）；硫酸鹽還原菌能夠利用氫氣將土壤中的硫酸鹽還原成硫化氫，生成的硫化氫可固定土壤中的重金屬鉛和鎘，進而降低重金屬對植物的脅迫（Yang et al.，2021）。其次，氫氣作為一種重要的氣體信號分子，能提高水稻的抗氧化酶及同工酶活性，進而提高水稻對抗非生物脅迫的能力，如鹽度脅迫、鋁等（Xu et al.，2013；Xu et al.，2017）。因此產(chǎn)氫微生物對土壤微生物的代謝活動及植物的生長起著重要的作用。

鐵氧化物是土壤中最常見的礦物種類，在珠江三角洲地區(qū)土壤中的含量高達 2%（Tao et al.，2012），根據(jù)其結(jié)晶程度可簡單分為無定形和晶型兩種。有研究發(fā)現(xiàn)水稻土淹水后，鐵氧化物的形態(tài)主要為弱晶型或者無定形（陳婭婷等，2016）；Zhang et al.（2003）也發(fā)現(xiàn)，淹水后弱晶型鐵氧化物濃度增加，尤其在紅壤水稻土中的增幅最高能達到213.6%。水鐵礦作為水稻土中常見的弱晶型鐵氧化物，其生物相容性較好，微生物對水鐵礦的還原率比其他三價鐵氧化物高（Peak et al.，2012），因而水鐵礦在周期性干濕交替的稻田土壤中表現(xiàn)出活躍的價態(tài)變化，從而影響其他營養(yǎng)元素的生物地球化學循環(huán)。

已有研究表明，水鐵礦可以促進產(chǎn)氫菌產(chǎn)氫。如Zhang et al.（2020a，2020b）在混合菌發(fā)酵產(chǎn)氫體系中加入100 mg·L?1的水鐵礦，發(fā)現(xiàn)水鐵礦不僅可以重塑細菌群落，還能夠有效調(diào)節(jié)產(chǎn)氫菌氫化酶或鐵氧還蛋白所需亞鐵的釋放，改變產(chǎn)氫菌代謝途徑；與此同時，水鐵礦能在還原過程中消耗質(zhì)子，緩沖發(fā)酵體系中由有機酸累積導致的pH值下降，從而更好地促進微生物的生長。Zhang et al.（2019a）研究發(fā)現(xiàn)加入濃度范圍為50—200 mg·L?1的水鐵礦后，水鐵礦不僅能促進巴氏梭菌Clostridium pasteurianum產(chǎn)氫，且促進產(chǎn)氫的效果優(yōu)于磁鐵礦，原因在于水鐵礦的加入提高了葡萄糖的轉(zhuǎn)化效率和產(chǎn)氫酶基因的表達。pH是影響酶活性和產(chǎn)氫的關鍵因素之一（Fang et al.，2002），而水鐵礦能有效緩沖有機酸積累引起的系統(tǒng)酸化，提高產(chǎn)氫酶酶活性，促進微生物的生長。

根據(jù)現(xiàn)有研究，水鐵礦促進微生物產(chǎn)氫的可能機制有：緩沖體系pH、提高微生物產(chǎn)氫酶酶活性、促進微生物電子傳遞、促進微生物生長等。但由于水鐵礦對產(chǎn)氫體系pH的緩沖作用也能夠提高微生物產(chǎn)氫酶酶活性、促進微生物生長，因此并不清楚水鐵礦對微生物產(chǎn)氫代謝的提升是水鐵礦的直接作用還是緩沖pH所造成的間接作用。而在實際水稻土環(huán)境中，當水鐵礦對稻田土pH的緩沖作用有限時，其對產(chǎn)氫微生物的影響仍是未知的。因此，本研究以稻田土來源的產(chǎn)氫梭菌Clostridiumsp.BY-1為研究對象，從低濃度水鐵礦著手，通過規(guī)避高濃度水鐵礦對體系pH的緩沖作用，分析水鐵礦促進微生物產(chǎn)氫的深層作用機制，從而更深入理解稻田土壤中水鐵礦對微生物產(chǎn)氫的影響。

1 材料與方法

1.1 水鐵礦的制備與表征

材料制備：水鐵礦的制備根據(jù)（Lovley et al.，1986）描述方法，稱取162.2 g的FeCl3在磁力攪拌作用下溶于1 L的超純水中，用1 mmol·L?1的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7，直至出現(xiàn)紅褐色膠體懸浮物。隨后將上述溶液在4000 r·min?1下離心10 min后倒掉上清液，并用超純水清洗5—8次。隨后將清洗后的沉淀物用超純水定容至1 L，并測定該溶液中Fe(III)離子濃度，置于黑暗條件下保存。

表征：將制備好的水鐵礦用去離子水洗滌 3—4次后，采用真空冷凍干燥機冷凍干燥24 h，利用透射電鏡（TEM）和X-射線衍射儀（XRD）進行材料的表征。采用Hitachi HT7700透射電鏡，在100 kV下獲得透射電鏡圖像，對水鐵礦的形貌進行表征。XRD圖譜在Bruker AXS D8 Advance射線衍射儀上采集，該X射線衍射儀采用Cu靶Kα輻射、LynxEye探測器，在40 kV和40 mA條件下工作，掃描角度的范圍為5°—90°，掃描步長0.02°，停留時間為0.1 s。

1.2 菌株來源與培養(yǎng)

菌株來源：水稻土采自中國科學院華南植物園水稻土實驗田（113°21′10″E，23°10′38″N），通過五點采樣法收集 0—20 cm的新鮮土壤，剔除可見根系和石塊并混勻后過篩，放進樣品袋中于 4 ℃保存。將采集的土樣接種到MSG基礎培養(yǎng)中富集培養(yǎng)，隨后利用Hungate滾管法從該稻田土中純化分離出一株產(chǎn)氫梭菌Clostridiumsp.BY-1。

富集培養(yǎng)：稱取50 g稻田土加入500 mL MSG基礎培養(yǎng)基中混勻，分裝至西林瓶中用氮氣除氧，于95 ℃熱處理15 min，消除產(chǎn)甲烷菌和非孢子形成菌的影響。隨后將熱處理后的樣品置于 37 ℃條件下暗培養(yǎng)，每2天轉(zhuǎn)接1代。分離鑒定：將第9代富集產(chǎn)物逐級稀釋后，用Hungate滾管法進行單菌落分離，將分離出的菌株進行16S rRNA擴增。PCR擴增反應體系：2×Taq mix 12.5 μL，通用引物27f（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）各 1 μL，菌液模板 0.5 μL，ddH2O 10 μL，體系總體積 25 μL。PCR擴增程序：95 ℃預熱5 min；循環(huán)程序：95 ℃裂解30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次；終延伸72 ℃運行10 min；擴增后的樣品與4 ℃保存（郝欽欽等，2020）。隨后對擴增產(chǎn)物進行瓊脂凝膠電泳膠實驗，檢測菌落PCR是否成功，成功后送樣測序。將測序結(jié)果在NCBI上進行比對。

MSG 基礎培養(yǎng)基成分（g·L?1）：大豆蛋白胨0.50，胰蛋白胨0.50，葡萄糖10.00，L-半胱氨酸0.50，NaCl 5.00，KH2PO40.544，K2HPO42.10，刃天青 3—5滴。配制完成后用0.5 mol·L?1的NaOH或者HCl調(diào)節(jié)pH至6.8±0.2。隨后在西林瓶（125 mL）中分裝30 mL的培養(yǎng)基，用橡膠塞和鋁蓋密封后，采用抽換氣裝置進行除氧（抽真空900 s，沖氮氣200 s，循環(huán)10次），于115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。滅菌后，按照基礎培養(yǎng)基:混合溶液（100?1）的體積比加入經(jīng)過濾除菌的混合溶液。其中混合溶液按照：礦物鹽溶液?微量元素?維他命溶液=48?1?1的體積比進行混合（劉進超等，2020）。礦物鹽溶液主要成分（g·L?1）：NH4Cl 6.0，NaCl 6.0，CaCl2·2H2O 0.2，MgCl2·6H2O 2.0。微量元素主要成分（g·L?1）：FeCl2·4H2O 2.00，ZnCl20.05，MnCl2·4H2O 0.05，CuCl2·2H2O 0.03，(NH4)6Mn7O24·4H2O 0.05，AlCl30.05，CoCl3·6H2O 0.20，H3BO3飽和溶液 1 mL，濃HCl 1 mL。維他命溶液主要成分（g·L?1）：生物素0.002，葉酸0.002，維生素B60.010，核黃素0.005，維生素B10.005，鹽酸0.005，維生素B120.005，對氨基苯甲酸0.005，泛酸0.005。

1.3 低量水鐵礦對Clostridium sp.BY-1產(chǎn)氫的影響

在實驗開始之前，將無菌注射器和已滅菌的裝有培養(yǎng)基的西林瓶置于超凈臺紫外燈照射 30 min后再進行接菌。該反應體系在125 mL的西林瓶進行，培養(yǎng)基的體積為30 mL。隨后添加不同量的水鐵礦至西林瓶中，實驗組中不同西林瓶水鐵礦的最終濃度分別為 1、5、15、50 mg·L?1，空白對照組不加水鐵礦，每個濃度設置3個對照組。實驗組和對照組均接種5%的指數(shù)生長期的Clostridiumsp.BY-1，在60 h內(nèi)每間隔10 h測定體系產(chǎn)氫量、葡萄糖、有機酸、OD600和Fe(II)濃度，并在發(fā)酵第10小時時測定產(chǎn)氫酶酶活性。

1.4 產(chǎn)氣量的測定及產(chǎn)氫動力學分析

氣相色譜分析：取0.2 mL頂空體積，使用配有TCD檢測器的氣相色譜儀（Agilent 8860）對H2進行測定，TCD溫度設置為 150 ℃，進樣口溫度為80 ℃，柱溫箱溫度為80 ℃。以N2為載氣，流速為 10 mL·min?1。

產(chǎn)氫動力學分析：用岡伯茨（Gompertz）模型進行模擬和分析產(chǎn)氫動力學（Winsor，1932），計算公式為：

式中：

H——累計產(chǎn)氫量（mmol）；

P——最大產(chǎn)氫潛能（mmol）；

Rm——最大產(chǎn)氫速率（mmol·h?1）；

λ——產(chǎn)氫延遲時間（h）；

e——自然常數(shù)。

1.5 發(fā)酵液中有機酸、葡萄糖和二價鐵濃度的測定

高效液相色譜法測定有機物濃度：發(fā)酵液用0.22 μm聚醚砜膜過濾后，用高效液相色譜（Agilent 1260）檢測乙酸、乳酸和丁酸的產(chǎn)量。實驗采用C18柱（250 mm×5 μm）作為固定相，流動相為 18 mmol·L?1磷酸二氫鉀（磷酸調(diào)節(jié) pH 至 2.15），流速1 mL·min?1，柱溫 35 ℃，檢測波長 210 nm，進樣量 10 μL。

葡萄糖測定：采用3, 5-二硝基水楊酸檢測發(fā)酵液中的葡萄糖，取100 μL的發(fā)酵液將其稀釋10倍，隨后將稀釋后的發(fā)酵液和DNS溶液按1?10的體積比混勻，將混合溶液于沸水浴中加熱5 min，黃色的3, 5-二硝基水楊酸在堿性條件下沸水浴后與葡萄糖反應，會被還原成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，在波長為 540 nm處用紫外可見光分光光度計（Techcomp UV1102）檢測其吸光度。

鄰菲啰啉顯色法檢測二價鐵離子：按照 HJ/T 345—2007水質(zhì)鐵的測定-鄰菲啰啉分光光度法（試行）（國家環(huán)境保護總局，2007）測定發(fā)酵液中的二價鐵。

1.6 生物量和產(chǎn)氫酶活性測定

采用BCA蛋白試劑盒（Solarbio）檢測細菌的生物量。取0.5 mL細菌懸液于8000 r·min?1條件下離心5 min，用PBS溶液洗滌3次后，加入0.5 mL 0.2 mol·L?1的 NaOH溶液渦旋振蕩。在 4 ℃條件下冷藏保存 1 h，每 15分鐘渦旋振蕩 1次。隨后在?80 ℃冷凍保存10 min，90 ℃恒溫水浴10 min，重復3次。隨后將處理好的樣品按照試劑盒方法測定蛋白含量。

細菌氫化酶活性采用亞甲基藍還原法測定（Zhang et al.，2019a）。在 5 mL血清瓶中加入1.5 mL的 0.2 mmol·L?1亞甲基藍溶液，除氧后加入過量的氫氣。隨后加入0.5 mL的細菌懸液，37 ℃暗保存7 min后，于570 nm波長下測定吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的表征

采用XRD和TEM分別對合成的水鐵礦進行物相分析和形貌表征。TEM觀測結(jié)果顯示合成水鐵礦為絮狀的聚合體（圖1a）。如圖1b所示，XRD表征圖譜顯示水鐵礦的衍射峰較少且寬，表明水鐵礦結(jié)晶度較低。在35°與62°附近觀察到2線水鐵礦（2LFh）的兩個特征峰，分別對應（110）和（115）晶面（Michelle et al.，2014）。與 Cornell et al.（2004）所報道的標準XRD圖譜一致，證明合成材料為2LFh。根據(jù)TEM和XRD的分析結(jié)果表明，本實驗合成的水鐵礦為納米級大小的弱結(jié)晶型鐵氧化物。

圖1 合成水鐵礦的表征Figure 1 Characterization of synthetic ferrihydrite

2.2 水鐵礦對梭菌產(chǎn)氫及發(fā)酵體系pH變化的影響

本實驗以葡萄糖為暗發(fā)酵底物，研究低量水鐵礦（1、5、15 和 50 mg·L?1）對梭菌Clostridiumsp.BY-1產(chǎn)氫量和發(fā)酵體系pH變化的影響。從圖2a可知，Clostridiumsp.BY-1發(fā)酵產(chǎn)氫時，前10 h為產(chǎn)氫延遲期，隨后產(chǎn)氫過程均進入快速增長階段，30 h后產(chǎn)氫速率顯著降低，累計產(chǎn)氫量緩慢增加直至50 h達到最大累積量。與空白對照相比，所有實驗組的產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫率都有顯著的增強，在水鐵礦添加量為1、5、15和50 mg·L?1的培養(yǎng)體系中，累計產(chǎn)氫量分別為2.24、2.34、2.68和2.67 mmol，與空白對照組的1.45 mmol累計產(chǎn)氫量相比，分別提升了54.87%、61.64%、85.34%和84.17%。促進產(chǎn)氫的水鐵礦最佳投加質(zhì)量濃度為15 mg·L?1，氫氣產(chǎn)率為1.77 mol H2/mol葡萄糖，相較于空白組的H21.12 mol/mol葡萄糖提升了 58%。水鐵礦投加量為 1 mg·L?1時，氫氣產(chǎn)率為 H21.48 mol/mol葡萄糖，相比空白組提高了32.17%。因此，在添加量為0—15 mg·L?1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，水鐵礦濃度與累計產(chǎn)氣量正相關。但水鐵礦超過50 mg·L?1質(zhì)量濃度時，其累計產(chǎn)氫量和 15 mg·L?1累計產(chǎn)氫量結(jié)果相近，原因可能是水鐵礦的Fe(III)還原是消耗電子的過程，當體系中的水鐵礦過多時可能會降低產(chǎn)氫量。Zhang et al.（2019b）在探究水鐵礦對雙酶梭菌產(chǎn)氫的影響時，發(fā)現(xiàn)加入50—200 mg·L?1的水鐵礦對氫有一定的抑制作用，原因是鐵還原過程與產(chǎn)氫過程存在電子競爭，導致產(chǎn)氫量減少。

圖2 水鐵礦對Clostridium sp.BY-1累計產(chǎn)氫量及暗發(fā)酵體系pH變化的影響Figure 2 Effect of ferrihydrite on the cumulative hydrogen production of Clostridium sp.BY-1 and pH change in dark fermentation system

采用 Gompertz模型對產(chǎn)氫實驗數(shù)據(jù)進行了動力學分析（表1），在該模型下數(shù)據(jù)的相關系數(shù)均高于0.99，說明該模型能與實驗數(shù)據(jù)進行較好擬合。擬合結(jié)果顯示添加水鐵礦后，最大產(chǎn)氫能力（P）和最大產(chǎn)氫速率（Rm）都有顯著的提升，當水鐵礦的添加量為15 mg·L?1時效果最好，P和Rm的值比空白對照組分別提高了0.86倍和2.05倍。因此，較低濃度的水鐵礦具有較好的促進產(chǎn)氫效果。

表1 不同質(zhì)量濃度水鐵礦下Clostridium sp. BY-1產(chǎn)氫動力學參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of hydrogen production by Clostridium sp. BY-1 at different concentrations of ferrihydrite

實驗過程中對水鐵礦添加體系中pH變化進行了監(jiān)測。結(jié)果如圖2b所示，水鐵礦的加入對體系初始pH（6.6）值的影響較小。隨著發(fā)酵時間的延長，所有體系中pH均不斷降低，最終達到4左右，梭菌產(chǎn)氫代謝過程中除生成的有機酸類物質(zhì)如乙酸、丁酸和乳酸外，梭菌產(chǎn)氫過程生成的二氧化碳溶解后也會導致pH下降。空白組和水鐵礦添加實驗組間發(fā)酵體系pH的下降速率和最終pH值無明顯的差異。雖然水鐵礦通過消耗體系中的質(zhì)子可以緩沖體系pH，使得體系pH上升，從而更好地促進微生物的生長（Zhang et al.，2019a），但由于本實驗體系中水鐵礦添加量較少，所以其對體系的緩沖效果不顯著，因此，可忽略水鐵礦通過緩沖pH對產(chǎn)氫的貢獻。而該結(jié)果也進一步證明，即使在pH緩沖效果不好的情況下，水鐵礦仍然具有良好的促進產(chǎn)氫效果。

2.3 鐵還原過程對梭菌產(chǎn)氫的影響

梭菌屬微生物是一類典型的發(fā)酵型鐵還原細菌（張月超等，2018），作為弱結(jié)晶型的鐵氧化物，水鐵礦的 Fe(III)很容易被梭菌還原成 Fe(II)，而鐵還原過程與產(chǎn)氫過程具有電子競爭關系，對產(chǎn)氫過程可能會有抑制作用，如Zhang et al.（2019b）在探究水鐵礦對雙酶梭菌產(chǎn)氫的影響時，發(fā)現(xiàn)加入水鐵礦后，用于產(chǎn)氫的電子被Fe(III)還原分流，從而導致產(chǎn)氫量有些許降低。因此，我們測定了體系中Fe(II)的生成情況，判斷在該體系中 Fe(III)還原是否抑制產(chǎn)氫。圖3顯示實驗前20 h體系中水鐵礦逐步被還原成Fe(II)，隨后Fe(II)的濃度在體系中達到穩(wěn)定。在 1、5、15、50 mg·L?1體系中，F(xiàn)e(II)的產(chǎn)生量分別占水鐵礦加入量的 70.43%、77.38%、76.04%和83.86%，其中可能有部分鐵離子被微生物自身利用。以鐵還原量最大的50 mg·L?1體系為例，在該體系中產(chǎn)氫量為2.665 mmol，產(chǎn)生2.665 mmol的氫氣需要消耗5.34 mmol電子，而該體系Fe(II)的產(chǎn)生量為 23.40 μmol，即將水鐵礦還原為 Fe(II)僅需要消耗23.40 μmol電子。因此在該條件下，鐵還原電子消耗量僅占產(chǎn)氫電子消耗的0.43%，說明發(fā)酵型鐵還原菌Clostridiumsp.BY-1僅有少量電子傳遞至胞外用于三價鐵還原過程，對產(chǎn)氫電子的分流較小。雖然鐵還原過程與產(chǎn)氫有電子競爭，但其對產(chǎn)氫的影響較低。另外，[Fe-Fe]氫化酶和Fdred是產(chǎn)氫代謝中的重要物質(zhì)，其活性中心為鐵離子（Gadhe et al.，2015），因此梭菌鐵還原形成的Fe(II)可以被梭菌直接利用合成氫化酶和Fdred。

圖3 體系中Fe(II)的量隨反應時間變化情況Figure 3 The amount of substance of Fe(II) in the system vary with the reaction time

2.4 水鐵礦對梭菌葡萄糖利用及生長的影響

為了深入探究水鐵礦對暗發(fā)酵產(chǎn)氫的影響，我們對底物葡萄糖的消耗情況和微生物的生長狀況進行分析，具體數(shù)據(jù)如圖4所示。水鐵礦的添加不僅促進了葡萄糖的消耗，還能顯著提高微生物的生物量。如圖4a所示，實驗組的葡萄糖消耗量在30 h后減緩，并在40 h后達到平臺期，對照組葡萄糖在前20 h內(nèi)迅速降低隨后緩慢減少。其中，空白對照組的葡萄糖的消耗量在60 h后為77.66%，加入水鐵礦后實驗組葡萄糖利用率均增加至91.40%，因此水鐵礦能有效提高底物的轉(zhuǎn)化效率。葡萄糖的利用率提高，說明有更多的ATP產(chǎn)生用于微生物的生命活動，其次葡萄糖經(jīng)過糖酵解途徑生成丙酮酸的同時會生成還原性NADH，而NADH的產(chǎn)生利于氫氣的產(chǎn)生（Wang et al.，2021），因此葡萄糖利用率的提高有利于梭菌的產(chǎn)氫。隨后，對水鐵礦添加體系中細菌的OD600值進行了測定，結(jié)果如圖4b所示。培養(yǎng)20 h后各體系中OD600值均達到最大，與空白對照組相比，添加水鐵礦后的生物量有顯著提高，加入1 mg·L?1水鐵礦后，其OD600值從空白對照組的1.06增加至1.80，是空白組的1.69倍，說明水鐵礦能有效促進微生物的生長，并且隨著濃度的增加，微生物的生物量也不斷增加，更高的生物量說明有更多的梭菌參與產(chǎn)氫過程，導致梭菌的產(chǎn)氫量增大。而其生物量增加的可能原因是水鐵礦提供了微生物生長必需的Fe。以上結(jié)果表明，水鐵礦的加入不僅能提高葡萄糖的轉(zhuǎn)化效率，也能促進微生物的生長。

圖4 水鐵礦對葡萄糖消耗和生物生長OD600的影響Figure 4 Changes in glucose consumption and biological growth OD600 in the system with the increase of reaction time

2.5 水鐵礦對梭菌產(chǎn)氫酶酶活性的影響

氫化酶是生物制氫中最有效的酶（Latifi et al.，2019），它的氫轉(zhuǎn)化率比固氮酶高1000倍。已有文獻報道中，梭菌中主要包含[Fe-Fe]氫酶和[Ni-Fe]氫酶這兩類氫化酶，而鐵均是構(gòu)成氫化酶的關鍵元素（Calusinska et al.，2010）。氫化酶活性的強弱會直接影響產(chǎn)氫效率，因此對氫化酶的比酶活性（每毫克生物質(zhì)的酶活性）進行了測定，衡量水鐵礦對梭菌產(chǎn)氫酶酶活性的影響。如圖5所示，水鐵礦能提高梭菌的比酶活性，且隨著水鐵礦濃度（0—15 mg·L?1）增加，比酶活性不斷增大。最佳比酶活性出現(xiàn)在水鐵礦添加量為 15 mg·L?1體系中，其比酶活性相較于空白對照組提高了0.80倍。梭菌的3種產(chǎn)氫代謝途徑中，氫化酶都是至關重要的參與者，加入水鐵礦后酶活性提高，則梭菌產(chǎn)氫代謝過程被增強，因而會有更多的氫氣產(chǎn)生。Zhang et al.（2019a）研究表明，水鐵礦促進了巴氏梭菌7種氫化酶合成相關基因的表達上調(diào)。因此可推測水鐵礦可能也促進了Clostridiumsp.BY-1相關氫酶基因的表達，從而提高氫酶的酶活性；或者鐵元素可能通過提高類似于鐵氧還蛋白等酶的活性或表達量間接提高產(chǎn)氫酶效率。綜上，水鐵礦能促進氫化酶的酶活性，進而促進梭菌的產(chǎn)氫。但50 mg·L?1體系的比酶活性相對于空白組僅提高了0.54倍，原因可能是高濃度水鐵礦具有一定的細胞毒性，對細胞產(chǎn)生不利影響進而間接抑制了產(chǎn)氫酶的活性（Zhu et al.，2014）。

圖5 不同濃度水鐵礦體系中氫化酶活性Figure 5 Hydrogenase activity in ferrihydrite systems with different concentrations

2.6 水鐵礦對產(chǎn)氫代謝途徑的影響

對發(fā)酵液進行液相色譜分析后，菌株的主要代謝方式為產(chǎn)乙酸(2)、產(chǎn)丁酸(3)和產(chǎn)乳酸(4)代謝。添加不同濃度水鐵礦后，各主要代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生量如圖6所示。與空白對照組相比，水鐵礦的加入能增強產(chǎn)丁酸代謝和產(chǎn)乙酸代謝，抑制產(chǎn)乳酸代謝過程。其中產(chǎn)丁酸量會隨著水鐵礦濃度增加而增加，水鐵礦添加量為 50 mg·L?1時丁酸產(chǎn)生量最大，從空白對照組的0.40 mmol提高至0.63 mmol，提高了57.5%；添加水鐵礦能夠促進乙酸的產(chǎn)生，在15 mg·L?1水鐵礦體系中，乙酸從空白對照組的 0.175 mmol增加至 0.3 mmol左右，相對于空白組提升71.42%；乳酸產(chǎn)量與水鐵礦的加入呈現(xiàn)負相關，隨著水鐵礦質(zhì)量濃度增加乳酸產(chǎn)量不斷減少，其中50 mg·L?1水鐵礦體系中，乳酸累積量減少至 0.262 mmol，僅為空白對照的60.93%。

圖6 添加不同濃度的水鐵礦對Clostridium sp. BY-1產(chǎn)酸代謝的影響Figure 6 Effects of different concentrations of ferrihydrite on acid-producing metabolism of Clostridium sp. BY-1

以葡萄糖為底物的暗發(fā)酵產(chǎn)氫代謝中，葡萄糖氧化成丙酮酸和丙酮酸氧化成乙酰輔酶A，這兩個過程為氫氣的產(chǎn)生提供電子（Antonopoulou et al.，2011）。梭狀芽孢桿菌有兩種可能的產(chǎn)氫途徑：（1）在氫酶的作用下鐵氧還蛋白（Fdred）被氧化并利用質(zhì)子作為末端電子受體產(chǎn)生氫氣（Calusinska et al.，2010）；（2）糖酵解過程中的NADH再氧化，即胞質(zhì)氫化酶與NADH及鐵氧還蛋白氧化還原酶耦合，利用NADH作為電子供體將質(zhì)子還原為氫（Peters et al.，2016）。因此，產(chǎn)生NADH和Fdred的途徑有利于氫氣的產(chǎn)生，而消耗NADH和Fdred途徑則會限制氫氣的產(chǎn)生（Wang et al.，2021）。產(chǎn)乳酸代謝需要消耗NADH，產(chǎn)乙酸代謝不需要消耗NADH且伴隨著ATP的產(chǎn)生，因此抑制乳酸產(chǎn)生和促進乙酸產(chǎn)生均有利于氫氣的生成。但隨著發(fā)酵過程中氫氣的累計，氫氣分壓的增加可以顯著刺激丁酸的產(chǎn)生，來維持微生物的氧化還原平衡（Wang et al.，2021）。雖然產(chǎn)丁酸過程會消耗 NADH，但其產(chǎn)生過程會伴隨ATP的產(chǎn)生，并且有研究發(fā)現(xiàn)丁酸產(chǎn)氫途徑與乙醇產(chǎn)氫途徑競爭，對高效制氫至關重要（Yu et al.，2013）。因此，水鐵礦能調(diào)節(jié)梭菌的代謝方式，增加乙酸和丁酸產(chǎn)量，抑制乳酸產(chǎn)量，其原因可能是 NAD(P)H是生物體內(nèi)各種氧化還原反應重要參與者，當產(chǎn)氫代謝增加消耗大量的NADH后會改變梭菌體內(nèi)的代謝平衡狀態(tài)，從而導致各有機酸代謝產(chǎn)量的變化（Zigova et al.，2000）。

2.7 環(huán)境意義分析

水稻土淹水形成的厭氧環(huán)境及其中豐富的有機質(zhì)為梭菌提供了適宜的生存環(huán)境，而梭菌產(chǎn)生的氫氣對水稻土中微生物的活性和水稻的生長都有重要的影響。首先，氫氣作為電子供體，可提高微生物的活性，降低鉛、鎘等重金屬的活性，減少重金屬在水稻中的積累（Fu et al.，2019）。其次，當水稻受到如高鹽、重金屬污染等外源脅迫時，氫氣作為信號分子能調(diào)控水稻相關基因的表達來降低不利環(huán)境對植物的傷害（Xu et al.，2013；Xu et al.，2017）。此外，Cheng et al.（2021）研究還發(fā)現(xiàn)氫氣的添加可以提高水稻的產(chǎn)量與籽粒的質(zhì)量。

鐵氧化物作為水稻土中常見的礦物，已有研究發(fā)現(xiàn)其會與產(chǎn)氫梭菌發(fā)生相互作用，影響微生物的代謝（Ren et al.，2021）。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在無pH緩沖作用的情況下，低量水鐵礦也可以顯著促進梭菌的產(chǎn)氫。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)和已有研究，可推測在實際環(huán)境下水稻田中的水鐵礦可以提高微生物的產(chǎn)氫量，進而提高稻田微生物的活性，促進稻田元素循環(huán)，降低重金屬活力，提升水稻的生長速度。研究低量水鐵礦對梭菌產(chǎn)氫的影響，不僅對水鐵礦促進產(chǎn)氫的機制有了深入了解，也為其在自然環(huán)境中的生態(tài)意義提供了一定的理論支持。但目前的研究僅在實驗室水平進行，后期仍需要結(jié)合實際水稻土開展相關的研究，從而為水鐵礦促進梭菌產(chǎn)氫的實際應用提供更有用的數(shù)據(jù)支撐。

3 結(jié)論

（1）添加低量水鐵礦后，雖然暗發(fā)酵體系的pH無明顯的變化，但氫氣的產(chǎn)量和產(chǎn)率能得到較大的提升。

（2）低量水鐵礦促進梭菌產(chǎn)氫的可能機制有：提高梭菌葡萄糖的代謝速度，促進生長；提高梭菌產(chǎn)氫酶的活性，加速氫氣的產(chǎn)生；增強梭菌產(chǎn)乙酸和產(chǎn)丁酸代謝，抑制產(chǎn)乳酸代謝，調(diào)節(jié)梭菌的代謝向利于產(chǎn)氫的方向改變。