基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析瑞香素抗多種腫瘤的作用機(jī)制及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

馮 松，張小東，覃亞亞，彭 彬*

1川北醫(yī)學(xué)院；2川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，南充 637000

瑞香素提取于瑞香屬植物，為我國(guó)首創(chuàng)的天然藥物單體[1]，因其具有抗凝作用，目前臨床主要用于心血管疾病治療。另外，大量研究表明瑞香素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用，其機(jī)制包括通過(guò)MAPK1/2-JNK1/2-Akt通路抑制乳腺癌、作用于Bcl-2/Bax靶點(diǎn)進(jìn)而抑制肝癌、通過(guò)Akt/NF-κB通路抑制肺腺癌[2]、通過(guò)AMPK/Akt/mTOR通路抑制卵巢癌[3]，瑞香素抗腫瘤作用的靶點(diǎn)及通路有一定共通性。腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病，其發(fā)病率逐年上升。其中肝癌是致死性最高的惡性腫瘤[4]；三陰性乳腺癌是女性乳腺癌中惡性程度較高，且治療困難的一種[5]；惡性膠質(zhì)瘤是致殘、致死率均高的神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤[6]。既往研究表明瑞香素有明確的抗多種腫瘤的作用，但其抗腫瘤作用是否存在共同的靶點(diǎn)或通路尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)瑞香素治療惡性膠質(zhì)瘤、肝癌、三陰性乳腺癌的共同靶點(diǎn)或通路，并對(duì)其進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為瑞香素在抗腫瘤中的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)瑞香素抗膠質(zhì)瘤、肝癌、乳腺癌的共同靶點(diǎn)及通路

通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查詢?nèi)鹣闼?daphnetin)的二維結(jié)構(gòu)，使用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/)預(yù)測(cè)瑞香素的潛在作用靶點(diǎn)，剔除其中可能性為“0”的靶點(diǎn)。

通過(guò)GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索“Malignant Glioma”、“Adult Hepatocellular Carcinoma”、“Triple Negative Breast Neoplasms”，分別檢索出惡性膠質(zhì)瘤、肝癌和三陰性乳腺癌的靶點(diǎn)，去除relevance score<10的靶點(diǎn)。上述靶點(diǎn)取交集，得到三種腫瘤共同靶點(diǎn)。

將三種腫瘤交集靶點(diǎn)和瑞香素預(yù)測(cè)靶點(diǎn)分別輸入到Cytoscape(version 3.7.1)中，用該軟件構(gòu)建瑞香素-三種腫瘤蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)圖。使用“Cyto NCA”插件，根據(jù)“degree、betweenness、closeness”數(shù)據(jù)篩選出核心靶點(diǎn)。

將篩選出的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(https://metascape.org)，對(duì)瑞香素抗腫瘤靶點(diǎn)進(jìn)行GO及KEGG富集分析。以P< 0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，將瑞香素三維結(jié)構(gòu)導(dǎo)入ChemBio3D Ultra 14.0進(jìn)行能量最小化，AutodockTools 1.5.6進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷、分配電荷、設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵。從PDB(http://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)下載關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白，使用Pymol 2.3.0去除蛋白結(jié)晶水、原始配體等，將蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入AutodockTools 1.5.6進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷、分配電荷、指定原子類型。采用AutoDock Vina 1.1.2進(jìn)行對(duì)接。結(jié)果利用PyMOL 2.3.0和LigplotV 2.1進(jìn)行相互作用模式分析。

根據(jù)人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(www.proteinatlas.org)，篩選出RRM2表達(dá)較高的細(xì)胞系。

1.2 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 細(xì)胞、試劑與儀器

惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(U-251 MG)、肝癌細(xì)胞株(HepG-2)、三陰性乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB231)由川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院創(chuàng)新平臺(tái)提供。瑞香素(北京索萊寶科技公司)；DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；CCK-8試劑盒、P53、RRM2抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；羊抗兔IgG抗體(北京華興博創(chuàng)生物技術(shù)中心)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；Bio-Radimark全自動(dòng)酶標(biāo)儀、Bio-Rad chemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

上述腫瘤細(xì)胞使用含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素的培養(yǎng)基，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞抑制率

分別將U-251 MG、HepG-2和MDA-MB231細(xì)胞以每孔5×103細(xì)胞(100 μL懸液)接種于96孔板中，各接種15孔。于37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h后，每種細(xì)胞分別加入含瑞香素濃度為0(對(duì)照組)、10、20、40和80 μg/mL完全培養(yǎng)基100 μL，各設(shè)3復(fù)孔。于48 h后，每孔加90 μL無(wú)血清DMEM及10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞抑制率=[1-(A對(duì)照孔-A實(shí)驗(yàn)孔)/(A對(duì)照孔-A空白孔)]×100%

1.2.4 Western blot檢測(cè)P53、RRM2

分別用0(對(duì)照組)、40和80 μg/mL的瑞香素處理U-251 MG、HepG-2和MDA-MB231細(xì)胞48 h后，加入適量的RIPA裂解細(xì)胞提取蛋白，BCA法蛋白定量，樣品在10% SDS-PAGE行電泳，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉，P53、RRM2和GAPDH兔來(lái)源一抗于4 ℃孵育15 h后，山羊抗兔二抗于室溫孵育2 h，發(fā)光試劑(ECL)顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，其結(jié)果用軟件Image J進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

將瑞香素的結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1)導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到瑞香素潛在靶點(diǎn)100個(gè)，其中Probability為0的有43個(gè)，刪除該靶點(diǎn)，得到有效治療靶點(diǎn)57個(gè)。

圖1 瑞香素的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of daphnetin

通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到惡性膠質(zhì)瘤靶基因426個(gè)、肝癌靶基因886個(gè)和三陰性乳腺癌靶基因1197個(gè)，所得到的靶基因取交集后得到三種腫瘤的共同靶基因253個(gè)(見(jiàn)圖2)。

圖2 惡性膠質(zhì)瘤、肝癌、三陰性乳腺癌靶點(diǎn)交集的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of intersection targets of malignant glioma,hepatocellular carcinoma and triple-negative breast cancer

用Cytoscape構(gòu)建瑞香素-三種腫瘤PPI圖，篩選出P53、ESR1、CUL3、MCM2、CDK2等56個(gè)基因?yàn)槿鹣闼乜谷N腫瘤的核心靶點(diǎn)(見(jiàn)圖3)。

圖3 瑞香素潛在治療惡性膠質(zhì)瘤、肝癌及三陰性乳腺癌共同作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network of potential therapeutic targets of daphnetin for malignant glioma,hepatocellular carcinoma and triple-negative breast cancer注：以節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺標(biāo)識(shí)靶點(diǎn)連接度。Note:The node size and color in the figure indicate the target connectivity.The larger the node,the deeper the color,and the higher the connectivity.

對(duì)這56個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)瑞香素抗三種腫瘤的機(jī)制主要與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及DNA的合成和修復(fù)等生物過(guò)程有關(guān)(見(jiàn)圖4)。

圖4 GO功能富集分析圖Fig.4 GO functional enrichment analysis diagram

對(duì)瑞香素與惡性膠質(zhì)瘤、肝癌、三陰性乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)交集基因的KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，P53通路及癌癥通路為瑞香素抗腫瘤的主要通路(見(jiàn)圖5)。

圖5 KEGG通路富集分析圖Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis diagram

通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)查詢到的P53通路圖顯示P53R2是DNA修復(fù)的重要通路(見(jiàn)圖6)。在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中認(rèn)為P53R2即為RRM2[7]，而核糖核酸還原酶M2亞基(ribonucleotide reductase subunit M2，RRM2)是調(diào)控DNA合成和修復(fù)的關(guān)鍵酶亞基[8]。

圖6 P53通路圖Fig.6 P53 pathways in KEGG database注：紅色箭頭表示p53R2(P53/RRM2)通路。Note:The red arrow indicates the p53R2 (p53/RRM2) pathway.

通過(guò)cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示RRM2在惡性膠質(zhì)瘤、肝癌和乳腺癌中高表達(dá)(見(jiàn)圖7)。因此我們選擇對(duì)P53/RRM2通路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，明確其是否是瑞香素抗三種腫瘤的共同通路。

圖7 cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)中RRM2 mRNA在不同腫瘤的表達(dá)水平Fig.7 Expression level of RRM2 mRNA in different cancer in cBioPortal database注：◇：惡性膠質(zhì)瘤；△：肝癌；☆：乳腺癌。Note:◇:Malignant glioma;△:Hepatocellular carcinoma;☆:Breast carcinoma.

分子對(duì)接結(jié)果顯示，瑞香素與P53蛋白的結(jié)合能為-5.7 kcal/mol，其主要是通過(guò)形成氫鍵以及疏水作用力，與Arg267(A)、Ser99(A)形成3個(gè)氫鍵，氫鍵長(zhǎng)度分別為3.19、3.18、3.21 ?；與Leu264(A)、Ile254(A)、Pro98(A)、Thr256(A)具有疏水作用。瑞香素與RRM2蛋白的結(jié)合能為-6.7 kcal/mol，其主要是通過(guò)形成氫鍵以及疏水作用力，與Tyr323(A)、Arg330(A)分別形成4個(gè)氫鍵，氫鍵長(zhǎng)度分別為2.87、3.19、2.80、3.24?；與Val327(A)、Ser263(A)、Phe240(A)、Met350(A)、Gly267(A)、Gly233(A)、Gys270(A)具有疏水作用。提示瑞香素與P53及RRM2均具有較好的結(jié)合作用(見(jiàn)圖8、9)。

圖8 瑞香素與P53蛋白對(duì)接圖Fig.8 The molecular docking diagram of daphnetin with P53 protein

圖9 瑞香素與RRM2蛋白對(duì)接圖Fig.9 The molecular docking diagram of daphnetin and RRM2 protein

通過(guò)人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)獲得RRM2在正常組織(見(jiàn)圖10A)和腫瘤細(xì)胞系(見(jiàn)圖10B)中的表達(dá)水平。從中篩選出RRM2較正常腦組織和肝組織表達(dá)較高的U-251 MG、HepG-2細(xì)胞系。另外，Yun等研究顯示乳腺癌中MDA-MB231細(xì)胞系的RRM2表達(dá)較高[9]，因此我們選擇上述三個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

圖10 人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中RRM2在不同組織中的表達(dá)水平Fig.10 The expression of RRM2 in different tissues in human protein database注：A：正常組織；B：腫瘤細(xì)胞系(a：膠質(zhì)瘤U-251 MG細(xì)胞系；b：肝癌HepG-2細(xì)胞系；c：乳腺癌)。Note:A:Normal tissue;B:Tumor cell lines (a:Glioma cell line U251-MG;b:Hepatocellular carcinoma cell line HepG-2;c:Breast carcinoma).

2.2 瑞香素對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較，瑞香素(10、20、40、80 μg/mL)，處理腫瘤細(xì)胞48 h后，能顯著抑制U-251 MG、HepG-2、MDA-MB231細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴性。瑞香素為10 μg/mL時(shí)，三個(gè)細(xì)胞系間，抑制率無(wú)明顯差異；瑞香素為20 μg/mL時(shí)，U-251 MG的抑制率較HepG-2、MDA-MB231高(P< 0.05)，HepG-2和MDA-MB231的抑制率無(wú)明顯差異；瑞香素為40 μg/mL時(shí)，三個(gè)細(xì)胞系間，抑制率差異明顯(P<0.01)，以HepG-2抑制率最高；瑞香素為80 μg/mL時(shí)，HepG-2抑制率最高，與U-251 MG、MDA-MB231差異明顯(P< 0.01)，而U-251 MG和MDA-MB231抑制率無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖11)。

圖11 不同濃度瑞香素對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率(n = 3)Fig.11 Inhibitory rate of daphnetin at different concentrations on tumor cells (n = 3)注：與對(duì)照組比較(相同細(xì)胞系內(nèi))，＊P < 0.05，＊＊P < 0.01，＊＊＊P < 0.001；不同細(xì)胞系間比較(相同濃度瑞香素)，#P < 0.05，# #P < 0.01。Note:Compared with the control group in the same cell line,＊P < 0.05,＊＊P < 0.01,＊＊＊P < 0.001;Comparison of different cell lines treated with daphnetin at the same concentration,#P < 0.05.

2.3 瑞香素對(duì)腫瘤細(xì)胞P53和RRM2蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，40、80 μg/mL的瑞香素處理U-251 MG、HepG-2、MDA-B231細(xì)胞48 h后，P53表達(dá)均顯著增高(P< 0.01)，RRM2的表達(dá)均顯著降低(P< 0.05)。與40 μg/mL組比較，80 μg/mL的瑞香素處理U-251 MG、HepG-2、MDA-MB231細(xì)胞48 h后，P53表達(dá)均顯著增高(P< 0.01)，RRM2的表達(dá)均顯著降低(P< 0.05)。瑞香素為40 μg/mL時(shí)，U251-MG細(xì)胞系中RRM2的表達(dá)量與MDA-MB231細(xì)胞系間差異明顯(P< 0.05)，而HepG-2和MDA-MB231細(xì)胞系間RRM2的表達(dá)量無(wú)明顯差異；瑞香素為80 μg/mL時(shí)，三個(gè)細(xì)胞系間RRM2的表達(dá)量無(wú)明顯差異。瑞香素為40 μg/mL時(shí)，三個(gè)細(xì)胞系間P53表達(dá)量無(wú)明顯差異；HepG-2抑制率最高；瑞香素為80 μg/mL時(shí)，U-251 MG細(xì)胞系中P53的表達(dá)量與HepG-2和MDA-MB231差異明顯(P< 0.05)，而HepG-2和MDA-MB231細(xì)胞系中P53的表達(dá)量無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖12)。

圖12 瑞香素對(duì)U-251 MG、HepG-2和MDA-MB231細(xì)胞中P53和RRM2蛋白表達(dá)的影響(n = 3)Fig.12 Effect of daphnetin on p53 and RRM2 protein expression in U-251 MG,HepG-2 and MDA-MB231 cells (n = 3)注：A表示瑞香素(0、40、80 μg/mL)處理48 h后RRM2蛋白質(zhì)印跡條帶；B表示瑞香素(0、40、80 μg/mL)處理48 h后P53蛋白質(zhì)印跡條帶；C、D分別表示RRM2和P53與內(nèi)參GAPDH的比率。與對(duì)照組比較(相同細(xì)胞系內(nèi))，＊P < 0.05，＊＊P < 0.01，＊＊＊P < 0.001；不同細(xì)胞系間比較(相同濃度瑞香素)，#P < 0.05。Note:After treatment with daphnetin (0,40 and 80 μg/mL)for 48 h,A and B showed Western blot bands of RRM2 and p53,respectively;C and D showed the ratio of RRM2 and p53 to GAPDH,respectively.Compared with the control group in the same cell line,＊P < 0.05,＊＊P < 0.01,＊＊＊P < 0.001;Comparison of different cell lines treated with daphnetin at the same concentration,#P < 0.05.

3 討論與結(jié)論

本研究首先采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)P53通路是瑞香素抗惡性膠質(zhì)瘤、肝癌和乳腺癌的共同通路。同時(shí)，本研究通過(guò)體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)瑞香素在濃度為40、80 μg/mL時(shí)均能顯著抑制U-251 MG、HepG-2及MDA-MB231三種細(xì)胞的增殖，并顯著提高這三種腫瘤細(xì)胞中P53蛋白的表達(dá)水平。P53是重要的抑癌基因，其機(jī)制主要包括細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞衰老和凋亡、抑制血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移以及促進(jìn)DNA合成和修復(fù)和調(diào)節(jié)等[10]。我們的研究結(jié)果表明瑞香素可增加上述三種腫瘤細(xì)胞中P53表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用。RRM2是P53通路中調(diào)控DNA合成和修復(fù)的關(guān)鍵酶，且在P53通路中富集[11]。大量研究也證明P53能通過(guò)RRM2調(diào)控細(xì)胞周期、DNA合成及修復(fù)，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[12]。因此RRM2成為多種腫瘤治療的重要靶點(diǎn)[13]。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，40、80 μg/mL的瑞香素處理U-251 MG、HepG-2和MDA-MB231細(xì)胞后，其RRM2蛋白表達(dá)均顯著降低。RRM2為核糖核酸還原酶(ribonucleotide reductase，RR)中最重要的亞基，是生物體內(nèi)催化DNA合成和修復(fù)的關(guān)鍵酶[14]。目前研究表明RRM2在膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肝癌等疾病中高表達(dá)，是腫瘤治療的靶點(diǎn)[11,15,16]，其與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力、藥物抵抗和細(xì)胞周期調(diào)控等相關(guān)[15,17,18]。

RRM2含酪氨酸自由基及Fe-S基團(tuán)，故目前所開(kāi)發(fā)的靶向藥物多是基于上述靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)，如自由基清除劑、鐵螯合劑、鐵類似物等，部分RRM2抑制劑已應(yīng)用于腫瘤的臨床治療[19]，但有血液-淋巴系統(tǒng)代謝紊亂，肝腎功能失調(diào)，胃腸道反應(yīng)等多種副作用[20]。瑞香素是一種具有鐵螯合功能的天然植物活性成分，已有研究發(fā)現(xiàn)瑞香素可抑制瘧原蟲(chóng)中RR活性及表達(dá)[21]，我們的結(jié)果進(jìn)一步證明瑞香素能抑制多種人體腫瘤細(xì)胞中RRM2蛋白的表達(dá)。因RRM2在DNA復(fù)制與修復(fù)中的重要作用，推測(cè)瑞香素能抑制多種腫瘤細(xì)胞，與其調(diào)控RRM2的表達(dá)密切相關(guān)。瑞香素可作為一種新的RRM2抑制劑應(yīng)用于腫瘤的治療，且具有安全性高、分布廣等特點(diǎn)[22]。

綜上所述，我們的結(jié)果表明瑞香素可抑制U-251 MG、HepG-2、MDA-MB231細(xì)胞系增殖，瑞香素與P53及RRM2有較好的結(jié)合能力。瑞香素抗多種腫瘤的機(jī)制可能與P53/RRM2通路有關(guān)。瑞香素可作為一種新的RRM2抑制劑，極具開(kāi)發(fā)前景。