反相高效液相色譜法測定枯草菌肽的含量及純度

楊彩霞 吳金梅 何濤

摘要 [目的]建立枯草菌肽含量及純度的反相高效液相色譜（RP-HPLC）檢測方法。[方法]采用ZORBAX 300SB-C 8（4.6 mm×150 mm，5 μm），以三氟乙酸-水（1∶1 000）為流動(dòng)相A，以三氟乙酸-水-乙腈（0.85∶200∶800）為流動(dòng)相B;柱溫25 ℃，檢測波長280 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，線性梯度洗脫。[結(jié)果]在室溫條件下，枯草菌肽溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD為0.61%;枯草菌肽主峰保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為0.18%和0.22%，不同實(shí)驗(yàn)員間的 RSD為0.92%;枯草菌肽的定量限（LOQ）為120 ng、檢出限（LOD）為80 ng，在0.031 25～2.000 00 mg/mL線性關(guān)系良好（R2=1）;平均回收率為101.49%（n=9），RSD為0.29%;改變柱溫、流速和色譜柱批號(hào)，枯草菌肽理論塔板數(shù)均大于2 000，分離度均大于1.5，相對(duì)保留時(shí)間（RRT）偏差絕對(duì)值均不大于20%。測定3批枯草菌肽含量分別為98.8%、99.8% 和 100.2%;純度均大于99%。[結(jié)論]該研究建立的檢測方法靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，符合定量檢測枯草菌肽含量和純度的要求，適用于枯草菌肽的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 枯草菌肽;反相高效液相色譜法;含量;純度;定量檢測

中圖分類號(hào) R 927.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2022）02-0206-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.02.056

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Determination of the Content and Purity of Sublancin by Reversed-phase High Performance Liquid Chromatography

YANG Cai-xia1，2，WU Jin-mei3，HE Tao1，2 （1.Sinagri Yingtai Linzhou Biotechnology Park Co.，Ltd.，Anyang，Henan 456550;2.Beijing Sinagri Yingtai Biological Technology Institute Co.，Ltd.，Beijing 100193;3.Henan University of Animal Husbandry and Economy，Zhengzhou，Henan 450046）

Abstract [Objective] To establish a reversed-phase high performance liquid chromatography （RP-HPLC） method for detecting the content and purity of sublancin.[Method]Chromatography was performed on ZORBAX 300SB-C 8 chormagraphic column （4.6 mm×150 mm，5 μm），using trifluoroacetic acid-water （1∶1 000） as mobile phase A，using trifluoroacetic acid-water-acetonitrile （0.85∶200∶800）as mobile phase B;the column temperature was 25 ℃，the detection wavelength was 280 nm，the flow rate was 1.0 mL/min，the injection volume was 20 μL，linear gradient elution.[Result]At room temperature，the sublancin solution was stable within 12 hours，and the RSD was 0.61%.The RSD of the main peak retention time and peak area of subtilisin were 0.18% and 0.22%，respectively，and the RSD between different experimenters was 0.92%.The limit of quantification （LOQ） of sublancin was 120 ng，the limit of detection （LOD） was 80 ng，and the linear relationship was good between 0.031 25 and 2.000 00 mg/mL （R2=1）.The average recovery rate was 101.49% （n=9），and the RSD was 0.29%.Changed the column temperature，flow rate and chromatographic column batch number，the theoretical plate numbers of sublancin were all greater than 2 000，the degree of separation was greater than 1.5，and the absolute deviation of the relative retention time （RRT） was less than 20%.The content of three batches of sublancin were 98.8%，99.8% and 100.2%，respectively，with purity greater than 99%.[Conclusion]The detection method established in this study is sensitive，accurate and highly specific，which meets the requirements for quantitative detection of sublancin content and purity，and is suitable for quality control of sublancin.

Key words Sublancin;RP-HPLC;Content;Purity;Quantitative detection

作者簡介 楊彩霞（1987—），女，河南商丘人，獸醫(yī)師，碩士，從事新獸藥研發(fā)與注冊申報(bào)工作。

收稿日期 2021-05-26

在畜禽生產(chǎn)中，抗生素被廣泛用作疾病的預(yù)防、治療和促進(jìn)生長[1]。但隨著抗生素的大量使用甚至濫用，耐藥性和藥物殘留問題日益嚴(yán)峻[2]，不僅導(dǎo)致生產(chǎn)動(dòng)物的抗感染治療難度加大，而且導(dǎo)致其免疫力低下，由此引起生產(chǎn)動(dòng)物的疫病發(fā)病率高，死亡率高。因此，開發(fā)抗生素替代產(chǎn)品，尤其是增強(qiáng)生產(chǎn)動(dòng)物免疫力的藥物，用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)是亟需解決的任務(wù)[3]。

枯草菌肽是由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的含有37個(gè)氨基酸的生物多肽，其理化性質(zhì)極其穩(wěn)定[4-5]，具有改善動(dòng)物腸道健康、提高機(jī)體免疫力和生長性能的功能[1，3，6-12]，在畜牧行業(yè)上有著巨大的應(yīng)用前景。目前，在國內(nèi)外，中農(nóng)穎泰林州生物科園有限公司是唯一一家實(shí)現(xiàn)枯草菌肽產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的單位，為了更好地對(duì)枯草菌肽相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[4，13-14]及大量試驗(yàn)，該研究建立了枯草菌肽的反相高效液相色譜（RP-HPLC）檢測方法，可快速準(zhǔn)確地檢測枯草菌肽的含量及純度。

1 材料與方法

1.1 材料

高效液相色譜儀（Agilent1260），購自安捷倫科技（中國）有限公司;色譜柱（ZORBAX 300SB-C 8，4.6 mm×150 mm，5 μm），購自安捷倫科技（中國）有限公司;乙腈（色譜級(jí)）、三氟乙酸（色譜級(jí)）、鹽酸、氫氧化鈉、過氧化氫均購自國藥集團(tuán);枯草菌肽對(duì)照品（批號(hào)20141001，以干燥品計(jì)算，含量97.63%），由中農(nóng)穎泰林州生物科園有限公司提供;枯草菌肽凍干粉原料3批（批號(hào)2016111601、2016112101、2016112601），由中農(nóng)穎泰林州生物科園有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制。

1.2.1.1 供試品溶液。精密稱量枯草菌肽凍干粉適量，用超純水溶解稀釋，再轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，即得。

1.2.1.2 對(duì)照品溶液。

精密稱量枯草菌肽對(duì)照品10.24 mg（相當(dāng)于枯草菌肽10.00 mg），用超純水溶解稀釋，再轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，即得1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.2.2 枯草菌肽含量檢測方法的建立。

1.2.2.1 色譜條件。用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以三氟乙酸-水（1∶1 000）為流動(dòng)相A，以三氟乙酸-水-乙腈（0.85∶200∶800）為流動(dòng)相B;柱溫25 ℃，檢測波長280 nm，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量20 μL，按表1進(jìn)行梯度洗脫。理論板數(shù)按枯草菌肽峰計(jì)算不低于2 000。

1.2.2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。取“1.2.1.2”對(duì)照品溶液作為系統(tǒng)適用性溶液，依“1.2.2.1”色譜條件進(jìn)行測定，對(duì)應(yīng)理論板數(shù)、分離度、拖尾因子和峰面積4個(gè)參數(shù)分別連續(xù)進(jìn)樣5次。

1.2.2.3 方法專屬性?？疾炜莶菥慕?jīng)過酸破壞、堿破壞、氧化破壞和熱破壞處理后，主要破壞產(chǎn)物與枯草菌肽主峰的分離度，處理情況如下：①對(duì)照品，取“1.2.1.2”對(duì)照品溶液;②酸破壞，在對(duì)照品溶液中按1∶1比例加入0.1 mol/mL的鹽酸溶液，室溫酸破壞1 h; ③堿破壞，在對(duì)照品溶液中按1∶1比例加入0.05 mol/mL的氫氧化鈉溶液，室溫堿破壞15 min;④氧化破壞，在對(duì)照品溶液中按1∶1比例加入20%的過氧化氫溶液，室溫氧化破壞1 h;⑤熱破壞，取1 mL對(duì)照品溶液，水浴80 ℃加熱15 min。

1.2.2.4 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)。

取供試品溶液，分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 h 取樣，依“1.2.2.1”色譜條件進(jìn)行測定，

計(jì)算枯草菌肽主峰峰面積的RSD，考察枯草菌肽溶液在室溫12 h內(nèi)的降解情況。

1.2.2.5 方法學(xué)考察。

（1）靈敏度。采用逐步稀釋的方法，按信噪比S/N≥3和S/N≥10計(jì)算檢出限和定量限。

（2）重復(fù)性。取供試品，按“1.2.1.1”方法制備樣品6份，依“1.2.2.1”色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算枯草菌肽主峰保留時(shí)間和峰面積的RSD，考察重復(fù)性。

（3）中間精密度。取供試品，按“1.2.1.1”方法分2個(gè)實(shí)驗(yàn)員每人制備樣品6份，依“1.2.2.1”色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算枯草菌肽峰面積的RSD，考察中間精密度。

（4）準(zhǔn)確度。按“1.2.1.2”方法配制0.8、1.0、1.2 mg/mL 3個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液作為準(zhǔn)確度溶液，每個(gè)濃度的準(zhǔn)確度溶液配制3份，每份樣品測定2次，共測定18次，通過計(jì)算回收率考察準(zhǔn)確度。

（5）線性關(guān)系。將枯草菌肽對(duì)照品制備成不同濃度的工作溶液，濃度分別為2.000 00、1.000 00、0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 mg/mL，依“1.2.2.1”色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(biāo)、主峰峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

（6）耐用性。取“1.2.1.2”對(duì)照品溶液作為耐用性溶液，改變柱溫、流速和色譜柱批號(hào)，按“1.2.2.1”項(xiàng)下梯度洗脫程序進(jìn)行檢測，記錄枯草菌肽理論塔板數(shù)、分離度大于1.5和相對(duì)保留時(shí)間（RRT）偏差絕對(duì)值，考察耐用性。

1.2.2.6 含量測定。取3批枯草菌肽凍干粉，按“1.2.1.1”方法制備樣品，質(zhì)量濃度為1 mg/mL，每批2份，取“1.2.1.2”對(duì)照品溶液作為對(duì)照溶液，按“1.2.2.1”色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，采用外標(biāo)法[15]，以峰面積計(jì)算各樣品的含量。

1.2.2.7 雜質(zhì)測定。取3批枯草菌肽凍干粉，按“1.2.1.1”方法制備樣品，每批2份，質(zhì)量濃度為2 mg/mL，作為雜質(zhì)測定用供試品溶液。各精密量取2 mL，分別置于100 mL容量瓶中，超純水定容至刻度，搖勻，制得供試品溶液的2.0%濃度的溶液作為對(duì)照溶液。雜質(zhì)測定用供試品溶液和對(duì)照溶液，按“1.2.2.1”色譜條件進(jìn)行測定，每個(gè)樣品測定3次，記錄色譜圖，供試品中主成分與雜質(zhì)峰分離度大于1.5，主要雜質(zhì)峰、總雜質(zhì)峰及對(duì)照溶液峰面積RSD均小于5%，按不加校正因子的主成分自身對(duì)照法[15]計(jì)算雜質(zhì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性 結(jié)果如表2所示，枯草菌肽理論板數(shù)為10 441，RSD為0.94%;分離度為2.99，RSD為0.49%;拖尾因子為2.13，RSD為2.11%;峰面積為1 891.1，RSD為0.09%，該方法系統(tǒng)適用性良好。

2.2 方法專屬性 將枯草菌肽經(jīng)過酸破壞、堿破壞、氧化破壞和熱破壞處理后的溶液，按“1.2.2.1”色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果表明（圖1），該色譜條件下，枯草菌肽保留時(shí)間約9 min;空白對(duì)照不干擾枯草菌肽的含量測定。枯草菌肽在酸性降解條件和加熱降解條件下比較穩(wěn)定;在堿性降解條件下，主要在9.39 min出現(xiàn)含量約占11.5% 和在10.68 min出現(xiàn)含量約占31.9% 的2個(gè)較大破壞產(chǎn)物;在氧化降解中主要在8.7 min出現(xiàn)含量約占19.1% 和在9.2 min出現(xiàn)含量約占2.0% 的2個(gè)較大破壞產(chǎn)物;主要破壞產(chǎn)物和枯草菌肽主峰都可以有效地分開，說明該方法的專屬性良好。

2.3 樣品穩(wěn)定性 按“1.2.2.4”方法操作，計(jì)算出枯草菌肽主峰峰面積的RSD為0.61%，主峰無明顯降解。表明供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 靈敏度。采用逐步稀釋法，取“1.2.1.2”對(duì)照品溶液，精密稀釋制樣，稀釋至濃度為0.040、0.008、0.006、0.005、0.004、0.003 mg/mL，依“1.2.2.1”色譜條件進(jìn)行測定。當(dāng)枯草菌肽濃度為0.006 mg/mL，進(jìn)樣量20 μL，信噪比S/N約為10，定量限為120 ng;枯草菌肽濃度為0.004 mg/mL，進(jìn)樣量20 μL，信噪比S/N約為3，檢出限為80 ng。

2.4.2 重復(fù)性。

按“1.2.2.5”中方法操作，計(jì)算出枯草菌肽主峰保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為0.18%和 0.22%，表明重復(fù)性良好。

2.4.3 中間精密度。

按“1.2.2.5”中方法操作，計(jì)算出枯草菌肽峰面積的RSD為 0.92%，表明不同實(shí)驗(yàn)員間的中間精密度良好。

2.4.4 準(zhǔn)確度。

以對(duì)照品溶液濃度為100%，配制80%、100%和120%濃度的準(zhǔn)確度溶液。即按“1.2.2.5”中方法操作，按“1.2.2.1”色譜條件進(jìn)行測定，色譜峰面積用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，得各溶液中枯草菌肽的量，求得平均回收率（n=9）為101.49%，RSD為 0.29%。結(jié)果見表3。

2.4.5 線性關(guān)系。按“1.2.2.5”中方法操作，以濃度為橫坐標(biāo)、主峰峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y=1 835.3x-16.146（R2=1），表明在0.031 25～2.000 00 mg/mL，枯草菌肽濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.6 耐用性。

按“1.2.2.5”中方法操作，記錄色譜圖，結(jié)果顯示（表4），枯草菌肽理論塔板數(shù)均大于2 000，分離度均大于1.5，相對(duì)保留時(shí)間（RRT）偏差絕對(duì)值均不大于20%，表明此方法耐用性良好。

2.5 含量測定 按“1.2.2.6”方法操作，結(jié)果見表5。3批枯草菌肽的平均含量分別為98.8%、99.8%和100.2%。

2.6 雜質(zhì)測定 按“1.2.2.7”方法操作，結(jié)果見表6。3批枯草菌肽凍干粉原料單雜質(zhì)均小于0.5%，總雜質(zhì)均小于1.0%，純度均大于99%。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 在枯草菌肽的純化及相關(guān)試驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)該多肽易溶于水，而在反相色譜分離多肽和蛋白質(zhì)的試驗(yàn)中，使用三氟乙酸作為離子對(duì)試劑是常見的手段，可以改善峰型、克服峰寬和拖尾問題[16-18]。故經(jīng)過對(duì)流動(dòng)相的配比進(jìn)行反復(fù)摸索，選用以三氟乙酸-水（1∶1 000）為流動(dòng)相A，以三氟乙酸-水-乙腈（0.85∶200∶800）為流動(dòng)相B能夠滿足對(duì)枯草菌肽含量和純度的分析。

3.2 檢測波長的選擇 將枯草菌肽溶解在超純水中，按照紫外-可見分光光度法（《中華人民共和國獸藥典》2015年版一部通則0401）[15]測定，在280 nm波長處有最大吸收。

3.3 雜質(zhì)測定 枯草菌肽為枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物，在反相色譜中無法明確每一微量雜質(zhì)具體為何種物質(zhì)，故而無法獲得各雜質(zhì)的校正因子，因此在用反相高效液相色譜法測定雜質(zhì)含量時(shí)，使用《中華人民共和國獸藥典》2015年版一部通則0512）[15]色譜法中的不加校正因子的主成分自身對(duì)照法，計(jì)算雜質(zhì)含量。

3.4 對(duì)照品的標(biāo)定 該研究所用的枯草菌肽對(duì)照品為中農(nóng)穎泰林州生物科園有限公司自行制備，目前國內(nèi)外也尚無同類標(biāo)準(zhǔn)品。依據(jù)《9901國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備指導(dǎo)原則》（《中國藥典》2015版第四部，通則）[19]，枯草菌肽對(duì)照品的賦值采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）和全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳法（WCID-cIEF）2種不同的原理檢測純度，再依據(jù)質(zhì)量平衡法，分別計(jì)算含量。質(zhì)量平衡法計(jì)算枯草菌肽對(duì)照品含量的公式：①以干燥品計(jì)算，對(duì)照品含量（%）=〔100%-熾灼殘?jiān)?）〕×純度（%）;②以濕品計(jì)算，對(duì)照品含量（%）=〔100%-干燥失重（%）-熾灼殘?jiān)?）〕×純度（%）。

4 結(jié)論

該研究建立的反相高效液相色譜定量檢測枯草菌肽的方法，準(zhǔn)確度好，精密度高，重復(fù)性穩(wěn)定，可用于枯草菌肽的純度分析和定量檢測，并為完善及提高枯草菌肽原料及相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了一定的實(shí)踐基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

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