不同根際促生菌對金線蓮生理特性的影響

楊娟 趙涵予 陳婷 周鑫燁 林文雄 林生

摘要 [目的]探索植物根際促生菌對金線蓮生理特性的影響，為金線蓮產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供新思路。[方法]運用3株植物根際促生菌（蠟樣芽孢桿菌H-15、阿耶波多氏芽孢桿菌H-6、伯克氏菌P 4），通過盆栽試驗，研究其對金線蓮生長的影響。[結(jié)果]根際促生菌H-15、H-6、P 4處理下金線蓮的存活率分別比CK增加了40%、22%、39%;發(fā)病率分別比CK降低了22%、33%、11%;鮮重增加率分別是CK的2.57、1.60、1.74倍;與此同時，3株根際促生菌處理下金線蓮中多糖含量顯著高于CK，P 4處理下的總黃酮含量和微量元素含量均高于CK，而3株根際促生菌處理下金線蓮的游離氨基酸含量均低于CK，分別比CK下降了29%、11%、23%。[結(jié)論]植物根際促生菌能顯著促進金線蓮生長，具有良好的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞 金線蓮;根際促生菌;人工種植;理化性質(zhì)

中圖分類號 S 567.23+9文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2022）02-0186-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.02.051

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Effects of Different Rhizosphere Promoting Bacteria on Physiological Characteristics of Anoectochilus roxburghii

YANG Juan1，2，ZHAO Han-yu1，2，CHEN Ting1，2 et al （1.College of Life Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002;2.Fujian Provincial Key Laboratory of Agroecological Processing and Safety Monitoring，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002）

Abstract [Objective]To explore the effect of rhizosphere promoting bacteria on physiological characteristics of Anoectochilus roxburghii，and to provide new ideas for sustainable development of Anoectochilus roxburghii industry.[Method]Three plant rhizosphere promoting bacteria （Bacillus H-15，Bacillus H-6 and Burkholderia P4） were used to study their effects on the growth of Anoectochilus roxburghii through pot experiments.[Result]Compared with CK，the survival rate of Anoectochilus roxburghii treated with H-15，H-6 and P4 increased by 40%，22% and 39%，respectively;the incidence decreased by 22%，33% and 11%，respectively;the fresh weight increase rate was 2.57，1.60 and 1.74 times of CK，respectively.At the same time，the polysaccharide content of the treatments treated with rhizosphere promoting bacteria was significantly higher than CK，the total flavonoids content and microelement content under P4 treatment were all higher than CK，while the free amino acids content were all lower than CK，which decreased by 29%，11% and 23%，respectively.[Conclusion]Rhizosphere promoting bacteria can significantly promote the growth of Anoectochilus roxburghii and have bright application prospects.

Key words Anoectochilus roxburghii;Rhizosphere promoting bacteria;Artificial cultivation;Physicochemical property

基金項目 國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFE0121800）;福建農(nóng)林大學(xué)科技創(chuàng)新專項基金項目（CXZX2018046）。

作者簡介 楊娟（1997—），女，重慶人，碩士研究生，研究方向：植物生態(tài)學(xué)。*通信作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事作物生態(tài)與分子生理研究。

收稿日期 2021-01-06;修回日期 2021-06-01

金線蓮（Anoectochilus roxburghii），又名“金線蘭”，是蘭科（Orchidaceae）開唇蘭屬的一種多年生草本藥用植物，其藥性平和，具有清熱涼血、祛風(fēng)利濕、解毒止痛等功效，常用于治療幼兒發(fā)熱、百日咳、小兒驚風(fēng)、毒蛇咬傷等疾病，對糖尿病、肝炎、腎病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤等疑難雜癥也具有較好的療效[1-2]，故金線蓮在民間素有“藥王”“烏人參”“金錢草”等美譽[3]。除藥用價值外，金線蓮還具有較高的觀賞價值，既可單獨進行盆栽，也可與蘭草等其他盆栽苗木鑲嵌搭配，作為高端室內(nèi)觀賞盆景，日漸受到消費者的青睞[4]。因此，市場上對金線蓮的需求相當(dāng)旺盛。然而，金線蓮種子微小，自然狀態(tài)下萌發(fā)率低，難以大量繁殖[5]，人們的過度采挖使得野生金線蓮瀕臨滅絕。1990 年，金線蓮被福建省人民政府列入“福建省重點保護野生藥材物種名錄”[6-7]。近年來，金線蓮組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展在很大程度上緩解了當(dāng)前市場上金線蓮供不應(yīng)求的狀況，但組培苗中的農(nóng)藥殘留、重金屬殘留和植物類激素殘留等對人的身體健康存在一定的安全隱患[7-8]。有研究表明，組培苗仿生態(tài)栽培5個月后才可使其品質(zhì)接近于野生金線蓮[9]，而金線蓮對生境要求較高，人工種植過程中極易出現(xiàn)病蟲害等問題[10]。探索在人工種植過程中如何提高金線蓮的產(chǎn)量和品質(zhì)，對于金線蓮種質(zhì)資源的保存以及金線蓮產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有現(xiàn)實意義。

植物根際促生菌（PGPR）是一類定殖于植物根際、根表或根內(nèi)的有益微生物，可通過釋放植物生長調(diào)節(jié)劑、參與土壤養(yǎng)分循環(huán)、抑制病原菌等方式直接或間接促進植物生長[11-14]。目前，國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)多個種屬的根際微生物具有良好的促生效果，如假單孢菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、沙雷氏菌（Serratia）、腸桿菌（Enterobacter）、伯克氏菌屬（Burkholderia）等[15]。研究顯示，植物根際促生菌對草莓、小麥、大豆等植物均具有較好的促生效果[16-18]。關(guān)于植物根際促生菌在金線蓮上的應(yīng)用還鮮有報道。該研究運用3株植物根際促生菌（蠟樣芽孢桿菌H-15、阿耶波多氏芽孢桿菌H-6、伯克氏菌P 4），研究不同促生菌處理下金線蓮的生理特性變化，以期為金線蓮的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培提供新思路，同時也為擴大植物根際促生菌的適用范圍提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物。供試金線蓮組培瓶苗品種為福建本地野生，購于福建省拿鋤頭農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.1.2 供試菌株。供試菌株由福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所提供，菌株編號分別為H-15（蠟樣芽孢桿菌）、H-6（阿耶波多氏芽孢桿菌）、P 4（伯克氏菌），均為從土壤中分離的根際促生菌。

1.1.3 供試土壤。供試土壤采挖自福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院試驗田，將其與泥炭土（丹麥品氏進口泥炭土）按體積比1∶1的比例混合，混合后裝入專業(yè)滅菌袋，高壓滅菌。

1.2 試驗設(shè)計

盆栽試驗于2018年3月28日在福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所溫室進行。用鑷子將金線蓮組培苗小心地從組培瓶中取出，洗凈根際附著培養(yǎng)基。選用長勢一致的金線蓮組培苗，種植于小塑料花盆中（規(guī)格：外徑8.0 cm×內(nèi)徑5.5 cm×高6.5 cm），每盆裝無菌土200 g，金線蓮3株。試驗共設(shè)置4個處理：不加菌（CK）;加蠟樣芽孢桿菌H-15（H-15）;加阿耶波多氏芽孢桿菌H-6（H-6）;加伯克氏菌P 4（P 4）。于加菌前1 d分別吸取各菌液50 μL至5 mL LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)8～12 h，然后吸取活化后的菌液2 mL至200 mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2 h;再將菌液分裝至50 mL離心管中，6 000 r/min，10 min，離心收集菌體。用無菌水清洗菌體3次，最后用無菌水調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1×108 CFU/mL（OD 600約為0.5），用移液槍吸取菌懸液，加入盆栽中，接種量200 μL/盆，對照組（CK）加等量無菌水。于金線蓮種植后的前90 d，每30 d進行1次加菌處理。整個試驗期間控制環(huán)境溫度為16～23 ℃，180 d后收獲。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 生理生化指標測定。株高采用皮尺測定，以植株最下部莖節(jié)的底部到最上部莖節(jié)的頂部的絕對高度表示;莖粗采用游標卡尺測定;分別在種植前和收獲時對金線蓮的株高、莖粗、葉片數(shù)進行測定。待對收獲的金線蓮進行一系列的生理指標測定后，將不同處理下的植株放置于烘箱中，80 ℃烘干至恒重，用冷凍混合型球磨儀MH400（MH400，德國RETSCH）粉碎，用于金線蓮品質(zhì)的測定?？傸S酮采用紫外-可見分光光度法測定;總多糖采用苯酚-硫酸法測定;游離氨基酸采用茚三酮比色法測定[19]。微量元素含量采用ICP-MS（NexIONTM300X，Perkinelmer公司）測定。葉片增加率=（收獲時葉片數(shù)-種植時葉片數(shù)）/種植時葉片數(shù);鮮重增加率=（收獲時鮮重-種植時鮮重）/種植時鮮重。

1.3.2 土壤養(yǎng)分測定。土壤中全氮、全磷用德國的全自動化學(xué)間斷分析儀（Smartchem 2000）測定;全鉀和速效鉀采用火焰光度法測定;堿解氮采用堿解擴散法測定;速效磷用0.5 mol/L NaHCO 3浸提-鉬銻抗顯色法測定[20]。

1.4 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用DPS統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，用Excel 2013軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同根際促生菌對金線蓮生長的影響

由圖1可知，3種根際促生菌的添加均可顯著提高金線蓮的存活率，不同處理下金線蓮的存活率由高到低的順序為H-15>P 4>H-6>CK;其中，根際促生菌H-15、P 4處理對金線蓮存活率的影響顯著（P<0.05），H-15處理下金線蓮的存活率為93%，P 4處理下金線蓮的存活率為92%，分別比CK增加了40%、39%。同時，根際促生菌的添加還可以降低發(fā)病率，與CK的發(fā)病率（48%）相比，H-6處理下的發(fā)病率最低，為15%;其次是H-15，發(fā)病率為26%。

從圖2可以看出，H-15處理下金線蓮的葉片增加率明顯提高（P<0.05），是CK的1.39倍，而H-6、P 4處理下的葉片增加率與CK無顯著差異。此外，與CK相比，各處理下金線蓮的鮮重增加率均有提高（P<0.05），H-15、H-6、P 4處理下的鮮重增加率分別為59%、37%、40%，其中，H-15處理下的鮮重增加較為顯著，鮮重增加率約是CK的2.57倍。

2.2 不同根際促生菌對金線蓮品質(zhì)的影響 由圖3可知，不同處理下金線蓮中多糖含量差異顯著（P<0.05），由高到低的順序為H-15>P 4>H-6>CK，促生菌H-15、H-6、P 4處理下的多糖含量分別比CK提高19%、3%、12%。不同處理下金線蓮中總黃酮含量也存在一定的差異，根際促生菌P 4處理下的總黃酮含量最高，為13.862 9 mg/g，比CK提高4%;而根際促生菌H-15、H-6處理下的總黃酮含量與CK相比略有下降，分別比CK降低了4%、7%。不同根際促生菌處理下金線蓮中游離氨基酸含量均顯著低于CK（P<0.05），促生菌H-15、H-6、P 4處理下的游離氨基酸含量分別比CK下降了29%、11%、23%。

從表1可以看出，從整體上來看，CK處理下的6種微量元素（Mn、Zn、Cr、Ni、Cu、Mo），只有Mo的含量高于其他3種處理。根際促生菌P 4處理對金線蓮微量元素含量的影響較為顯著，其處理下微量元素Mn、Zn、Cr、Ni、Cu的含量均高于CK，分別比CK提高了21.64%、5.06%、60.41%、35.07%、29.72%;根際促生菌H-6處理下微量元素Cr、Ni、Cu的含量分別比CK增加了32.701、13.738、6.080 μg/L;根際促生菌H-15處理下，微量元素Cu的含量比CK增加了5.045 μg/L，而其他微量元素的含量均低于CK。3種根際促生菌處理下，微量元素Zn、Cr、Ni、Cu的含量由高到低的順序均為 P 4>H-6>H-15;微量元素Mn的含量由高到低的順序為P 4> H-15>H-6;微量元素Mo的含量由高到低的順序為H-6>P 4>H-15。

3 結(jié)論與討論

根際促生菌可通過溶磷、生物固氮、產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶（ACC）、干擾群體感應(yīng)信號、產(chǎn)生植物激素、產(chǎn)生嗜鐵素、抑制病原菌生長、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性等方式對植物的生長產(chǎn)生影響，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上表現(xiàn)出極大的潛力，有望成為化肥、農(nóng)藥等的替代品[21]。有研究表明，加入假單胞菌可以刺激植物防御酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）的產(chǎn)生[22]。Zhou等[23]研究表明，接種地衣芽孢桿菌可有效緩解鹽濃度對菊花的有害影響;在鹽堿土中接種地衣芽孢桿菌的菊花56 d 后存活率為76%，而未接菌的菊花種子56 d后的存活率為0。常慧萍等[24]用假單胞菌、芽孢桿菌菌液對小麥種子進行浸種處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小麥幼苗根長、株高分別較對照（無菌液處理）顯著增加。該試驗運用3株植物根際促生菌（蠟樣芽孢桿菌H-15、阿耶波多氏芽孢桿菌H-6、伯克氏菌P 4）處理金線蓮幼苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3株植物根際促生菌的應(yīng)用均可顯著提高金線蓮的成活率，降低發(fā)病率，鮮重增加率也顯著提高，H-15處理下的葉片增加率較為顯著，可見該試驗所使用的3株促生菌對金線蓮均有顯著促生作用。

該試驗所使用的3株促生菌處理下的多糖含量均有所上升，這與唐明娟[25]的研究結(jié)果相一致。而總黃酮含量除P 4處理比CK提高4%外，根際促生菌H-15、H-6處理下的總黃酮含量與CK相比略有下降，分別比CK降低了4%、7%。韓麗琴等[26]研究指出，中藥中黃酮類物質(zhì)和微量元素并不是單獨發(fā)揮其藥效作用，如黃酮類成分可與微量元素Cu結(jié)合形成金屬配合物，從而發(fā)揮其抗氧化作用;單純討論黃酮或微量元素，不能很好地體現(xiàn)中藥的作用，必須將二者結(jié)合起來。故對該試驗不同處理的微量元素進行測定，發(fā)現(xiàn)P 4處理下的微量元素含量（除Mo外）普遍高于對照，根際促生菌H-6處理下微量元素Cr、Ni、Cu的含量均高于對照，根際促生菌H-15處理下只有微量元素Cu的含量比對照略有增加。由此推測，P 4處理下總黃酮含量高于對照可能與其微量元素含量普遍提高有關(guān)系。

王正銀等[27]研究指出，生育過程中尤其在油菜生長中期、后期，一般以碳素代謝為主，呈現(xiàn)出糖高氮低的代謝特點，并以優(yōu)質(zhì)油菜表現(xiàn)更明顯。劉浩榮等[28]測定了油菜莖葉可溶性糖和游離氨基酸含量，試驗結(jié)果也顯示可溶性糖比游離氨基酸更能反映植株生長及產(chǎn)量形成能力。這與該試驗結(jié)果相一致，雖然不同根際促生菌處理下金線蓮的游離氨基酸含量均低于CK，但多糖含量有所上升，與此同時，存活率、鮮重增加率等指標也明顯增加。此外，根際促生菌處理下的金線蓮體積顯著高于CK，故植株總的游離氨基酸含量可能會被稀釋，從而造成相同質(zhì)量下，體積大的金線蓮中游離氨基酸含量下降。

總的來說，該試驗所用的3種根際促生菌可增加金線蓮產(chǎn)量、提高存活率、降低發(fā)病率，具有良好的促生效果，也為如何解決金線蓮移栽成活率低的問題提供新的視角。3種根際促生菌處理下多糖含量整體上升、游離氨基酸含量整體下降，不同處理對于不同微量元素的含量有不同的表現(xiàn)，但中藥成分復(fù)雜多樣，定性定量地檢測其中一種或幾種成分存在與否、含量多少，難以評價其優(yōu)劣[29]，以后還是要結(jié)合中藥臨床效用，從而對其整體表現(xiàn)進行一個全面的評估。

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