氟苯尼考對水生細(xì)菌耐藥性的影響研究

廖翠怡 陶松若 彭金菊 丁月霞 馬驛

摘要 [目的]建立水體模型，探究氟苯尼考對水生細(xì)菌耐藥性的影響。[方法]將水體樣品分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組，每組3個(gè)重復(fù)，各組添加不同濃度的氟苯尼考。分離培養(yǎng)建模前以及建模后第14、28、56天水生細(xì)菌，利用微量肉湯二倍稀釋法和KB藥敏紙片法對分離的水生細(xì)菌分別進(jìn)行氟苯尼考和17種抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)。[結(jié)果]第56天收集的Ⅴ組水生細(xì)菌對氟苯尼考的耐藥率最高，達(dá)到25.00%;分離的氟苯尼考敏感菌和耐藥菌對阿莫西林、鏈霉素和多西環(huán)素等8 種藥物的敏感性差異極顯著（P<0.01）。[結(jié)論]氟苯尼考在一定程度上增加了水生細(xì)菌的耐藥性。

關(guān)鍵詞 氟苯尼考;水生細(xì)菌;耐藥性

中圖分類號(hào) S 948文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2022）02-0099-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.02.026

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effect of Florfenicol on the Drug Resistance of Aquatic Bacteria

LIAO Cui-yi， TAO Song-ruo， PENG Jin-ju et al

（Department of Veterinary Medicine， College of Coastal Agricultural Sciences， Guangdong Ocean University， Zhanjiang，Guangdong524088）

Abstract [Objective]To establish a water model and study the effects of florfenicol on the drug resistance of aquatic bacteria. [Method]The water samples were divided into groupsⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ andⅤwith 3 replications in each group， and different concentrations of florfenicol were added. The sensitivity tests of florfenicol and 17 kinds of antibiotics were carried out on the aquatic bacteria isolated and cultured before modeling and on the 14th， 28th and 56th days after modeling by double dilution method of broth and KB disk method. [Result] On the 56th day， the resistance rate of aquatic bacteria in group V to florfenicol was the highest （25.00%）.The sensitivity of florfenicol sensitive bacteria and drug-resistant bacteria to 8 kinds of drugs （amoxicillin， streptomycin， doxycycline，etc.） was extremely significantly different （P < 0.01）. [Conclusion] Florfenicol increased the drug resistance of aquatic bacteria to a certain extent.

Key words Florfenicol;Aquatic bacteria;Drug resistance

基金項(xiàng)目 廣東省教育廳2019年廣東省普通高校特色創(chuàng)新類項(xiàng)目（2019KTSCX057）;廣東省教育廳2021年度普通高校重點(diǎn)領(lǐng)域?qū)ｍ?xiàng)（2021ZDZX4003）。

作者簡介 廖翠怡（1996—），女，廣東惠州人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物生產(chǎn)學(xué)。

*通信作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)研究。

收稿日期 2021-05-31

抗生素作為水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治和促進(jìn)生長的藥物被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。水產(chǎn)養(yǎng)殖中經(jīng)?；祜暯o藥，投入的抗生素藥物僅有少量被水生動(dòng)物吸收，大部分以原藥的形式排到環(huán)境中，造成養(yǎng)殖區(qū)及廢水排放水域抗生素殘留，最終導(dǎo)致水生細(xì)菌耐藥性不斷增加[1]。

氟苯尼考是甲砜霉素的3位氟衍生物，最初用于防治產(chǎn)氣單胞菌、弧菌等引起的水產(chǎn)動(dòng)物疾病，現(xiàn)已被廣泛用于預(yù)防與治療食品性動(dòng)物疾病，如豬黃痢、白痢，奶牛子宮內(nèi)膜炎，雞大腸桿菌病以及魚類鰻鱺愛德華氏病和赤鰭病等細(xì)菌性疾病[2-6]。氟苯尼考能夠通過阻礙細(xì)菌肽鏈的延長，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，對革蘭氏陰性菌、陽性菌引起的疾病有顯著療效[7-8]。由于氟苯尼考的大量使用，病原菌和環(huán)境細(xì)菌對其產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。陳招弟[9]從凡納濱對蝦養(yǎng)殖微生態(tài)制劑中分離出100個(gè)菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各菌株對除恩諾沙星以外的8種抗生素都有不同程度的耐藥性，其中對氟苯尼考的耐藥率達(dá)100%。

筆者通過對模型中分離的水生細(xì)菌進(jìn)行抗菌藥敏感性試驗(yàn)，研究氟苯尼考對水生細(xì)菌耐藥性的影響，旨在為水產(chǎn)養(yǎng)殖中合理使用抗生素提供科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水體樣品來源。

采集廣東海洋大學(xué)園藝實(shí)習(xí)基地的池塘水，采集水樣于室溫下靜置24 h。

1.1.2 主要試劑。

氟苯尼考（含量98%），購自山東國邦藥業(yè)有限公司（批號(hào)701-2005101）;17種藥敏紙片，購自杭州馳成醫(yī)藥科技有限公司;LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基，均購自北京酷來搏科技有限公司。

1.1.3 主要儀器。

手提式高壓蒸汽滅菌器（DSX-18L-I），上海申安醫(yī)療器械廠;超凈化工作臺(tái)（SW-CJ-1D），江蘇蘇凈集團(tuán)安泰公司;電子分析天平（FA-TC系列），力辰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;生化培養(yǎng)箱（SPX-250），上海福絮實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 水體模型的建立。

將水樣分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組，分裝于塑料桶（5 L/桶）內(nèi)，每組3個(gè)重復(fù)。每組分別加入0、0.1、1.0、10.0、100.0 mg/L濃度梯度的氟苯尼考，于（25±3）℃室溫下培養(yǎng)。

1.2.2 水生細(xì)菌的分離與培養(yǎng)。

建模前以及建模后第14、28、56天分離、培養(yǎng)和保存水生細(xì)菌。分別用各組采集水樣制備不同濃度的細(xì)菌懸液，涂布于LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)24～48 h。每組用接種環(huán)挑取60株淡黃色單個(gè)菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃下培養(yǎng)24 h;加入30%甘油，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 水生細(xì)菌對氟苯尼考的敏感性試驗(yàn)。

利用微量肉湯二倍稀釋法進(jìn)行水生細(xì)菌對氟苯尼考的敏感性試驗(yàn)。復(fù)蘇水生細(xì)菌，制備0.5麥?zhǔn)蠞岫染?。?6孔板第1行為例，第1孔加入菌液180 μL和氟苯尼考藥液20 μL，其他孔只加入菌液100 μL。第1孔混合均勻后吸出100 μL到第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，棄去100 μL，第12孔作為空白對照，12個(gè)孔內(nèi)菌液中氟苯尼考濃度分別為256.00、128.00、64.00、32.00、16.00、8.00、4.00、2.00、1.00、0.50、0.25、0 μg/mL，每個(gè)菌株重復(fù)3次。于28 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。以孔內(nèi)肉湯清亮、無菌生長的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.4 水生細(xì)菌對其他抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)。

根據(jù)氟苯尼考敏感性試驗(yàn)結(jié)果，篩選出30株建模前氟苯尼考敏感菌和30株建模后氟苯尼考耐藥菌。參照美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（CLSI）推薦的KB藥敏紙片法進(jìn)行水生細(xì)菌對17種抗菌藥的敏感性試驗(yàn)，每種藥物重復(fù)3次。

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，比較氟苯尼考敏感菌和耐藥菌對同一種抗菌藥的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 水生細(xì)菌對氟苯尼考的敏感性試驗(yàn)

隨機(jī)挑取10株細(xì)菌，采用PCR方法擴(kuò)增16S rDNA基因。然后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行基因序列比對。培養(yǎng)分離的水生細(xì)菌為假單胞菌屬（Pseudomonas）和芽孢桿菌屬（Bacillus）的細(xì)菌。

由表1可知，氟苯尼考對建模前分離的水生細(xì)菌60%以上菌株的最小抑菌濃度（MIC）為32.00 μg/mL，故MIC≤32.00 μg/mL和MIC≥256.00 μg/mL的菌株分別為氟苯尼考敏感菌和氟苯尼考耐藥菌。

從表2可以看出，第14～56天，Ⅰ組耐藥率為5.00%～11.67%，Ⅱ組耐藥率為5.00%～11.67%，Ⅲ組耐藥率為6.67%～18.33%，Ⅳ組耐藥率為5.00%～18.33%，Ⅴ組耐藥率為8.33%～25.00%，說明隨著時(shí)間的延長，在相同氟苯尼考濃度下水生細(xì)菌的耐藥率也逐漸升高。

2.2 水生細(xì)菌對其他抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)

利用KB藥敏紙片法測定17種抗菌藥對建模前分離的30株氟苯尼考敏感菌和建模后分離的30株氟苯尼考耐藥菌的抑菌圈直徑，結(jié)果見表3。由表3可知，在17種供試抗菌藥中，氟苯尼考敏感菌對阿莫西林、鏈霉素、多黏菌素B、多西環(huán)素、氟苯尼考、利福平、頭孢噻肟、丁胺卡那8種抗菌藥的抑菌圈直徑極顯著大于氟苯尼考耐藥菌（P<0.01），氟苯尼考敏感菌對紅霉素、磷霉素和恩諾沙星的抑菌圈直徑與氟苯尼考耐藥菌差異顯著（P<0.05），氟苯尼考敏感菌對頭孢氨芐、環(huán)丙沙星、呋喃妥因和克拉霉素的抑菌圈直徑與氟苯尼考耐藥菌差異不顯著（P>0.05），而林可霉素和青霉素G對氟苯尼考敏感菌和耐藥菌均無抑制作用（抑菌圈直徑為0 mm）。

3 討論

集約化的水產(chǎn)養(yǎng)殖中經(jīng)常使用大量的抗生素用于預(yù)防和治療細(xì)菌性疾病，其中使用的抗生素有70%～80%通過各種途徑被釋放到環(huán)境中，抗生素在環(huán)境中殘留容易導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[10-11]。韓千帆[12]研究發(fā)現(xiàn)渤海養(yǎng)殖區(qū)養(yǎng)殖水體和自然水體中環(huán)丙沙星和恩諾沙星顯示出高生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和耐藥性風(fēng)險(xiǎn)。朱澤亮[13]從灞河西安城區(qū)段水體篩選出的氣單胞菌大多數(shù)對頭孢噻肟、頭孢吡肟、磺胺甲惡唑和美羅培南4種抗生素有較強(qiáng)的耐藥性。孫永嬋等[14]研究發(fā)現(xiàn)福建省大部分皺紋盤鮑養(yǎng)殖水體異養(yǎng)菌對青霉素、卡那霉素、慶大霉素、利福平有耐藥性，耐藥率高達(dá)83.95%。Hern ndez等[15]研究發(fā)現(xiàn)殘留在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的喹諾酮類藥物會(huì)導(dǎo)致水生細(xì)菌產(chǎn)生喹諾酮耐藥基因。該試驗(yàn)結(jié)果表明水生細(xì)菌對氟苯尼考的耐藥率會(huì)隨藥物濃度的增大和作用時(shí)間的不斷延長而逐漸增加。環(huán)境細(xì)菌的耐藥性能否傳遞給人源或動(dòng)物源細(xì)菌，還需要進(jìn)一步研究。

由于抗生素的廣泛使用，在藥物的選擇性壓力下會(huì)導(dǎo)致多重耐藥菌的產(chǎn)生[15]。例如，智利4個(gè)鮭魚養(yǎng)殖場71.8%的菌株對多種抗生素表現(xiàn)出較高的耐藥性[16]。李敏[17]研究發(fā)現(xiàn)從雨水徑流中分離的200株可培養(yǎng)細(xì)菌中，有耐藥性的細(xì)菌占96.95%，其中有多重耐藥性的細(xì)菌占62.30%。王瑞旋等[18]研究發(fā)現(xiàn)廣東陽江地區(qū)的香港牡蠣養(yǎng)殖水體細(xì)菌對氯霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率較低，對呋喃唑酮的耐藥率最高，對卡那霉素及青霉素的耐藥率波動(dòng)較大。吳小梅[19]研究了美洲鰻鱺及其養(yǎng)殖水體分離耐藥細(xì)菌的耐藥率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)108株耐藥菌株對阿莫西林的耐藥率高達(dá)90.7%，93.5%的菌株對3種及以上的藥物具有抗藥性。該試驗(yàn)結(jié)果表明，在17種抗菌藥中氟苯尼考敏感菌對其中8種藥物的敏感性與氟苯尼考耐藥菌差異極顯著，對其中3種抗菌藥的敏感性差異顯著，說明氟苯尼考?xì)埩舨粌H會(huì)誘導(dǎo)水生細(xì)菌對其產(chǎn)生了耐藥性，而且誘導(dǎo)耐藥菌對其他抗生素產(chǎn)生耐藥性。筆者通過對建模前后細(xì)菌進(jìn)行抗菌藥的敏感試驗(yàn)，為抗生素的規(guī)范化使用提供了理論依據(jù)，為加快推進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展和保護(hù)水域生態(tài)環(huán)境提供了理論支撐。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳清華.水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中抗生素使用的風(fēng)險(xiǎn)及其控制[J].水產(chǎn)科技情報(bào)，2009，36（2）：67-72.

[2] 席進(jìn)華，楊金海.藥物治療豬傳染性胸膜肺炎的臨床試驗(yàn)[J].鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)，2005，25（3）：193.

[3] 張麗云，李繼連.氟苯尼考混懸劑對奶牛子宮內(nèi)膜炎的療效試驗(yàn)[J].中國奶牛，2008（2）：29-31.

[4] 蔡玉梅，陳文玫，吳紹強(qiáng).氟苯尼考可溶性粉對雞大腸桿菌病的療效試驗(yàn)[J].中國獸藥雜志，2002，36（6）：34-35.

[5] 孫雷，張?bào)P，徐倩，等.氟苯尼考的毒性及殘留檢測方法研究進(jìn)展[J].中國獸藥雜志，2009，43（6）：49-52.

[6] 李世宏，劉希望，楊亞軍，等.氟苯尼考的應(yīng)用與殘留研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（2）：15-17.

[7] 孫繼超，陳晨，張東輝，等.氟苯尼考的研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（20）：31-36.

[8] 張春輝，邢廣旭，胡驍飛，等.動(dòng)物專用藥物氟苯尼考的研究進(jìn)展[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2019，38（5）：95-98.

[9] 陳招弟.凡納濱對蝦養(yǎng)殖微生態(tài)制劑耐藥性的研究[D].上海：上海海洋大學(xué)，2019.

[10] 朱柏珍，張艷玲，方容.常見革蘭氏陽性球菌接種濃度對替考拉寧紙片擴(kuò)散法藥敏結(jié)果分析[J].中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2017，19（11）：94-96.

[11] SAMUELSEN O B，TORSVIK V，ERVIK A.Long-range changes in oxytetracycline concentration and bacterial resistance towards oxytetracycline in a fish farm sediment after medication[J].Science of the total environment，1992，114：25-36.

[12] 韓千帆.山東半島海水養(yǎng)殖場中抗生素的分布、復(fù)合污染和風(fēng)險(xiǎn)評估[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2020.

[13] 朱澤亮.灞河氣單胞菌（Aeromonas）抗生素耐藥性和重金屬抗性研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2020.

[14] 孫永嬋，王瑞旋，趙曼曼，等.鮑消化道及其養(yǎng)殖水體異養(yǎng)菌的耐藥性研究[J].南方水產(chǎn)科學(xué)，2017，13（3）：58-65.

[15]HERN NDEZ A，S NCHEZ M B，MARTNEZ J L.Quinolone resistance：Much more than predicted[J].Frontiers in microbiology，2011，2：1-6.

[16]MIRANDA C D，ZEMELMAN R.Antimicrobial multiresistance in bacteria isolated from freshwater Chilean salmon farms[J].Science of the total environment， 2002，293（1/2/3）：207-218.

[17] 李敏.雨水徑流中多重耐藥性細(xì)菌在石英砂表面的粘附特性研究[D].北京：北京交通大學(xué)，2017.

[18] 王瑞旋，李炳，林華劍，等.牡蠣體內(nèi)及其養(yǎng)殖水體中細(xì)菌耐藥性研究[J].海洋科學(xué)，2020，44（6）：56-63.

[19] 吳小梅.美洲鰻鱺與其養(yǎng)殖水體細(xì)菌的耐藥性、抗性基因及整合子的研究[D].廈門：集美大學(xué)，2016.