維生素C對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺非特異性免疫的影響

米少輝 尹欣茹 李軍濤 張澤龍 冼健安 王冬梅

摘要：為探究維生素C作為飼料添加劑短期投喂克氏原螯蝦（Procambarusclarkii）對(duì)其肝胰腺非特異性免疫的影響，并尋找出最適的添加量，將規(guī)格相同（27g±3g）、健康無(wú)傷的克氏原螯蝦暫養(yǎng)7d后分5組，對(duì)照組投喂基礎(chǔ)飼料，4個(gè)試驗(yàn)組投喂的飼料為在基礎(chǔ)飼料中添加維生素C（添加量分別：0.1、0.2、0.4、0.8g/kg）。投喂5d后，取試驗(yàn)蝦肝胰腺進(jìn)行免疫相關(guān)酶活指標(biāo)的測(cè)定，結(jié)果顯示：添加0.2g/kg的維生素C可以顯著提升克氏原螯蝦肝胰腺中SOD、CAT、T-AOC等抗氧化酶的活性，對(duì)于免疫酶ACP、AKP的活力依然有顯著提升作用。并且對(duì)于肝胰腺中MDA的含量有降低作用（P<0.05）。0.4g/kg添加組，能夠顯著提升肝胰腺中CAT活力，并且顯著降低MDA含量（P<0.05）。由此可以得出在飼料中添加0.2～0.4g/kg維生素C可以在一定程度上提升克氏原螯蝦肝胰腺的非特異性免疫。

關(guān)鍵詞：維生素C;克氏原螯蝦;非特異性免疫

目前，維生素C作為飼料添加劑[1]，在魚[2-4]、蝦[5-6]、海參[7]、中華鱉[8]均有所研究，在飼料中適當(dāng)比例的添加維生素C投喂，均已證明適量添加維生素C可以增加水生生物的非特異性免疫以及抗應(yīng)激能力。但是發(fā)現(xiàn)其共同特點(diǎn)是均投喂30d以上，投喂時(shí)間較長(zhǎng)。添加維生素C飼料短期投喂水生生物，對(duì)其非特異性免疫影響的研究較少。因此本試驗(yàn)旨在探究飼料中添加不同水平的維生素C，投喂5d，對(duì)克氏原螯蝦非特異性免疫的影響，進(jìn)而使維生素C能更大限度地發(fā)揮作用，得以應(yīng)用。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用的克氏原螯蝦（平均體重27.0g±3.0g）來(lái)源為海南歸耕田農(nóng)業(yè)科技有限公司。試驗(yàn)用水族箱大小為60cm×43cm×36cm。試驗(yàn)用維生素C由?？谒{(lán)海中漁生物科技有限公司提供。

1.2試驗(yàn)飼料

試驗(yàn)所用基礎(chǔ)飼料為蝦料專用配合飼料（粗蛋白≥28.0%，粗脂肪≥3.0%，粗纖維≤10.0%，粗灰分≤18.0，0.6%≤總磷≤1.4%，鈣0.5～5.0，水分≤12.5%）。試驗(yàn)組飼料為在基礎(chǔ)飼料中分別添加0.1、0.2、0.4、0.8g/kg的維生素C。

1.3試驗(yàn)儀器

超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒、微量丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）測(cè)定試劑盒、酸性磷酸酶（ACP）測(cè)定試劑盒、堿性磷酸酶（AKP）測(cè)定試劑盒、蛋白定量（TP）測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程有限公司。生理鹽水（已提前配制）。

臺(tái)式高速冷凍微量離心機(jī)、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、可見紫外分光光度計(jì)、數(shù)顯恒溫水浴鍋、多樣品組織研磨機(jī)、電子天平、2.5mL無(wú)菌注射器、1mL無(wú)菌注射器（江西三鑫醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)）、1.5mLAxygen離心管、高壓滅菌鍋、增氧機(jī)、移液槍等。

1.4飼養(yǎng)管理

將購(gòu)買的克氏原螯蝦在大小為60cm×43cm×36cm，水深15cm的水族箱暫養(yǎng)7d后，挑選健康強(qiáng)壯、規(guī)格一致的克氏原螯蝦，共分為5組（編號(hào)A—E），每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)在試驗(yàn)箱中養(yǎng)殖克氏原螯蝦15尾。A組為對(duì)照組，投喂基礎(chǔ)飼料，各試驗(yàn)組飼料中維生素C添加量分別為：B組0.1g/kg，C組0.2g/kg，D組0.4g/kg，E組0.8g/kg。養(yǎng)殖期間水溫為23～26℃。在水族箱中增加適量的遮蔽物，防止試驗(yàn)期間成蝦自相殘殺。試驗(yàn)用水為曝氣的自來(lái)水，水體pH值控制在7.5左右。養(yǎng)殖期間均充氣養(yǎng)殖，除投喂飼料有區(qū)別外，其他變量保持一致。每天早晚投喂兩次且以晚上投喂量為主，投喂量為成蝦體重的3%～5%，各組間投喂量保持一致，具體以實(shí)際吃食情況為準(zhǔn)。暫養(yǎng)結(jié)束后開始投喂試驗(yàn)，在投喂5d后，在3個(gè)平行的箱子各取3尾克氏原螯蝦，取其肝胰腺進(jìn)行酶活等生理生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.5樣品的采集與制備

解剖螯蝦，取適量肝胰腺，用0.85%氯化鈉生理鹽水清洗去除污物，用濾紙吸干水分后置于離心管中放入液氮快速冷凍，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，備用。

1.6相關(guān)免疫酶活性指標(biāo)測(cè)定

超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、丙二醛含量（MDA）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。

1.7數(shù)據(jù)分析

用Excel2019求得試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值以及標(biāo)準(zhǔn)差，利用軟件SPSSStatistics18.0進(jìn)行單因素方差分析（one-wayANOVA）和Duncan多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SD）表示，（P<0.05）為差異性顯著。

2結(jié)果與分析

2.1飼料中維生素C添加量對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺SOD活力的影響

隨著飼料中維生素C添加量的增加，克氏原螯蝦肝胰腺中SOD活力呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，其中在飼料中添加0.2g/kg維生素C能夠顯著增強(qiáng)克氏原螯蝦肝胰腺SOD活力（P<0.05），其他各維生素C添加組與對(duì)照組相比均不存在明顯差異（P>0.05）。見圖1。

柱上標(biāo)不同字母表示差異顯著（P<0.05），相同字母表示差異不顯著（P>0.05），下同。

2.2飼料中維生素C添加量對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺M(fèi)DA含量的影響

隨著飼料中維生素C添加量的增加，克氏原螯蝦肝胰腺中MDA含量呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)，其中在飼料中添加0.2、0.4g/kg維生素C能夠顯著降低克氏原螯蝦肝胰腺中MDA的含量（P<0.05），其他各維生素C添加組與對(duì)照組相比均不存在明顯差異（P>0.05）。見圖2。

2.3飼料中維生素C添加量對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺CAT活力的影響

隨著飼料中維生素C添加量的增加，克氏原螯蝦肝胰腺中CAT活力呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，其中在飼料中添加0.2、0.4g/kg維生素C能夠顯著增強(qiáng)克氏原螯蝦肝胰腺CAT活力（P<0.05）。0.2g/kg添加組肝胰腺CAT活力最高，顯著高于其他試驗(yàn)組和對(duì)照組（P<0.05）。除0.2、0.4g/kg添加量外，其他各維生素C添加組與對(duì)照組相比均不存在明顯差異（P>0.05）。見圖3。

2.4飼料中維生素C添加量對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺AKP活力的影響

隨著飼料中維生素C添加量的增加，克氏原螯蝦肝胰腺中AKP活力變化趨勢(shì)為隨著維生素C添加量的增加，AKP活力先升高后降低，當(dāng)在飼料中添加0.2g/kg維生素C時(shí)，肝胰腺中的AKP活力最高，并且顯著高于對(duì)照組，可見，在飼料中添加0.2g/kg維生素C能夠顯著增強(qiáng)克氏原螯蝦肝胰腺AKP活力（P<0.05）。除0.2g/kg添加組外，其他各維生素C添加組與對(duì)照組相比均不存在明顯差異（P>0.05）。見圖4。

2.5飼料中維生素C添加量對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺ACP活力的影響

隨著飼料中維生素C添加量的增加，克氏原螯蝦肝胰腺中ACP活力變化趨勢(shì)為隨著維生素C添加量的增加，ACP活力先升高后降低，當(dāng)在飼料中添加0.2g/kg維生素C時(shí)，肝胰腺中的ACP活力最高，并且顯著高于對(duì)照組，可見，在飼料中添加0.2g/kg維生素C能夠顯著增強(qiáng)克氏原螯蝦肝胰腺ACP活力（P<0.05）。除0.2g/kg添加組外，其他各維生素C添加組與對(duì)照組相比均不存在明顯差異（P>0.05）。見圖5。

2.6飼料中維生素C添加量對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺T-AOC變化的影響

克氏原螯蝦肝胰腺中的總抗氧化能力，隨著飼料中維生素C添加量的增加，呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，其中肝胰腺T-AOC在維生素C添加量為0.2g/kg時(shí)最優(yōu)，當(dāng)在飼料中添加0.2g/kg維生素C時(shí)，肝胰腺中的T-AOC顯著高于對(duì)照組，可見，在飼料中添加0.2g/kg維生素C能夠顯著增強(qiáng)克氏原螯蝦肝胰腺T-AOC（P<0.05）。除0.2g/kg添加組外，其他各維生素C添加組與對(duì)照組相比均不存在明顯差異（P>0.05）。見圖6。

3討論

SOD和CAT是生物體內(nèi)抗氧化指標(biāo)的指示酶，在機(jī)體內(nèi)主要參與機(jī)體內(nèi)自由基的清除，從而維持機(jī)體內(nèi)自由基的動(dòng)態(tài)平衡[9]。MDA是自由基引起脂質(zhì)過(guò)氧化所產(chǎn)生的產(chǎn)物，其含量的高低可以間接反應(yīng)機(jī)體自由基的含量以及脂質(zhì)的過(guò)氧化程度[10]。T-AOC反應(yīng)抗氧化系統(tǒng)整體水平，主要抑制過(guò)氧化鏈產(chǎn)生，達(dá)到消除自由基的效應(yīng)[11]。AKP和ACP是生物體內(nèi)巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，主要參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝，在免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要作用，同樣可以間接反應(yīng)機(jī)體的免疫能力[12]。另外，甲殼動(dòng)物氧化代謝的主要場(chǎng)所為肝胰腺而非血清[13]，所以本試驗(yàn)主要研究維生素C添加對(duì)肝胰腺中免疫指標(biāo)的影響。

有研究表明維生素作為飼料添加劑的應(yīng)用具有增強(qiáng)蝦類免疫力以及抗氧化能力的重要作用，并降低機(jī)體的應(yīng)激性，增加對(duì)外界環(huán)境因子劇烈變化的抵抗能力[14]。王偉慶等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)對(duì)蝦的飼料中添加適量的維生素C衍生物維生素C多聚磷酸酯（LAPP），能夠提高其抵抗副溶血弧菌的能力，提高其機(jī)體的免疫性能。另外，LAPP的添加提高了中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞吞噬金黃色葡萄球菌的能力，表明其對(duì)細(xì)菌感染的抗病性得到提高。宋理平等[16]的研究表明，維生素C能夠增加中國(guó)明對(duì)蝦（Penaeuschinensis）幼體的免疫力。維生素C和β-葡聚糖協(xié)同使用，使對(duì)蝦幼體對(duì)于哈維氏弧菌的抵抗力增強(qiáng)，同時(shí)增強(qiáng)了免疫酶的活性以及提高了免疫保護(hù)率。王文婧等[17]研究發(fā)現(xiàn)，大劑量投喂維生素C能夠提高凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeusvannamei）肝胰腺溶菌酶（LZM）和酸性磷酸酶（ACP）的活性，對(duì)于輕度擁擠脅迫造成的凡納濱對(duì)蝦免疫機(jī)能的變化有一定的緩沖作用，但是不能消除脅迫對(duì)其所造成的影響。Kong等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在克氏原螯蝦日糧中添加250.12mg/kg和321.38mg/kgVc均能提升克氏原螯蝦的非特異性免疫。上述研究與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。

4結(jié)論

在本試驗(yàn)中，添加0.2g/kg的維生素C可以顯著提升克氏原螯蝦肝胰腺中SOD、CAT、T-AOC等抗氧化酶的活性，對(duì)于免疫酶ACP、AKP的活力有顯著提升作用，并且對(duì)于肝胰腺中MDA的含量有降低作用。0.4g/kg添加組，能夠顯著提升肝胰腺中CAT活力，并且顯著降低MDA含量。由此可以得出，在飼料中添加0.2～0.4g/kg維生素C可以在一定程度上提升克氏原螯蝦肝胰腺的非特異性免疫。

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（收稿日期：2021-09-30;修回日期：2021-12-16）