同位素內(nèi)標(biāo)-QuEChERS結(jié)合UHPLC-Q-Orbitrap HRMS法快速檢測(cè)果蔬中84種除草劑殘留

王興寧，李 志，唐亞峰，李 巧，戴 唯，李 潔，朱 明

(貴陽海關(guān)綜合技術(shù)中心，貴州 貴陽 550081)

0 引言

除草劑是指用來防治雜草和有害植物的藥劑，按照化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為磺酰脲類、咪唑啉酮類、三嗪類、酰胺類、二硝基苯胺類、芳氧苯氧丙酸酯類、二苯醚類、環(huán)己烯酮類、硫代氨基甲酸酯類等[1]。GB 2763-2021規(guī)定了564種農(nóng)藥10 092項(xiàng)最大殘留限量，其中除草劑類農(nóng)藥占據(jù)著重要比例，如氟吡禾靈等在果蔬中殘留限量為0.02～1 mg/kg[2]。除草劑的使用大大提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率，但也存在一些問題，如作物品種的敏感性、雜草抗藥性和殘留藥害等負(fù)面影響，如磺酰脲類除草劑土壤濃度在達(dá)到1 g/hm時(shí)即可對(duì)后茬敏感作物產(chǎn)生藥害。雖然除草劑及其代謝降解產(chǎn)物對(duì)哺乳動(dòng)物、魚類、鳥類和人類毒性很低，但攝人一定量的除草劑可引起腹瀉、食欲減退、抑郁，出現(xiàn)肺、肝臟、脾臟和腦膜的嚴(yán)重充血等毒性反應(yīng)[3]。當(dāng)前，中國、日本和美國等許多國家和地區(qū)已對(duì)其在農(nóng)產(chǎn)品中的除草劑殘留規(guī)定了嚴(yán)格限量。因此，建立操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的對(duì)果蔬中多種類除草劑的殘留量快速檢測(cè)方法迫在眉睫。

當(dāng)前檢測(cè)除草劑的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[4-5]、高效液相色譜法[6]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7-8]和高分辨質(zhì)譜法[9-10]，但上述方法存在檢測(cè)的除草劑種類單一、樣品前處理操作繁瑣、檢測(cè)通量低、對(duì)復(fù)雜基質(zhì)的抗干擾能力弱，易出現(xiàn)假陽性等缺點(diǎn)。QuEChERS方法是美國農(nóng)業(yè)部Anastassiades等人于2003年開發(fā)的一種基于固相萃取和基質(zhì)固相分散技術(shù)的預(yù)處理方法，具有簡(jiǎn)單、快速，用時(shí)短，受到廣大食品安全檢測(cè)人員的喜愛[11-12]。靜電場(chǎng)軌道離子阱(Orbitrap)高分辨質(zhì)譜具有靈敏度高、選擇性好、抗干擾能力強(qiáng)和高通量等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)被分析工作者逐漸應(yīng)用到了多種類、高通量農(nóng)藥殘留的快速篩查工作中[13]。當(dāng)前采用同位素內(nèi)標(biāo)-QuEChERS結(jié)合高分辨質(zhì)譜檢測(cè)果蔬中多種類除草劑殘留的研究報(bào)道甚少。

本文建立了一種同位素內(nèi)標(biāo)、優(yōu)化QuEChERS前處理?xiàng)l件，結(jié)合超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測(cè)果蔬中84種除草劑的方法。并對(duì)實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)的50批水果蔬菜中84種除草劑殘留進(jìn)行檢測(cè)，方法具有靈敏度高、雜質(zhì)干擾少、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，可為果蔬中除草劑殘留的風(fēng)險(xiǎn)篩查提供技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UHPLC-Q Exactive 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；分析天平PB1502-L(瑞士Metter Toledo公司，感量10 mg)和XP205DR(瑞士Metter Toledo 公司，感量0.01 mg)；移液器(美國Thermo公司)；Elix/Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

乙腈、甲醇、甲酸銨、甲酸(上海安譜有限公司)；無水硫酸鎂(MgSO4)和乙酸鈉均為農(nóng)殘級(jí)(山東西雅試劑)；N-丙基乙二胺(PSA，40～60 μm)，石墨化炭黑(GCB，30～90 μm)，C18(50 μm，60 ?)農(nóng)殘級(jí)(上海安譜有限公司)；多壁碳納米管(MWCNTs，長度10～30 μm，外徑 10～20 nm，內(nèi)徑 5～10 nm，純度>95% ，比表面積>200 m2/g，南京先豐納米材料科技有限公司)；緩沖鹽試劑包：含有6 g無水硫酸鎂和1.5 g乙酸鈉(天津艾杰爾公司)。84種除草劑標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；同位素內(nèi)標(biāo)(±)氟吡禾靈-d4(純度99.0%)(加拿大Toronto Research Chemical公司)。

單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：稱取84種除草劑標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別用乙腈或甲苯溶解并定容至10 mL，配制成1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-20 ℃避光保存。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：再用乙腈配制成10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和氟吡禾靈-d4的內(nèi)標(biāo)溶液，于-4 ℃避光保存。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液用乙腈稀釋，配置成5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL(含內(nèi)標(biāo)50 ng/mL)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于-4 ℃避光保存。

果蔬樣品(白菜、柑橘、獼猴桃、馬鈴薯、結(jié)球甘藍(lán)、甜椒、洋蔥、芹菜、菠菜、蘿卜等)均來自實(shí)驗(yàn)室日常抽檢的樣品。

1.2 儀器工作條件

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC HSS- T3(2.1×50 mm,1.7 μm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相A為5 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為5 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸甲醇溶液。二元梯度洗脫程序：0 min時(shí)，B保持為8%；0～9 min時(shí)，B由8%升至95%；9～11 min時(shí)，B由95%升至100%；11～14 min時(shí)，B由100%降至8%；12～15 min時(shí)，B保持在8%。

質(zhì)譜條件：噴霧電壓為 3.5 kV；輔助氣加熱源溫度：350 ℃；金屬毛細(xì)管溫度：320 ℃；鞘氣壓力：4.55 L/min(35 arb)；輔助氣壓力：3 L/min(10 arb)；掃描范圍(m/z)：100～700 Da；管狀透鏡電壓：50 V；包含模式：開；運(yùn)行時(shí)間：15 min。一級(jí)質(zhì)譜全掃描(Full scan)分辨率：R=70 000；自動(dòng)增益控制目標(biāo)離子數(shù)(AGC target)：3e6；最大注入時(shí)間：250 ms。數(shù)據(jù)依賴二級(jí)離子全掃描(data-dependent Full MS2，ddMS2)分辨率：R=35 000；歸一化碰撞能(NCE)：20、45和70 eV；自動(dòng)增益控制目標(biāo)離子數(shù)(AGC target)：2e5；最大注入時(shí)間：120 ms；動(dòng)態(tài)排除：10 s;循環(huán)次數(shù)(Loop count):5；隔離寬度(Isolation width):m/z4.0。84種除草劑的質(zhì)譜信息見表1。

表1 84種除草劑的CAS號(hào)、分子式、離子類型、保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)、質(zhì)量數(shù)測(cè)定值、二級(jí)碎片離子Tab.1 CAS no., molecular formula, ion formation,retention time,accurate mass,Mass determination and product ion of the 84 herbicides

續(xù)表1

續(xù)表1

1.3 樣品的制備

果蔬樣品粉碎后，準(zhǔn)確稱取10 g(精確到0.01 g)于50 mL聚丙烯離心管中，依次加入內(nèi)標(biāo)50 μL(10 μg/mL)、10 mL含1%乙酸乙腈溶液，渦旋5 min。加入6 g無水硫酸鎂和1.5 g 乙酸鈉，劇烈震蕩2 min使之混合均勻，5 000 r/min離心5 min。取上清液1.5 mL至預(yù)裝有150 mg 無水硫酸鎂、25 mg C18和25 mg MWCNTs的微型螺旋蓋聚丙烯離心管中，渦旋混合2 min，68 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm 濾膜，待UHPLC-Q-Orbitrap HRMS測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化和譜庫的建立

根據(jù)84種除草劑的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，選擇Full MS模式進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜母離子全掃描，設(shè)置質(zhì)量范圍m/z80～1 100、分辨率(FWHM)70 000，對(duì)100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)每個(gè)化合物的理論質(zhì)量數(shù)提取一級(jí)母離子色譜圖，得到保留時(shí)間和精確質(zhì)量數(shù)，84種除草劑母離子的實(shí)際質(zhì)量數(shù)偏差均小于5×10-6，符合定性要求[14]。選擇二級(jí)質(zhì)譜Full MS/dd MS2模式，在包含列表(Inclusion list)中輸入每個(gè)化合物的母離子精確質(zhì)量數(shù)，依據(jù)保留時(shí)間設(shè)置掃描時(shí)間段，使質(zhì)譜有針對(duì)性的掃描和裂解，并優(yōu)化碰撞能量得到最佳二級(jí)碎裂子離子質(zhì)譜圖。選擇一級(jí)質(zhì)譜全掃描的母離子作為定量離子，至少選擇2個(gè)具有代表性的二級(jí)質(zhì)譜碎裂離子作為定性離子。結(jié)果表明，大多數(shù)除草劑在ESI+模式具有較好的響應(yīng)強(qiáng)度，因此，選擇[M+H]+離子峰的精確質(zhì)量數(shù)。同時(shí)建立包括名稱、保留時(shí)間、化學(xué)式、精確質(zhì)量數(shù)及特征碎片離子等信息的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜掃描數(shù)據(jù)庫。84種除草劑的質(zhì)譜參數(shù)信息見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

除草劑多屬于中等極性和弱極性化合物，在弱極性的T3柱和C18柱上均具有較好的保留。試驗(yàn)中比較Waters ACQUITY UPLC HSS- T3(2.1×50 mm，1.7 μm)和Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 × 150 mm，4.6 μm)，結(jié)果表明，ACQUITY UPLC HSS-T3柱對(duì)中等極性化合物的保留要優(yōu)于Agilent ZORBAX SB-C18柱。因此，選擇ACQUITY UPLC HSS-T3柱獲得更為優(yōu)異的分離效果。

流動(dòng)相添加劑如甲酸銨和甲酸可顯著改善色譜峰的分離度與靈敏度。試驗(yàn)中以甲醇-水和乙腈-水為流動(dòng)相均不能得到良好的峰形，并對(duì)甲醇-水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、5 mmol/L甲酸銨的水溶液-5 mmol/L甲酸銨的甲醇溶液、5 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液-5 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸甲醇溶液的4種流動(dòng)相進(jìn)行比較。結(jié)果表明，使用5 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液-5 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸甲醇溶液84種類除草劑均獲得理想分離度和靈敏度。在確定的色譜-質(zhì)譜條件下，84種除草劑混標(biāo)(100 ng/mL)總離子流圖見圖1；獼猴桃樣品總離子流圖見圖2；甲草胺、銹去津、敵草凈、乙羧氟草醚的一級(jí)全掃描色譜圖見圖3。由圖3可知目標(biāo)物響應(yīng)強(qiáng)度高、無干擾、分離度高、峰形良好。

圖1 84種除草劑混標(biāo)(100 ng/mL)總離子流圖Fig.1 The total ion chromatogram of 84 herbicide mixtures (100 ng/mL)

圖2 獼猴桃樣品總離子流圖Fig.2 The total ion chromatogram of kiwifruit samples

圖3 甲草胺、銹去津、敵草凈、乙羧氟草醚的色譜圖和質(zhì)譜圖Fig.3 The chromatograms and mass spectra of alachlor,atrazine,desmetryn and fluoroglycofen-ethy

2.3 內(nèi)標(biāo)物的選擇

考慮到不同種類除草劑的化學(xué)差異較大，且苯氧羧酸類除草劑較其他種類除草劑更難以被提取和凈化，因此，本文以屬于苯氧羧酸類除草劑的氟吡禾靈和氟吡禾靈d4同位素內(nèi)標(biāo)作為重點(diǎn)考察對(duì)象。結(jié)果表明，氟吡禾靈d4同位素內(nèi)標(biāo)具有離子化效果好、酸性環(huán)境穩(wěn)定性好、定量誤差小等優(yōu)勢(shì)，并適用于84種除草劑內(nèi)標(biāo)法定量。

2.4 提取溶劑的選擇

QuEChERS法集提取、凈化為一體的前處理方法，可針對(duì)樣品基質(zhì)情況選擇不同吸附劑類型及組合，具有凈化效果好、操作靈活、準(zhǔn)確度高等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為多批次、高通量農(nóng)藥殘留檢測(cè)較為理想的前處理手段[11]。由于部分除草劑含有羧基基團(tuán)，在溶液中呈酸性，使用1%乙酸乙腈為提取溶劑可形成穩(wěn)定的緩沖體系，提高了酸性農(nóng)藥的離子化效率，同時(shí)樣品基質(zhì)的共萃取成分較乙腈少。因此，選擇1%乙酸乙腈為提取溶劑。

2.5 凈化條件的優(yōu)化

試驗(yàn)中選擇基質(zhì)復(fù)雜的空白菠菜樣品添加9種不同種類除草劑進(jìn)行處理，提取液轉(zhuǎn)入預(yù)裝有4種不同組合的吸附劑(MgSO4、C18、PSA、GCB和MWCNTs)的2 mL微型具螺旋蓋離心管中，評(píng)價(jià)回收率結(jié)果。優(yōu)化的吸附劑組合操作步驟如下：1)MgSO4150 mg和C1825 mg；2)MgSO4150 mg和PSA 25 mg；3)MgSO4150 mg和GCB 25 mg；4)MgSO4150 mg和MWCNTs 25 mg。結(jié)果表明：1)、3)和4)均獲得滿意的結(jié)果，除去色素、脂類等雜質(zhì)能力排序?yàn)椋?)>3)>1)，同時(shí)也表明PSA的吸附劑不能用于該方法，易導(dǎo)致含羧基基團(tuán)如氟吡禾靈等目標(biāo)物的損失。最終考慮適合于廣泛基質(zhì)樣品凈化的吸附劑組合為MgSO4150 mg，C1825 mg和MWCNTs 25 mg。圖4為4種吸附劑組合對(duì)菠菜樣品中9種類除草劑的吸附效果比較。

注：吸附劑組合1～4指：1)MgSO4 150 mg和C18 25 mg；2)MgSO4 150 mg和PSA 25 mg；3)MgSO4 150 mg和GCB 25 mg；4)MgSO4 150 mg和MWCNTs 25 mg。圖4 不同吸附劑組合對(duì)菠菜樣品(添加0.05 mg/kg 9種不同種類除草劑)的回收率結(jié)果Fig.4 The effect of clean-up on nine herbicides with different sorbents for spinach samples(spiked at 0.05 mg/kg for nine herbicides)

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

果蔬中色素、有機(jī)酸和脂類等雜質(zhì)易引起基質(zhì)增強(qiáng)或基質(zhì)抑制效應(yīng)，有關(guān)研究表明基質(zhì)種類、基質(zhì)數(shù)量和目標(biāo)物化學(xué)性質(zhì)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)有一定影響[15]?；|(zhì)效應(yīng)的評(píng)估常采用不同基質(zhì)代表性樣品，如菠菜(高色素)和獼猴桃(高酸樣品)來制備基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

按照以下公式計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)：

ME(%)=(m基質(zhì)-m溶劑)/m溶劑×100%

其中ME表示基質(zhì)效應(yīng)，m基質(zhì)和m溶劑表示為基質(zhì)和溶劑匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，當(dāng)ME為-20%～20%、-50%～-20%或20%～50%、<-50%或>50%時(shí)，分別表示輕微、中等和較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，在菠菜和獼猴桃基質(zhì)中84種除草劑的ME為-16%～14%，其基質(zhì)效應(yīng)輕微可以忽略[16]。結(jié)果表明，同位素內(nèi)標(biāo)法定量和優(yōu)化的吸附劑組合凈化，不僅保證較高的回收率，還將基質(zhì)效應(yīng)的影響降至最低，無需采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的方式進(jìn)行補(bǔ)償，縮短了樣品的前處理時(shí)間。圖5為84種除草劑的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果。

圖5 84種除草劑的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果Fig.5 Matrix effects(ME)of multiple herbicides

3 方法學(xué)考察

3.1 線性范圍

通過內(nèi)標(biāo)法(氟吡禾靈-d4作為內(nèi)標(biāo)，濃度為50 ng/mL)配置5.0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL系列溶劑匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析，以濃度范圍(x，ng/L)對(duì)分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積比(y)來構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，84種除草劑的相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99，能滿足分析要求，如表2所示。

表2 84種除草劑殘留的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限、加標(biāo)回收率及精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.2 Linear ranges,Linear equation,correlation coefficients,limits of quantitation,spiked recoveries and precisions of 84 herbicides (n=6)

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

3.2 樣品回收率和精密度

取2種果蔬的空白樣品(菠菜和獼猴桃)，分別添加84種類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為0.01 mg/kg、0.05 mg/kg和0.1 mg/kg，每個(gè)水平重復(fù)6次試驗(yàn)。結(jié)果表明，添加84種除草劑的樣品的平均回收率在68.2%～109.4%，之間，精密度RSD在2.1%～16.2%之間，結(jié)果見表2。

3.3 定量限

在歐盟(EU)No396/2005法規(guī)及最新修改單中[16]，果蔬中除草劑的最大允許殘留限量(MRL)低至0.01 mg/kg，本方法的定量限(LOQ)采用加標(biāo)回收的方法進(jìn)行驗(yàn)證，菠菜和獼猴桃基質(zhì)樣品的定量限均能達(dá)到0.01 mg/kg，滿足國內(nèi)外限量法規(guī)對(duì)除草劑殘留限量的檢測(cè)要求。

3.4 實(shí)際樣品測(cè)定

按照建立的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)的50批果蔬樣品進(jìn)行檢測(cè)，包括白菜、柑橘、獼猴桃、馬鈴薯、結(jié)球甘藍(lán)、甜椒、洋蔥、芹菜、菠菜、蘿卜及蘋果等樣品。其中大多數(shù)的果蔬樣品未檢出除草劑殘留，僅有2批蘋果樣品檢出莠去津殘留，濃度分別為0.05 mg/kg和 0.07 mg/kg。結(jié)果表明，本方法適用于果蔬中84種除草劑殘留的檢測(cè)。

4 結(jié)論

本研究建立了同位素內(nèi)標(biāo)QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法快速檢測(cè)果蔬中84種除草劑的方法。優(yōu)化QuEChERS前處理步驟可實(shí)現(xiàn)84種除草劑的完全提取與凈化；方法的線性關(guān)系良好r2大于0.99；以菠菜和獼猴桃2種基質(zhì)樣品添加3水平的回收率試驗(yàn)，回收率在68.2%～109.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%～16.2%之間；大多數(shù)除草劑的定量限低至0.01 mg/kg，滿足國內(nèi)外農(nóng)藥殘留限量法規(guī)需求。該方法實(shí)現(xiàn)果蔬中84種常見除草劑的分析檢測(cè)，具有靈敏度高、穩(wěn)健性好、專一性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高的優(yōu)勢(shì)，為日常除草劑殘留監(jiān)控檢測(cè)提供實(shí)用的技術(shù)手段。