前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素Kexin 9型及其與脂類(lèi)物質(zhì)代謝紊亂、動(dòng)脈硬化性疾病關(guān)系的研究進(jìn)展▲

言 緯 李近都

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1 心血管內(nèi)科，2 肝膽外科，廣西百色市 533000)

【提要】 脂類(lèi)物質(zhì)代謝紊亂與心血管疾病、肥胖、糖尿病、脂肪肝和腫瘤等有關(guān)，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。血液中膽固醇等脂類(lèi)物質(zhì)之間通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合形成脂蛋白復(fù)合物，通過(guò)載脂蛋白受體(APR)進(jìn)入胞內(nèi)，并在細(xì)胞器內(nèi)內(nèi)化，再通過(guò)APR以循環(huán)再利用。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素Kexin 9型(PCSK9)屬于蛋白酶K分泌型蛋白，主要由肝臟分泌，具有促進(jìn)肝細(xì)胞再生、神經(jīng)分化，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和膽固醇內(nèi)化等功能。近期研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9是在膽固醇內(nèi)化的同時(shí)保障APR不受損害的關(guān)鍵蛋白，PCSK9基因突變及其編碼蛋白變異，可導(dǎo)致膽固醇與APR的親和力增強(qiáng)，促使細(xì)胞器內(nèi)的APR降解，導(dǎo)致APR的數(shù)量異常減少，從而影響膽固醇的循環(huán)利用，誘發(fā)高膽固醇血癥，在動(dòng)脈硬化的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。PCSK9已在動(dòng)脈硬化性疾病的早期識(shí)別、臨床進(jìn)展機(jī)制及藥物靶標(biāo)方面成為研究熱點(diǎn)。本文就PCSK9及其與脂類(lèi)物質(zhì)代謝紊亂、動(dòng)脈硬化性疾病關(guān)系的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

枯草桿菌蛋白酶又稱舒替蘭酶，屬于絲氨酸蛋白酶K分泌型蛋白，主要由肝臟分泌，因其基因首先在枯草桿菌中被克隆而得名[1]。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/Kexin type 9，PCSK9)，又稱為神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶1，由PCSK9基因編碼，是前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶家族的第9個(gè)成員[2]。血液中膽固醇等脂類(lèi)物質(zhì)之間通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合成脂蛋白復(fù)合物，在載脂蛋白受體(apolipoprotein receptor，APR)作用下進(jìn)入胞內(nèi)，并在細(xì)胞器內(nèi)內(nèi)化，再通過(guò)APR以循環(huán)再利用[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9是在膽固醇內(nèi)化的同時(shí)保障APR不受損害的關(guān)鍵蛋白，PCSK9基因突變及其編碼蛋白變異，可導(dǎo)致膽固醇與APR的親和力增強(qiáng)，促使細(xì)胞器內(nèi)的APR降解，導(dǎo)致APR的數(shù)量異常減少，從而影響膽固醇的循環(huán)利用，誘發(fā)高膽固醇血癥[4]。而得克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心在2002年開(kāi)展的達(dá)拉斯心臟研究項(xiàng)目中發(fā)現(xiàn)，PCSK9基因的某些位點(diǎn)發(fā)生突變能夠糾正高血壓患者的脂類(lèi)物質(zhì)代謝紊亂，并大幅度降低患者的血管疾病發(fā)生率[5]。至此研究者們發(fā)現(xiàn)PCSK9基因不同位點(diǎn)的突變，可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不同的影響，某些位點(diǎn)突變可導(dǎo)致膽固醇水平增高，是脂類(lèi)物質(zhì)代謝紊亂及動(dòng)脈硬化的致病因子，而另一些位點(diǎn)突變可導(dǎo)致膽固醇水平降低，是脂類(lèi)代謝紊亂及動(dòng)脈硬化的保護(hù)因子。近年來(lái)PCSK9在脂類(lèi)物質(zhì)代謝紊亂及動(dòng)脈硬化性疾病中的調(diào)控作用研究取得新進(jìn)展[6]，本文就這方面進(jìn)行綜述。

1 脂類(lèi)物質(zhì)代謝紊亂與動(dòng)脈硬化

化學(xué)上由脂肪酸和醇作用生成的酯及其衍生物(膽固醇、三酰甘油、膽固醇酯、磷脂和糖脂等)稱為脂類(lèi)物質(zhì)，這一類(lèi)有機(jī)化合物為不溶于水而易溶于脂肪溶劑(醇、醚、氯仿、苯)的非極性有機(jī)溶劑，與生命代謝息息相關(guān)[7]。脂類(lèi)物質(zhì)中極性脂的非極性部分與載脂蛋白之間通過(guò)疏水性相互作用，在肝臟內(nèi)通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合形成具有穩(wěn)定脂蛋白結(jié)構(gòu)的脂蛋白復(fù)合物，脂蛋白復(fù)合物在血液中循環(huán)運(yùn)轉(zhuǎn)，并通過(guò)APR介導(dǎo)進(jìn)入胞內(nèi)完成代謝過(guò)程[8]。APR有極低密度脂蛋白受體、LDL受體、清道夫受體和載脂蛋白E受體等類(lèi)型，其能與載脂蛋白配體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)三酰甘油、膽固醇和載脂蛋白等脂類(lèi)物質(zhì)的攝取與代謝，是脂類(lèi)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞器的介導(dǎo)蛋白，可有效調(diào)控脂類(lèi)物質(zhì)的胞吞和內(nèi)化，對(duì)脂類(lèi)物質(zhì)代謝、血漿脂類(lèi)物質(zhì)水平的調(diào)節(jié)有重要作用[9]。脂類(lèi)物質(zhì)的主要生物學(xué)功能是提供和儲(chǔ)存能量、信號(hào)識(shí)別和傳遞，同時(shí)還可以作為生物膜的骨架組成部分、維生素和色素的前體、糖基載體、酶激活劑、生長(zhǎng)因子與抗氧化劑等。

在脂類(lèi)物質(zhì)代謝過(guò)程中，三酰甘油、膽固醇等脂類(lèi)物質(zhì)在血液中與載脂蛋白相互嵌合形成脂蛋白微粒，進(jìn)而被運(yùn)輸?shù)綑C(jī)體各組織細(xì)胞；載脂蛋白配體再與相應(yīng)的APR結(jié)合，介導(dǎo)脂類(lèi)物質(zhì)進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行代謝[10]。脂類(lèi)物質(zhì)代謝紊亂是指機(jī)體在先天性或獲得性因素作用下，體內(nèi)脂類(lèi)物質(zhì)的消化、吸收、排泄失衡，導(dǎo)致血液及其他組織器官中脂類(lèi)物質(zhì)代謝產(chǎn)物的質(zhì)和量發(fā)生異常。目前認(rèn)為遺傳與環(huán)境因素異常是導(dǎo)致三酰甘油、膽固醇攝入與消耗失衡的主要原因，載脂蛋白及APR、脂類(lèi)物質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的編碼基因突變，從而影響脂類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)化和再生，造成脂類(lèi)物質(zhì)代謝紊亂。

動(dòng)脈硬化病變始于內(nèi)膜，發(fā)病初期為動(dòng)脈壁內(nèi)層表面出現(xiàn)一層小米粥樣的脂質(zhì)條紋，隨著疾病的進(jìn)展脂質(zhì)條紋逐漸浸潤(rùn)到脈管中層并形成纖維斑塊樣病變，受累的血管出現(xiàn)彈性降低、管壁增厚、管腔變窄等病理性改變，嚴(yán)重者出現(xiàn)脈腔阻塞，局部組織器官缺血或壞死，或受累血管內(nèi)膜出血而出現(xiàn)血栓、纖維組織增生、鈣質(zhì)沉著等繼發(fā)性改變[11]。脂類(lèi)物質(zhì)代謝紊亂對(duì)動(dòng)脈硬化的發(fā)生、發(fā)展有重要影響[12]，脂類(lèi)物質(zhì)進(jìn)入血管內(nèi)后可沉積在血管壁上，使血管腔變窄，并促使血管發(fā)生粥樣硬化。然而參與脂類(lèi)物質(zhì)代謝的物質(zhì)眾多，通路復(fù)雜，脂類(lèi)物質(zhì)代謝引起動(dòng)脈硬化的機(jī)制尚未完全。有研究表明，載脂蛋白基因、APR基因、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白基因和PCSK9基因等多種基因的突變參與脂類(lèi)物質(zhì)代謝紊亂及動(dòng)脈硬化的發(fā)生和發(fā)展[13]。

2 PCSK9基因及蛋白的結(jié)構(gòu)、功能

PCSK9基因廣泛存在于動(dòng)物內(nèi)臟、植物莖葉、果實(shí)和微生物，具有重要的生理活性[14]。研究表明，不同物種的PCSK9基因表達(dá)譜各有特征[15]。其中，人PCSK9基因位于第1號(hào)染色體短臂第3區(qū)2號(hào)帶，基因長(zhǎng)度約22 kb，有13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子。PCSK9基因在肝、腸道、腎、腦和皮膚等組織中均有表達(dá)，但主要在肝細(xì)胞表達(dá)，在肝內(nèi)參與脂質(zhì)代謝。

PCSK9蛋白由699個(gè)氨基酸殘基組成，按其結(jié)構(gòu)和功能的不同可分為N端信號(hào)區(qū)、前功能區(qū)、催化區(qū)和C端功能區(qū)4個(gè)部分，見(jiàn)圖1、圖2。N端信號(hào)區(qū)位于第1～30位氨基酸殘基，為PCSK9的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域；前功能區(qū)位于第31～152位氨基酸殘基；催化區(qū)位于第153～448位氨基酸殘基；C端功能區(qū)位于第449～699位氨基酸殘基，為PCSK9的富含半胱氨酸殘基結(jié)構(gòu)域[16]。PCSK9的N端信號(hào)區(qū)是攜帶其復(fù)合體跨膜運(yùn)輸?shù)幕咀R(shí)別信號(hào)，位于肽鏈的氨基(-NH2)端。PCSK9被釋放到細(xì)胞外后，其N(xiāo)端信號(hào)區(qū)不會(huì)被信號(hào)肽酶所切除，而是作為前導(dǎo)肽，通過(guò)信號(hào)肽-胞質(zhì)載脂蛋白受體-膜受體的三元識(shí)別將脂質(zhì)送進(jìn)溶酶體。PCSK9的前功能區(qū)由2個(gè)α螺旋和1個(gè)β折疊組成，其中β折疊呈四鍵反向平行，與催化區(qū)構(gòu)成可溶性交界面，可以阻斷自身與催化區(qū)的催化三聯(lián)體融合，防止自身催化反應(yīng)發(fā)生。PCSK9的催化區(qū)由酸-堿-親核三聯(lián)體(絲氨酸-組氨酸-天冬氨酸3個(gè)氨基酸殘基)構(gòu)成，為親核反應(yīng)水解蛋白功能區(qū)[17]。PCSK9的C端功能區(qū)為半胱氨酸-組氨酸-天冬氨酸三聯(lián)體，其作用類(lèi)似于絲氨酸蛋白酶中的三聯(lián)體，目前關(guān)于PCSK9的C端功能區(qū)結(jié)構(gòu)域催化作用的研究較少[18]。PCSK9前體首先在核糖體中進(jìn)行翻譯，然后進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔經(jīng)過(guò)折疊、組裝、糖基化等加工，再?gòu)募?xì)胞內(nèi)出芽，轉(zhuǎn)移到高爾基體進(jìn)一步加工成為成熟的PCSK9并釋放到細(xì)胞外。PCSK9基因編碼的蛋白經(jīng)過(guò)自動(dòng)催化處理后，以非活性蛋白酶的形式持續(xù)分泌進(jìn)入細(xì)胞外間質(zhì)和反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)[18]。

圖1 PCSK9蛋白的肽鏈功能分區(qū)

圖2 PCSK9 蛋白的結(jié)構(gòu)圖[19]

3 PCSK9與脂類(lèi)物質(zhì)代謝紊亂、動(dòng)脈硬化性疾病的關(guān)系

目前認(rèn)為PCSK9在脂類(lèi)物質(zhì)代謝、決定脂類(lèi)物質(zhì)代謝途徑和調(diào)節(jié)血脂水平等方面都有重要的作用，甚至認(rèn)為PCSK9足以揭開(kāi)載脂蛋白、膽固醇和三酰甘油代謝紊亂及動(dòng)脈硬化性疾病的發(fā)生機(jī)制，成為控制脂類(lèi)物質(zhì)紊亂、防控動(dòng)脈硬化性疾病的一個(gè)重要靶點(diǎn)[20]。在正常的情況下，脂類(lèi)物質(zhì)與PCSK9蛋白在肝細(xì)胞膜表面與LDL受體、極低密度脂蛋白受體、清道夫受體和載脂蛋白E受體等相結(jié)合形成脂蛋白復(fù)合物，激活并介導(dǎo)脂類(lèi)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞器，脂類(lèi)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞器后從脂蛋白復(fù)合物中分離并在溶酶體內(nèi)降解，而脂蛋白受體則可以重新循環(huán)利用。PCSK9具有介導(dǎo)脂類(lèi)物質(zhì)內(nèi)化、調(diào)節(jié)血漿LDL水平的功能，這種代謝通路被稱為PCSK9-脂類(lèi)物質(zhì)調(diào)控軸。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)部分LDL-C水平低下的非洲裔美國(guó)人PCSK9等位基因突變率較高，其血液中完全檢測(cè)不到PCSK9蛋白，但對(duì)其健康基本沒(méi)有負(fù)面影響，血管疾病患病率很低[5]。研究顯示，PCSK9基因獲得型突變致PCSK9蛋白表達(dá)量增高的患者，其脂蛋白膽固醇升高，是導(dǎo)致遺傳性高膽固醇血癥發(fā)生的原因之一[16]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)PCSK9的小鼠，其肝臟LDL受體水平明顯降低，而LDL-C水平明顯升高[21]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PCSK9基因第127位氨基酸殘基由絲氨酸突變成精氨酸(S127R)的單突變患者LDL受體水平降低，認(rèn)為PCSK9基因功能突變可以導(dǎo)致LDL-C水平升高[22]。

臨床研究表明，PCSK9基因多態(tài)性變異，例如PCSK9基因D129G、D374Y、E670G、C679X、N157K、Q554E、R237W、R46L、S462P和Y142X等位點(diǎn)的多態(tài)性變異所產(chǎn)生的不同表型與脂類(lèi)物質(zhì)內(nèi)化的調(diào)控密切相關(guān)，但PCSK9基因的不同表型對(duì)脂類(lèi)物質(zhì)內(nèi)化的調(diào)節(jié)作用各不相同[23]。有學(xué)者針對(duì)不同LDL水平的人群基因多態(tài)性遺傳進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)PCSK9存在兩種不同功能類(lèi)型的基因突變：(1)功能獲得型突變。主要突變位點(diǎn)為C161T、D129G、D374Y、E670G、F216L、H553R、I474V、N157K、R128S、R306S和S127R等，突變率較低，目前認(rèn)為其表型可作為血漿LDL水平升高的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，可用于判斷冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度。該突變型基因編碼的PCSK9蛋白對(duì)LDL受體的降解作用增強(qiáng)，使LDL-C水平升高，導(dǎo)致高膽固醇血癥[24]。(2)功能缺失型突變。主要突變位點(diǎn)為A443T、C679X、G106R、L253F、N157K、Q554E、R237W、R46L、S462P和Y142X等，突變率較高，其表型可削弱或沉默PCSK9上調(diào)LDL水平的能力，使LDL水平降低15%～28%，導(dǎo)致低膽固醇血癥，使缺血性心臟病發(fā)生率降低47%～88%[25]。除此之外，LDL受體活性在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中還受到甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2 (sterol regulatory element-binding protein 2，SREBP2)的調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄后受PCSK9影響。和LDL受體一樣，PCSK9在啟動(dòng)區(qū)含有一個(gè)固醇調(diào)節(jié)元件，其表達(dá)水平也受SREBP2的調(diào)節(jié)[24]。細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平降低時(shí)，胞質(zhì)中的SREBP2被激活并使膽固醇發(fā)生核轉(zhuǎn)移，與LDL受體及PCSK9的啟動(dòng)子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合，同時(shí)激活LDL受體及PCSK9基因轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)LDL受體的內(nèi)吞作用，以促進(jìn)血漿中的LDL攜帶更多的膽固醇進(jìn)入胞內(nèi)內(nèi)化[26-27]。PCSK9作為一種負(fù)反饋因子，可有效調(diào)控LDL受體[25-28]。

4 小 結(jié)

脂類(lèi)物質(zhì)代謝紊亂及動(dòng)脈硬化相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)精細(xì)調(diào)控機(jī)制目前尚未完全闡明，深入研究PCSK9對(duì)脂類(lèi)物質(zhì)的調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)于有效改善脂類(lèi)物質(zhì)代謝紊亂，降低動(dòng)脈硬化患者游離脂肪酸、膽固醇、LDL、極低密度脂蛋白水平，以及控制動(dòng)脈硬化的發(fā)生和發(fā)展有重要意義。研發(fā)PCSK9的小分子蛋白抑制劑、反轉(zhuǎn)錄寡核苷酸、小分子干擾RNA、單克隆抗體和疫苗等分子靶向藥物，對(duì)于有效控制脂類(lèi)物質(zhì)代謝紊亂及動(dòng)脈硬化性疾病有積極的作用。