河南省部分地區(qū)雞源沙門菌分離鑒定與耐藥性分析

鞏新廷，石 巖，蘇玉賢

（1.內(nèi)黃縣畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心，安陽(yáng) 456300；2.焦作市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，焦作 454000；3.平頂山市畜牧技術(shù)推廣站，平頂山 467000）

沙門菌（Salmonella）是腸桿菌科的重要致病菌屬，在人和動(dòng)物的腸道細(xì)胞內(nèi)寄生，有2500多種血清型[1]，絕大部分血清型對(duì)人類和畜禽有致病性，引起動(dòng)物腹瀉、人急性胃腸炎和食物中毒。雞源沙門菌病通常造成雛雞腹瀉、脫水，甚至死亡，成年雞呈慢性或隱性感染，長(zhǎng)期攜帶病原菌，蛋雞產(chǎn)蛋性能下降。病雞和帶菌雞為主要傳染源，可以水平和垂直傳播，種雞場(chǎng)一旦發(fā)生疫情很難凈化，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展，同時(shí)也直接威脅公共衛(wèi)生安全。目前，使用抗生素依然是養(yǎng)雞場(chǎng)防治該病主要手段。但是，長(zhǎng)期濫用抗生素導(dǎo)致沙門菌株耐藥性增強(qiáng)，尤其是多重耐藥現(xiàn)象不斷出現(xiàn)，動(dòng)物成為耐藥菌的重要儲(chǔ)存庫(kù)[2]，給有效防治沙門菌病帶來(lái)很大困難。

本研究采集2021年河南省平頂山等地區(qū)雞源病料進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定、血清型分析和耐藥性檢測(cè)，為今后雞源沙門菌病凈化、篩選臨床安全合理用藥提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源和菌株無(wú)菌采集河南部分地區(qū)35個(gè)規(guī)模雞場(chǎng)疑似雞沙門菌病雞肝臟、心臟和腸道等樣品154份作為待檢病料。腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株（CVCC3377）和大腸埃希氏菌（ATCC29922）購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 主要培養(yǎng)基和試劑緩沖蛋白胨水增菌液（BPW）、麥康凱培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、法國(guó)科馬嘉沙門菌屬顯色培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管、沙門菌屬診斷血清（60種）、DL2000 DNA marker、2×PCR Premix購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司；15種K-B藥敏紙片包括大觀霉素（SPT）、氨芐西林（AMP）、環(huán)丙沙星（CIP）、呋喃唑酮（FUR）、阿米卡星（AN）、氟苯尼考（FLO）、鏈霉素（STR）、復(fù)方新諾明（SXT）、新霉素（NTL）、阿奇霉素（AZM）、多西環(huán)素（DOX）、左氧氟沙星（LEV）、慶大霉素（CN）、頭孢曲松（CTRX）、頭孢喹肟（CTX）均購(gòu)自杭州天河微生物試劑有限公司。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)無(wú)菌采集病死雞的肝臟、脾臟、肺臟、肛拭子和用生理鹽水清洗雞蛋表面的污水等病料接種于BPW，36℃±1℃、220 rpm培養(yǎng)12 h后，取1 mL增菌液轉(zhuǎn)入10 mL TTB，42℃±1℃培養(yǎng)18 h，再用接種環(huán)取適量TTB增菌液劃線接種于法國(guó)科馬嘉沙門菌顯色培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)21 h，挑取疑似沙門菌單個(gè)菌落染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)，并在麥康凱培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.4 生化試驗(yàn)將分離純化的細(xì)菌接種于細(xì)菌微量生化反應(yīng)管中，再放入恒溫箱中，37℃培養(yǎng)24～48 h，觀察記錄結(jié)果，結(jié)果依據(jù)《GB4789.4—2016 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門菌檢驗(yàn)》[3]進(jìn)行判定。

1.5 PCR鑒定采用水煮法提取細(xì)菌DNA制備模板。挑取待檢純化后的菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12 h，10 000×g離心3～5 min，棄掉上清液。滅菌ddH2O洗3次，再用ddH2O重懸，煮沸10 min，冰浴冷卻5 min，10 000×g離心3～5 min，取上清液為DNA模板，-20℃保存，備用。根據(jù)GenBank（登錄號(hào)：JQ665438.1）發(fā)表的序列，針對(duì)沙門菌fimY基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游引物序列5'-CGCCCAGCCATACGGATAACC-3'，下游引物序列5'-TACCACGCAGGAAAGACACC-3'。由中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增片段大小427 bp。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×PCR Premix 12.5 μL，DNA模板0.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用凝膠成像儀觀察結(jié)果并記錄。大腸埃希氏菌ATCC29922為陰性對(duì)照和腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株CVCC3377為陽(yáng)性對(duì)照。

1.6 血清型鑒定分離菌株的血清型分群和定型鑒定采用GB 4789.4-2016標(biāo)準(zhǔn)中的玻片凝集試驗(yàn)方法。待檢菌以1.2%LB瓊脂作為測(cè)定A～F、O、H抗原的培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h，用生理鹽水制備成2麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?。從血清型鑒定試劑盒中取20 μL的血清于潔凈玻片上，再挑取20 μL菌懸液與血清搖動(dòng)混勻30 s，觀察凝集結(jié)果。同時(shí)，設(shè)生理鹽水為陰性對(duì)照試驗(yàn)，觀察菌株是否發(fā)生自凝現(xiàn)象。1 min內(nèi)凝集者判為陽(yáng)性，均勻渾濁或清亮者為陰性。根據(jù)菌體O抗原和鞭毛H抗原鑒定結(jié)果，查閱沙門菌抗原式進(jìn)行被檢菌株血清型分群和定型。

1.7 藥敏試驗(yàn)藥敏質(zhì)控菌株為腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株CVCC3377。采用WHO提供的藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法（Kirby-Baue）測(cè)定48株分離菌對(duì)15種常見抗菌藥的耐藥性，測(cè)量抑菌圈直徑大小，依據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)（Clinical & Laboratory Standards Institute, CLSI）判定15種抗生素敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）結(jié)果，根據(jù)藥敏試驗(yàn)判定耐藥表型。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)革蘭氏染色為陰性，鏡檢可見短桿狀菌，兩端鈍圓，單個(gè)、成對(duì)或成叢存在。疑似菌在法國(guó)科瑪嘉沙門菌屬顯色培養(yǎng)基呈現(xiàn)為大小一致、邊緣整齊的紫色小菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上可見無(wú)色、半透明、光滑菌落，符合沙門菌生長(zhǎng)特性。共有48株初步判定為疑似沙門菌菌株。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果表明，48株分離菌株均能分解甘露醇、葡萄糖和山梨醇，不發(fā)酵蔗糖，賴氨酸、硫化氫和動(dòng)力吲哚鳥氨酸試驗(yàn)陽(yáng)性，靛基質(zhì)、尿素、V-P試驗(yàn)陰性，依據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)沙門菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（GB 4789.4—2016），有48株符合沙門菌生化鑒定特征。

2.3 PCR鑒定結(jié)果部分分離菌株檢測(cè)結(jié)果見圖1。凝膠電泳結(jié)果顯示，以沙門菌fimY基因引物對(duì)48株分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增鑒定，均能擴(kuò)增出大小為427 bp的目的片段，與預(yù)期片段大小一致，對(duì)照菌株擴(kuò)增結(jié)果為陰性。結(jié)合生化鑒定結(jié)果，本次從154份病料樣品中共鑒定分離出48株雞沙門菌，總分離率為31.17%。對(duì)來(lái)自河南省不同地區(qū)雞源沙門菌鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)，48株沙門菌中安陽(yáng)13株（27.08%），新鄉(xiāng)9株（18.75%），鄭州7株（14.58%），平頂山11株（22.92%），焦作8株（16.67%），表明上述地區(qū)均有不同程度雞源沙門菌感染。錢明珠等[4]對(duì)河南省部分雞沙門菌流行病調(diào)查，分離率為27.97%；廖成水等[5]報(bào)道，河南部分地區(qū)雞源沙門菌分離率為15.89%。本研究高于上述檢測(cè)率，表明近年來(lái)雞源沙門菌感染有上升的趨勢(shì)，需要加強(qiáng)雞沙門菌病的凈化控制。

圖1 部分分離菌株的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 The PCR identification results of isolated strains

2.4 血清型鑒定結(jié)果采用玻片凝集法對(duì)48株沙門菌血清型分型試驗(yàn)，鑒定結(jié)果顯示，共鑒定出44株沙門菌的血清型，占沙門菌分離株的91.67%（44/48），其余4株未確定出血清型。鑒定出的44株沙門菌分屬3個(gè)大群5種血清型，包括19株雞白痢沙門菌（43.18%）、13株腸炎沙門菌（29.54%）、7株鼠傷寒沙門菌（27.27%）、3株甲型副傷寒沙門菌（6.18%）和2株乙型副傷寒沙門菌（4.45%）。優(yōu)勢(shì)血清型為雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌。河南省部分地區(qū)雞源沙門菌血清型分布見表1。

表1 河南省部分地區(qū)雞源沙門菌血清型分布Table 1 Distribution of serotypes of Salmonella from chicken in some areas of Henan Province

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)48株雞源沙門菌進(jìn)行15種抗生素耐藥性檢測(cè)，結(jié)果見表2。對(duì)氨芐西林耐藥率最高，為95.83%，其次對(duì)呋喃唑酮、大觀霉素、鏈霉素也具有較高的耐藥性，介于62.50%～66.67%；對(duì)環(huán)丙沙星、氟苯尼考、復(fù)方新諾明和左氧氟沙星耐藥菌株占比介于10.42%～22.92%；對(duì)阿米卡星、新霉素、阿奇霉素、多西環(huán)素、慶大霉素、頭孢曲松、頭孢喹肟的耐藥率最低，介于2.08%～8.33%。48株雞源沙門菌抗生素耐藥譜結(jié)果見表3。2株（4.17%）對(duì)所有試驗(yàn)藥物敏感，37株至少對(duì)3種或3種以上的抗生素出現(xiàn)耐藥性，多重耐藥率占77.08%（37/48）；以4重和5重耐藥最多，有25株，占52.08%（25/48），最多為8重耐藥，有1株，占2.08%（1/48）。耐藥模式較多，耐藥表型主要為AMP+FUR+SPT+STR。沈?qū)W懷等[6]報(bào)道，安徽地區(qū)禽源沙門菌對(duì)左氧氟沙星、阿米卡星和阿奇霉素等高度敏感；戴建華等[7]從江蘇蘇中地區(qū)分離的22株沙門菌對(duì)阿米卡星、甲氧胺嘧啶、萘啶酮酸、慶大霉素、諾氟沙星的耐藥率均為72.73%～100%，表現(xiàn)嚴(yán)重的耐藥性，與本研究結(jié)果基本一致。

表2 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug susceptibility test results of isolated strains

表3 48株沙門菌分離株抗菌藥耐藥譜Table 3 Antimicrobial resistance spectrum of 48 Salmonella isolates

根據(jù)本研究中的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，建議選取阿米卡星、多西環(huán)素、慶大霉素、頭等高敏藥物作為臨床用藥，采用交叉用藥、輪換用藥等方式，減少耐藥菌株產(chǎn)生。同時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)養(yǎng)雞場(chǎng)沙門菌凈化，強(qiáng)化流行病學(xué)調(diào)查和耐藥性監(jiān)測(cè)，保證雞群的健康養(yǎng)殖。