白細(xì)胞介素-2在牛感染性疾病中的作用

陶宏衛(wèi)，夏愛鴻，陳 祥

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300；2.揚州大學(xué) 江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

白細(xì)胞介素2（Interleukin-2, IL-2）是一種具有四個α-螺旋束的細(xì)胞因子，主要由活化的T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞產(chǎn)生，于1976年首次被Morgan等[1]發(fā)現(xiàn)，因其具有誘導(dǎo)和維持T細(xì)胞的生物活性，曾被稱為T細(xì)胞生長因子（T cell growth factor, TCGF），并于1979年被正式命名為白細(xì)胞介素-2。1996年Gisela等[2]利用重組牛皰疹病毒成功分泌表達(dá)牛白細(xì)胞介素2，獲得了有生物活性的糖蛋白。IL-2的生物學(xué)活性是通過與細(xì)胞表面受體復(fù)合物結(jié)合而介導(dǎo)的，該復(fù)合物由IL-2 R alpha/CD25、IL-2/IL-15 R beta和常見的γ-鏈/IL-2 Rγ亞基組成。IL-2還可以單獨與IL-2 R alpha低親和力結(jié)合，或與由IL-2 / IL-15 R beta和常見的γ鏈亞基組成的復(fù)合物中等親和力結(jié)合[3]。IL-2是一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子，當(dāng)IL-2與其特異性的受體結(jié)合后，對T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞等的生長和分化具有重要的調(diào)節(jié)作用，同時在抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及感染性疾病的治療中具有重要的調(diào)節(jié)作用[4-7]。

1 IL-2的結(jié)構(gòu)及功能

自1983年Taniguchi等克隆出人IL-2基因以來，鼠、牛、豬、羊、雞等IL-2基因相繼克隆成功。Cerretti等[8]于1986年首次克隆牛IL-2基因，并測定了其核苷酸序列。牛IL-2基因序列全長為775 bp，開放閱讀框為465 bp，編碼155個氨基酸殘基。牛IL-2與人IL-2、鼠IL-2的同源性分別為65%和50%。在結(jié)構(gòu)上，IL-2主要由α螺旋體和β螺旋構(gòu)成，與此相類似的分子結(jié)構(gòu)如粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GMCSF）和白細(xì)胞介素-4（IL-4）等[9-10]。IL-2分子含有3個半胱氨酸，分別位于第58、105和125位，其中第58位和105位之間形成的二硫鍵對維持IL-2的生物學(xué)構(gòu)象是非常必要的，當(dāng)二硫鍵斷裂時，三級結(jié)構(gòu)和功能均消失[11]。此外，第17位的亮氨酸、28位的天冬氨酸、38位的精氨酸、121位的色氨酸和124位的苯丙氨酸殘基對IL-2的生物活性也有著重要的影響[12]。在功能上，IL-2誘導(dǎo)活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞上IL-2和IL-2 R alpha的表達(dá)并刺激它們的增殖。同時，IL-2在維持外周自我耐受性方面也起著重要作用，其機(jī)制是通過Fas介導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞在抗原再刺激后死亡，以及IL-2促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化和存活[13]。細(xì)胞缺少IL-2、IL-2 R alpha或IL-2 R beta的小鼠沒有表現(xiàn)出嚴(yán)重的免疫缺陷表型，而是積聚了活化的T淋巴細(xì)胞，減少了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量，并發(fā)展成自身免疫性疾病[14]。這表明維持T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和防止自身反應(yīng)性是IL-2信號傳導(dǎo)的主要功能。此外，IL-2可增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性，是B細(xì)胞增殖和免疫球蛋白生產(chǎn)所必需的。

IL-2的多效性效應(yīng)是由于IL-2信號可通過3種不同的信號途徑（JAK-STAT、PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK途徑）進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)而實現(xiàn)的[15]。IL-2與其受體結(jié)合后，CD122和CD132的胞漿結(jié)構(gòu)域異源二聚體化，從而激活Janus激酶、JAK1和JAK3，隨后在CD122上磷酸化T338。這種磷酸化招募了STAT轉(zhuǎn)錄因子，其中以STAT5為主，這些轉(zhuǎn)錄因子二聚化并遷移到細(xì)胞核中與DNA結(jié)合[16]，從而激活一系列的免疫反應(yīng)。IL-2的基因表達(dá)調(diào)控可以是多層次的，也可以通過不同的方式。其中一個IL-2基因表達(dá)調(diào)控的檢查點是TCR。TCR的信號通路活化后繼而激活磷脂酶C（Phospholipase C, PLC）依賴的信號途徑，隨后PLC激活3種主要轉(zhuǎn)錄因子：NFAT、NF-κB和AP-1，從而進(jìn)一步激活相應(yīng)的免疫反應(yīng)[17]。

2 IL-2在牛感染性疾病中的作用

IL-2本身并沒有直接抗感染的活性，它是通過增強(qiáng)NK細(xì)胞、CTL細(xì)胞的活性及誘導(dǎo)IFN-γ等的產(chǎn)生而介導(dǎo)抗感染。BoIL-2在牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV）免疫中具有免疫佐劑活性。Quiorga等[18]將重組牛IL-2注入牛乳房，可以明顯降低細(xì)菌性乳腺炎的發(fā)病率。鑒于牛IL-2重要的生物學(xué)功能，牛IL-2可作為免疫增強(qiáng)劑、免疫治療劑協(xié)同作用于感染性疾病的治療。

2.1 IL-2與牛結(jié)核病牛結(jié)核病是一種主要由牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis,M. bovis）等引起的慢性消耗性人獸共患傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為需通報的動物疫病。感染牛分枝桿菌后，機(jī)體內(nèi)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞會分泌大量IL-2，促進(jìn)T細(xì)胞增殖的同時使CD8+T細(xì)胞活化為CTL，并且可誘導(dǎo)IFN-γ等多種細(xì)胞因子的分泌，從而產(chǎn)生殺滅牛分枝桿菌的作用。此外IL-2能夠刺激T細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR, CD71）、MHC-II類抗原的表達(dá)，同時誘導(dǎo)CTL、NK和LAK等多種殺傷細(xì)胞的分化和效應(yīng)功能來進(jìn)一步殺傷牛分枝桿菌。IL-2還直接作用于B細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、分化和抗體的分泌。此外研究顯示強(qiáng)力的中央記憶型T細(xì)胞（Central Memory T cell,Tcm）IFN-γ/TNF-α反應(yīng)與牛結(jié)核病密切相關(guān)，而Tcm的IFN-γ/TNF-α/IL-2水平是牛結(jié)核免疫保護(hù)的重要指標(biāo)[19]。因此IL-2作為Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要細(xì)胞因子之一，在牛分枝桿菌引起的機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其分泌水平高低反應(yīng)著機(jī)體感染分枝桿菌的不同狀態(tài)[20]。

由于牛IL-2在感染后的分泌特征，基于微生物抗原特異性IL-2的檢測方法被逐漸建立和應(yīng)用[21]。Xia等[22]先是制備并篩選出能夠特異性識別天然牛IL-2的單克隆抗體，建立了基于流式細(xì)胞術(shù)的牛IL-2+CD4+T細(xì)胞檢測方法，并將該方法應(yīng)用于牛結(jié)核病的檢測。此外，研究發(fā)現(xiàn)通過使用ELISA檢測牛血漿中結(jié)核特異性的IL-2還可以用來區(qū)分牛分枝桿菌的自然感染和BCG疫苗接種。當(dāng)該檢測方法cut-off值選取OD450為0.1時，該方法的特異性為100%，敏感性為93.9%，在所有疫苗接種的群體中均無法檢測到結(jié)核特異性IL-2的分泌。感染牛分枝桿菌后會導(dǎo)致一系列臨床結(jié)果，包括發(fā)展為具有臨床癥狀的動物，以及保持持續(xù)潛伏感染階段動物。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，功能性T細(xì)胞受抗原負(fù)荷的調(diào)控，在高抗原負(fù)荷和抗原持久性的情況下，高IFN-γ/低IL-2的分泌占主導(dǎo)，而在涉及抗原清除的情況下，低IFN-γ/高IL-2反應(yīng)占主導(dǎo)[23]?；诖私⒌腎FN-γ/IL-2雙色ELISPOT實驗來區(qū)分牛結(jié)核病感染的不同階段，與無可見結(jié)節(jié)的牛相比，可見結(jié)節(jié)的牛中牛型PPD特異性的IL-2單個產(chǎn)生的細(xì)胞頻率更高[20]。

2.2 IL-2與牛傳染性鼻氣管炎牛皰疹病毒Ⅰ型（Boyine herpesvirus 1, BHV-1）是牛的重要病原體，引起嚴(yán)重的呼吸道感染，結(jié)膜炎，外陰陰道炎以及流產(chǎn)。血清中和抗體和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性都在BHV-1感染中發(fā)揮重要的作用。當(dāng)動物先用BHV-1糖蛋白進(jìn)行免疫，隨后被攻毒時，抗體滴度與感染的減輕之間存在正相關(guān)。IL-2能夠促進(jìn)抗原活化T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，并在一系列免疫活動中發(fā)揮著重要作用。重組牛IL-2已被用作佐劑與商業(yè)改良的BHV-1活疫苗（MLV）進(jìn)行組合，與單獨的疫苗免疫，該組合在體液免疫和細(xì)胞免疫都表現(xiàn)出更強(qiáng)的效應(yīng)。Hughes用來自BHV-1的糖蛋白IV（gIV）對牛進(jìn)行免疫，然后再接種不同劑量的IL-2，結(jié)果顯示經(jīng)過IL-2處理的牛，相比較于只免疫了BHV-1糖蛋白IV的牛，在特異性細(xì)胞毒性，淋巴細(xì)胞對gIV的增殖反應(yīng)，以及gIV特異性抗體方面都表現(xiàn)出顯著性的增強(qiáng)。因此牛IL-2具有作為BHV-1疫苗佐劑的潛力。Reddy等[24]將低劑量（25 μg/kg）重組牛IL-2與牛皰疹病毒1型活苗（BHV-1）一起免疫，血清中和抗體效價比單獨使用疫苗組提高了6倍。李祥瑞等[25]研究表明，將重組牛IL-2與伊氏錐蟲可溶性抗原共同注射小鼠，其抗體滴度由對照組的24上升到26，NK細(xì)胞殺傷活性由對照組的31.6%提高到99.66%。

2.3 IL-2與口蹄疫口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由FMD病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的，F(xiàn)MDV是一個小的，無包膜單鏈正義RNA病毒，共分為O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1 7種血清型，在各個血清型中，它們具有明顯的菌株差異和抗原變異。FMDV能夠誘導(dǎo)牛早期免疫反應(yīng)，特別是先天免疫反應(yīng)。感染FMDV后，機(jī)體會驅(qū)動細(xì)胞因子通路分泌一系列炎性細(xì)胞因子，同時增強(qiáng)抗原遞呈功能等來殺傷病毒[26]。通過實時PCR對接種FMDV牛的PBMC中特異性IL-2的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測定，同時使用ELISA測定全血中IL-2的分泌水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未接種的動物相比，接種FMDV牛的PBMC中IL-2的轉(zhuǎn)錄和分泌水平更高[27]。

2.4 IL-2與牛布魯菌病牛布魯菌廣泛存在，其對動物和人類健康的影響而具有重要意義。機(jī)體主要通過細(xì)胞介導(dǎo)的免疫來抵御布魯菌的感染，而布魯菌也相應(yīng)的進(jìn)化出多種途徑來逃逸宿主的殺傷。將重組牛IL-2與疫苗一起連用來增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，結(jié)果顯示將rBoIL-2與疫苗聯(lián)用時，可以刺激機(jī)體TNF-α、IL-12p40和IFN-γ等細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)。同時相比較于僅接種疫苗或不接種疫苗組，rBoIL-2與疫苗聯(lián)用組提供了顯著的免疫保護(hù)力，更好的防止感染和流產(chǎn)[28]。

2.5 IL-2與牛巴氏桿菌病多殺巴氏桿菌通常出現(xiàn)在許多物種的明顯健康動物的上呼吸道上皮中。在壓力的情況下可能會誘發(fā)疾病，導(dǎo)致牛、綿羊和豬的支氣管肺炎，牛、豬和兔子的敗血病，豬和兔子的鼻炎和急性禽霍亂。研究表明，牛感染巴氏桿菌后，會引起機(jī)體CD4、CD8 T細(xì)胞數(shù)量的增加，同時會誘導(dǎo)機(jī)體分泌IL-2和IL-8來抵御巴氏桿菌的感染[29]。

2.6 IL-2與牛白血病牛白血病病毒（Bovine leukemia virus, BLV）是與1型人類T細(xì)胞白血病病毒（Human T -cell leukemia virus type 1, HTLV-1）相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄病毒，可引起牛源性牛白血病。BLV感染可在臨床上保持沉默，牛處于無白血?。╝cuteleucemia,AL）狀態(tài)，或表現(xiàn)為持續(xù)性淋巴細(xì)胞增多（PL）。與無血清型陽性（BLV+AL）或血清陰性（BLV-）的動物相比，持續(xù)淋巴細(xì)胞（BLV+PL）的奶牛具有更多的淋巴細(xì)胞和更少的中性粒細(xì)胞。從BLV+PL動物分離的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物中IL-2含量比BLV+AL和BLV-組顯著升高。因此在BLV感染的牛中不受控制的淋巴細(xì)胞增多可能是由于IL-2調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞增殖所致[30]。

3 小結(jié)

本文主要對IL-2的結(jié)構(gòu)和功能及其在感染性疾病中的相關(guān)作用進(jìn)行論述。近年來，隨著免疫學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，IL-2作為Th1型主要的細(xì)胞因子之一，使用IL-2治療免疫相關(guān)疾病的新方法和建立可靠的、規(guī)范化評價IL-2在牛感染性疾病中的作用具有較好的應(yīng)用前景。