炭疽芽孢桿菌噬菌體的研究進(jìn)展

李 論，王 鵬，李 偉，鐘佑宏

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，大理 671000；2.云南省地方病防治所 云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點實驗室，大理 671000；3.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室，北京 102206）

20世紀(jì)初，一類感染細(xì)菌的病毒（后稱噬菌體）被Frederick Twort等[1-2]發(fā)現(xiàn)。由于噬菌體能感染細(xì)菌，人類對其在抗細(xì)菌感染方面寄予了厚望。然而，隨著抗生素的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，噬菌體在抗細(xì)菌感染方面的應(yīng)用逐漸被忽略。但是，抗生素的廣泛應(yīng)用使細(xì)菌的耐藥性成為新的難題，一些多耐藥菌、泛耐藥菌以及超級細(xì)菌的出現(xiàn)，迫使人們不得不在抗生素之外尋求抗感染的有效途徑。目前，炭疽芽孢桿菌不僅在生物恐怖襲擊中存在潛在的威脅，還會對自然環(huán)境造成難以清除的污染。有研究表明，噬菌體對生物武器類的炭疽芽孢桿菌有很好的裂解效應(yīng)，并對土壤樣本中的類炭疽芽孢桿菌有較高的殺滅率。這就是為什么全世界都在進(jìn)行密集的研究，旨在開發(fā)有效的方法，防止炭疽芽孢桿菌對我們的侵害[1,3]。

1 炭疽的危害

炭疽（Anthrax）是世界上最古老的疾病之一，可上溯到古巴比倫時代[4]。它是一種分布較廣、發(fā)病率較高的烈性傳染病[5]。炭疽能形成芽孢，即生命力較強的炭疽芽孢桿菌。無論在多么惡劣的環(huán)境下，這種細(xì)菌都可以在體表形成多層堅硬的外殼，將其DNA保護(hù)起來。隨著時間的流逝，即使它的外殼會脫落，但孢子的核心部分并不會死亡，一遇合適的環(huán)境便會再次復(fù)蘇。2016年西伯利亞的一場炭疽疫情，使我們對炭疽存活年限的認(rèn)知從四五十年延長到了七十五年[4,6]。

炭疽菌是需氧芽孢桿菌中唯一對人、畜均有致病性的細(xì)菌，它能使受害者在36 h內(nèi)窒息、大量出汗、休克直至死亡[7]。與其他由呼吸道、胃腸道或皮膚進(jìn)入的芽孢桿菌不同，炭疽芽孢桿菌一旦進(jìn)入體內(nèi)即可導(dǎo)致全身感染和致命疾病[6]。2001年美國的“炭疽郵件”事件導(dǎo)致5人死亡后，炭疽就成為了人們研究的熱點[8]。

1956年至1997年間，我國共報告了11.2萬例人類病例，并分別在1957年、1963年和1977年發(fā)生過3次大規(guī)模的暴發(fā)[9]。1956年法定報告?zhèn)魅静≈贫冉⒑?，在炭疽的老疫源地——云南省，炭疽發(fā)病率有緩慢上升的趨勢，但疫點相對穩(wěn)定，多發(fā)生在炎熱多雨的地州，傳染源以牛為主，臨床大多為皮膚型[10]。2021年8月15日，山東省疾控中心報告了2例炭疽確診病例，其中一例死亡病例為14歲學(xué)生，另一例為35歲男子，從事屠宰牛類活動。為查清炭疽源頭，防止進(jìn)一步擴散，消除潛在風(fēng)險，繼續(xù)開展疫情調(diào)查和治療勢在必行[11]。由此可見，對于炭疽的防控仍需進(jìn)一步加強。

由于炭疽芽孢桿菌對理化因子具有極強的抵抗力和致病力，所以一旦自然環(huán)境被炭疽芽孢桿菌污染，將很難被徹底清除。目前常規(guī)采用的消毒方法為物理方法和化學(xué)方法，但這兩類方法殺菌效果尚存在局限性[12]。因此，尋找更加快速有效的方法消除炭疽芽孢桿菌對環(huán)境的污染迫在眉睫。

2 噬菌體的重要性

噬菌體是地球上最豐富的生物之一，廣泛存在于海水、生活污水、土壤、動物或人類排泄物中，是感染細(xì)菌、真菌、放線菌和螺旋體的病毒，其結(jié)構(gòu)簡單，主要由蛋白外殼和遺傳物質(zhì)核酸組成。噬菌體根據(jù)繁殖周期可分為裂解性噬菌體和溶原性噬菌體（圖1）。裂解性噬菌體通過吸附蛋白與宿主細(xì)胞表面的受體特異性結(jié)合，將其遺傳物質(zhì)注入宿主細(xì)胞，并在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行核酸復(fù)制、蛋白質(zhì)合成和后代噬菌體的組裝，實現(xiàn)增殖。而溶原性噬菌體將DNA整合到宿主基因組，也可能以質(zhì)粒形式存在[1,13]。作為一種侵染細(xì)菌的病毒，噬菌體不僅能夠特異性識別宿主細(xì)菌，還可以更加快速地進(jìn)行鑒別診斷[14-15]。

圖1 噬菌體的不同循環(huán)周期[13]Fig.1 Different life cycles of phages[13]

噬菌體裂菌技術(shù)——一種新型生物消毒技術(shù)，近年來得到國內(nèi)外研究者的極大關(guān)注。利用其宿主作用的相對特異性強、裂菌效應(yīng)快速及持續(xù)的特點，將天然的、可以不斷繁殖的噬菌體用于動物和人體的抗病原體感染、畜牧業(yè)環(huán)境凈化的探索性研究，已顯示出可喜的前景。相關(guān)研究也證實自然界存在廣譜噬菌體或者可使用人工改造技術(shù)將噬菌體宿主譜擴展[12]。隨著噬菌體裂解技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，對炭疽芽孢桿菌的分離鑒定將會更加快速準(zhǔn)確。

3 炭疽噬菌體的國內(nèi)外研究現(xiàn)況

3.1 炭疽噬菌體的國外研究現(xiàn)況從時間角度來看，早在1898年，俄羅斯微生物學(xué)家H.Φ.伽馬萊亞就觀察到一種炭疽芽孢桿菌的自溶現(xiàn)象，他認(rèn)為這種溶菌現(xiàn)象由分解過程中形成的一種物質(zhì)所致，并將其稱為“溶菌素”[16]。1931年，Cowles[17]發(fā)現(xiàn)了一株活躍于炭疽芽孢桿菌的噬菌體，他通過對炭疽芽孢桿菌菌株進(jìn)行連續(xù)地過濾，從污水中獲得了這種噬菌體，該噬菌體可以裂解美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection, ATCC）保存的所有炭疽芽孢桿菌菌株，但并未裂解Cowles發(fā)現(xiàn)的兩株運動型菌株，因此他懷疑這兩株菌株不是炭疽芽孢桿菌。1951年，英國的McCloy[18]從一株非典型芽孢桿菌菌株W中分離除了一株W噬菌體，這是炭疽噬菌體由溶原性蠟樣芽孢桿菌菌株分離的先例，她發(fā)現(xiàn)該噬菌體可裂解171株炭疽桿菌和54株蠟樣芽孢桿菌中的2株。同年，她發(fā)現(xiàn)這株噬菌體由一種主要的β形式和一種罕見的α突變體組成，α噬菌體和β噬菌體有著相同的血清學(xué)特性[19]。1955年，Brown等[20]從溶原性蠟樣芽孢桿菌W菌株中分離出了W噬菌體的變種——γ噬菌體，該噬菌體表現(xiàn)出與W噬菌體不同的特性，即：裂解光滑形式的炭疽芽孢桿菌，且未能裂解所測試的所有蠟樣芽孢桿菌。正因為γ噬菌體可以更有效地感染炭疽芽孢桿菌，所以它成為臨床上快速診斷炭疽芽孢桿菌的工具[21]。

由于γ噬菌體對炭疽芽孢桿菌的高度特異性，引發(fā)了不同年代的學(xué)者們對它的關(guān)注。1975年，Watanbe等[22]采用電子顯微鏡和負(fù)染色技術(shù)研究了炭疽芽孢桿菌γ噬菌體的精細(xì)結(jié)構(gòu)。之后，Schuch等[23]第一次對Wβ和Wγ噬菌體感染炭疽芽孢桿菌進(jìn)行詳細(xì)的基因組和功能分析，在對兩個基因組的比較分析中，他們發(fā)現(xiàn)γ噬菌體的變異可能是由親代Wβ噬菌體大小的缺失、點突變和與炭疽芽孢桿菌基因組的同源重組這些過程中導(dǎo)致的。2006年，F(xiàn)outs等[24]通過測序和比較分析，確定了炭疽芽孢桿菌噬菌體γ和Cherry的遺傳親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)這兩株噬菌體的基因組除了3個可變位點外完全相同。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，快速的、新型的檢測炭疽的診斷方法可以增強民用和軍事對炭疽作為生物武器的意外或故意擴散的反應(yīng)。目前基于實驗室的臨床鑒別需要12～120 h，并且需要使用特征明確的γ噬菌體進(jìn)行空斑分析，這至少還額外需要24 h的細(xì)菌培養(yǎng)[25]。為了縮短檢測時間，1959年，Chadwick[15]提出了采用噬菌體微量試驗法進(jìn)行炭疽芽孢桿菌的快速診斷，試驗結(jié)果表明Wα噬菌體對所試驗的炭疽芽孢桿菌菌株全部裂解。1961年，Dowdle等[26]提出了使用炭疽芽孢桿菌噬菌體熒光抗噬菌體染色法進(jìn)行炭疽芽孢桿菌的快速診斷。2015年，Cox等[25]提出了結(jié)合測流免疫層析（lateral flow immunochromatography, LFI）快速地檢測γ噬菌體擴增的自然特異性。用簡單、廉價的LFI檢測γ噬菌體擴增，為診斷炭疽芽孢桿菌提供了一種快速、靈敏和現(xiàn)場可部署的方法。該方法中，炭疽菌的產(chǎn)生時間大大縮短，且不需要廣泛的實驗室培養(yǎng)。

基于炭疽芽孢桿菌對裂解的敏感性，γ噬菌體裂解法成為了鑒定炭疽芽孢桿菌的常用診斷方法，且已被證明其特異性為97%。2017年，Kolton等[27]評估了炭疽芽孢桿菌聯(lián)合診斷試驗的診斷性能。他們發(fā)現(xiàn)炭疽芽孢桿菌γ噬菌體裂解診斷試驗的特異性為96%，與之前報道的結(jié)果一致。雖然γ噬菌體表現(xiàn)出相當(dāng)狹窄的宿主范圍，但相關(guān)研究證明，蠟樣芽孢桿菌（如ATCC4342）也對該噬菌體易感[28]。所以，在使用γ噬菌體檢測炭疽芽孢桿菌時，應(yīng)考慮此種誤差的可能性。此外，也有研究表明，炭疽的特異性噬菌體，尤其是γ噬菌體，無法感染有莢膜的炭疽芽孢桿菌。因此，Negus等[29]認(rèn)為這種炭疽特異性噬菌體不太可能有治療劑的效用。

除γ噬菌體外，還有許多其他炭疽噬菌體被發(fā)現(xiàn)。1958年，Ivanovics和Lantos采用“鏈霉素分離法”由土壤樣品中分離到炭疽噬菌體，并證明其對炭疽芽孢桿菌具有特異性。1959年，Stamatin等也由土壤樣品中分離到一株噬菌體，并命名為E噬菌體。同年，Ciuca等[15]將W、γ和E噬菌體應(yīng)用于130株地方性炭疽菌株，做了比較試驗，試驗結(jié)果表明，E噬菌體對所試驗的炭疽芽孢桿菌特異性最高。1963年，Buck等[30]從實驗室保存的溶原性炭疽芽孢桿菌中分離出了25株炭疽噬菌體，并選擇了其中的5株與γ噬菌體進(jìn)行比較，結(jié)果顯示這些噬菌體對于鑒定炭疽芽孢桿菌是有一定幫助的。1974年，Nagy[31]在鏈霉素分離法的幫助下，由土壤樣品中分離到一株炭疽芽孢桿菌特異性噬菌體，命名為AP50。噬菌體AP50的核酸為RNA，病毒粒子包含了5種不同的磷脂，這是第一次從革蘭氏陽性宿主中分離出來的含有磷脂的RNA噬菌體。隨后，Nagy對其進(jìn)行了詳細(xì)的研究，發(fā)現(xiàn)AP50似乎具有一些不尋常的特征——對宿主的極端特異性：即34株炭疽芽孢桿菌僅有1/3被裂解，屬于6種不同桿菌片段的52個菌株中沒有一個對AP50敏感。1996年，Jameel等[32]分離出一株Φ20噬菌體，該噬菌體為雙鏈DNA病毒，具有48 756 bp的基因組大小，及直徑65 nm、長217 nm、寬15 nm的多面體頭、尾。其限制性位點圖顯示了包括BamHⅠ、BglⅡ和SstⅠ等9個酶切位點。2002年，Walter等[33]研究了來自愛荷華州表層土壤的3株炭疽芽孢桿菌噬菌體（Nk、DB、MH）的特征。研究表明，這3株噬菌體均可裂解炭疽芽孢桿菌。其中兩株為肌尾噬菌體（噬菌體Nk和DB），另一株為短尾噬菌體（噬菌體MH）。與肌尾噬菌體SP50相比，雖然Nk和DB的形態(tài)與SP50類似，但Nk和DB均未感染枯草芽孢桿菌HWA 1243；Nk、DB和SP50的蛋白質(zhì)圖譜以約97 kDa的條帶區(qū)分，這些條帶存在于Nk的結(jié)構(gòu)蛋白圖譜中，但在DB和SP50中均不存在；DB的蛋白質(zhì)比Nk和SP50的大；電泳分析表明，只有SP50的DNA不易被限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ切割。噬菌體MH與噬菌體Φ29的形態(tài)也非常相似，但噬菌體MH未能感染枯草芽孢桿菌；MH和Φ29的蛋白質(zhì)譜在66 kDa和97 kDa間的條帶數(shù)量和強度以及30 kDa以下緊密遷移條帶的大小上也有所不同。MH DNA遷移略高于Φ29 DNA（19.2 kb），接近23 kb。綜上所述，噬菌體Nk和DB在形態(tài)上類似于肌病毒科噬菌體SP50，噬菌體MH在形態(tài)上也類似噬菌體Φ29，但它們的宿主范圍、蛋白質(zhì)和DNA特征方面都有所不同。

噬菌體Fah在前蘇聯(lián)被用于鑒定炭疽芽孢桿菌，該噬菌體由俄羅斯Pokrov修復(fù)工廠生產(chǎn)。2005年，Minakhin等[34]分析了炭疽芽孢桿菌噬菌體Fah基因組的37 974 bp序列，并檢測了該噬菌體在蠟樣芽孢桿菌模型宿主中的基因表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ah基因組的一半包含編碼結(jié)構(gòu)蛋白和宿主裂解功能的基因，這是長尾噬菌體科（Syphoviridae）的典型排列方式?；蚪M的另一半包含編碼病毒基因組復(fù)制酶和許多可能調(diào)節(jié)病毒基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的基因。

2009年，Schuch等[35]新發(fā)現(xiàn)了一種從赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）的腸道中分離出來的炭疽芽孢桿菌噬菌體——蠕蟲腸道噬菌體1（Wip1）。該噬菌體表現(xiàn)出非常狹窄的宿主范圍，并對炭疽芽孢桿菌具有高度特異性。2013年，Negus等[29]檢驗了γ、Fah、F7和F9四種噬菌體的溶菌能力。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)7和F9通過裂解57株桿菌（包括4株炭疽芽孢桿菌）建立了宿主特異性，且F7和F9屬于長尾噬菌體科（Siphoviridae），兩者都有長且不可收縮的尾巴和二十面體的頭部。2018年，Alkalay等[36]從土壤樣品中分離到新型高效的炭疽芽孢桿菌噬菌體Negev_SA、Carmel_SA和Tavor_SA，并對其全基因組進(jìn)行測序和分析，他們表明，這些噬菌體在未來的炭疽噬菌體治療中具有潛在的應(yīng)用價值。2020年，Hassim等[37]從懷疑死于炭疽的角馬尸體上分離出一種dsDNA噬菌體，并采用經(jīng)典細(xì)菌學(xué)方法對不同條件下分離的噬菌體進(jìn)行檢測，以模擬不斷惡化的尸體狀況。他們采用全基因組測序確定該噬菌體和Crookii噬菌體間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)這株噬菌體屬于肌尾噬菌體科（Myoviridae），與另一株和非洲炭疽菌尸體相關(guān)的噬菌體WPh密切相關(guān)。Crookii噬菌體對蠟樣芽孢桿菌組成成員具有溶解性，但較低濃度（＜1×108PFU/mL）的噬菌體對有莢膜的炭疽芽孢桿菌表現(xiàn)出更大的親和力。這種噬菌體的異常分離證明了噬菌體在環(huán)境中的較少劑量和炭疽芽孢桿菌在尸體部位處于的生命周期中的作用。

圖2 不同的炭疽芽孢桿菌噬菌體電鏡圖Fig.2 Transmission electron micrographs of different Bacillus anthracis phage

3.2 炭疽噬菌體的國內(nèi)研究現(xiàn)況1963年，董樹林等[39]分離到我國第一株炭疽芽孢桿菌噬菌體，編號為AP631，并對其耐力、宿主范圍及裂解特異性進(jìn)行了初步試驗。經(jīng)裂解試驗表明，AP631能夠完全裂解國外炭疽強毒菌株、國內(nèi)分離的地方性炭疽強毒菌株，以及弱毒炭疽芽孢桿菌共計102株。對其他需氧芽孢桿菌，如蠟狀芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等共計13株，全部未能裂解。證明其宿主范圍廣泛，特異性強。為了進(jìn)一步利用AP631進(jìn)行病原學(xué)診斷，2005年，王秉翔等[5]按測定噬菌體效價的方法檢測AP631裂解已形成莢膜的炭疽菌的作用，結(jié)果說明AP631不能裂解已形成莢膜的炭疽芽孢桿菌。將在產(chǎn)莢膜條件和非產(chǎn)莢膜條件下培養(yǎng)的Pasteur NO.2菌分別與AP631進(jìn)行吸附后，從電鏡下可見到AP631大量吸附于未形成莢膜的細(xì)菌體周圍，而不吸附于有莢膜者。這兩個試驗證明了炭疽芽孢桿菌的莢膜能夠掩蓋其噬菌體受體。其實用意義在于用噬菌體鑒定炭疽芽孢桿菌必須在細(xì)菌的非產(chǎn)莢膜條件下進(jìn)行，以避免漏檢而影響疾病的診斷。

噬菌體裂解法是鑒定炭疽芽孢桿菌的可靠方法之一。常規(guī)方法需要使用幼齡肉湯培養(yǎng)物、試驗平板置37℃培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果。為簡化手續(xù)，縮短鑒定時間，劉茂賢等[40]曾對炭疽芽孢桿菌W噬菌體裂解現(xiàn)象及結(jié)果的影響因素作了實驗觀察，并擬定出3～5 h得出確切結(jié)果的快速裂解法，即加大測試菌量、輔以玻璃棒均勻涂布，直接取分離培養(yǎng)物做裂解試驗。經(jīng)實驗室保存和疫區(qū)新分離炭疽芽孢桿菌的鑒定，證明該法快速、簡便、準(zhǔn)確，適用于炭疽芽孢桿菌的快速鑒定。

2016年，張慧娟等[41]對陜西省延安市甘泉縣炭疽疫點現(xiàn)場分離的5株菌進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌的鑒定，通過PCR擴增、小白鼠毒理測定試驗和MLST基因檢測等方法對該5株菌和實驗室保存的3株被AP631炭疽噬菌體裂解的蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行毒理和基因測定。結(jié)果確定了8株可被AP631炭疽噬菌體不完全裂解的蠟樣芽孢桿菌，從疫點采集分離的5株菌青霉素敏感試驗陰性，炭疽毒力基因PCR擴增陰性，排除了炭疽芽孢桿菌；蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗染色試驗為陰性，排除了蘇云金芽孢桿菌；根據(jù)溶血試驗和生化反應(yīng)等一系列鑒別實驗鑒定為蠟樣芽孢桿菌。這一研究首次證明我國使用的炭疽芽孢桿菌診斷AP631噬菌體可以不完全裂解部分蠟樣芽孢桿菌，存在非特異性裂解現(xiàn)象，提示今后使用噬菌體鑒定炭疽芽孢桿菌時，對于外環(huán)境分離到的可疑芽孢桿菌，特別要注意關(guān)于噬菌體不完全裂解的問題，這為炭疽診斷標(biāo)準(zhǔn)的正確制定提供新的認(rèn)識并有重要的指導(dǎo)意義。

2019年，Liu等[42]對AP631噬菌體進(jìn)行了完整的基因組序列測序，并與蠟樣芽孢桿菌及其相關(guān)物種的其他噬菌體進(jìn)行了基因組比較分析。噬菌體AP631的雙鏈環(huán)狀DNA基因組長度為39 549 bp，G+C的含量為35.01%。通過分析發(fā)現(xiàn)，噬菌體AP631屬于蠟樣芽孢桿菌噬菌體分支Ⅱ?；蚪M比較分析顯示，AP631噬菌體與炭疽芽孢桿菌噬菌體Wβ、γ、Cherry和Fah具有高度的序列相似性。

綜上所述，我國炭疽芽孢桿菌噬菌體的裂解情況比之國外較少。我們需要更多的炭疽噬菌體，在面對炭疽疫情的暴發(fā)時才會有更多有效、可靠的鑒別診斷手段。

4 展望

地球上的噬菌體數(shù)量繁多，并且在精準(zhǔn)治療以及耐藥菌感染的防控方面展現(xiàn)出巨大的潛力，如果能夠合理利用，將是人類面對感染性疾病的重要資源庫[43]。但是炭疽噬菌體在分離鑒定等方面仍存在一些不可控因素。比如，所采樣的環(huán)境中是否含有目標(biāo)噬菌體，噬菌體的富集過程產(chǎn)生的不可預(yù)測的結(jié)果，細(xì)菌對噬菌體的耐受，以及噬菌體的特異性。由于噬菌體的特異性不僅體現(xiàn)在不同細(xì)菌之間，在同一種細(xì)菌的不同菌株之間也有體現(xiàn)。由前文的綜述可以看出，目前已分離出的可以裂解炭疽芽孢桿菌的噬菌體，也存在裂解其他桿菌的現(xiàn)象。這些問題不僅是分離鑒定炭疽噬菌體的阻礙，也是將炭疽噬菌體用于炭疽芽孢桿菌鑒定以及炭疽的治療和預(yù)防的一大難點。除此之外，若想將炭疽噬菌體用于臨床治療，我們需要更好地了解噬菌體如何與人類免疫系統(tǒng)相互作用，以及清除細(xì)菌感染的后果[44]，還有就是將炭疽噬菌體用于生態(tài)防控，我們需要更多的炭疽噬菌體，并對其進(jìn)行深入分析、評價，建立相應(yīng)的評價體系，這對于開發(fā)基于噬菌體的應(yīng)用是至關(guān)重要的。