血清嗜酸性粒細(xì)胞神經(jīng)毒素的表達(dá)及與變應(yīng)性鼻炎舌下免疫治療療效的相關(guān)性研究

蔣遠(yuǎn)偉，胡偉群，蔡志福，戴惠婷，林超凡，潘金霞

（莆田學(xué)院附屬醫(yī)院，福建 莆田 351100）

變應(yīng)性鼻炎（Allergic rhinitis，AR）是易感個(gè)體在接觸變應(yīng)原后所誘發(fā)的鼻黏膜高反應(yīng)性疾病，表現(xiàn)為鼻塞、大量水樣鼻溢以及陣發(fā)性噴嚏，已成為影響全球的健康問題之一［1］。目前，AR 以避免接觸變應(yīng)原、正確使用糖皮質(zhì)激素為主要治療原則，以塵螨為主要變應(yīng)原，合并其他變應(yīng)原種類少的患者可行特異性免疫治療（Allergen-specific immunotherapy，AIT），而藥物和免疫治療療效欠佳者可行外科治療［2］。AIT是通過讓患者反復(fù)接觸變應(yīng)原，使個(gè)體免疫系統(tǒng)逐漸適應(yīng)，最終對(duì)外界環(huán)境中的變應(yīng)原刺激產(chǎn)生耐受的過程。AIT 主要分為皮下免疫治療（Subcutaneous immunotherapy，SCIT）和舌下免疫治療（Sublingual immunotherapy，SLIT），后者由于局部和全身不良反應(yīng)率更低、治療方便，更易為患者所接受。盡管SLIT 具有較好的療效，但仍有一定比例的患者不能從中獲益，因此，治療前通過客觀指標(biāo)或方法預(yù)測(cè)SLIT 療效顯得尤為重要。然而臨床尚無有效生物學(xué)標(biāo)志物用于SLIT的療效預(yù)測(cè)。

嗜酸性粒細(xì)胞活化與脫顆粒在變應(yīng)性疾病的病理過程中具有重要作用，因此，該生物學(xué)行為的檢測(cè)在變應(yīng)性疾病的診治中具有潛在價(jià)值［3］。嗜酸性粒細(xì)胞神經(jīng)毒素（Eosinophil-derived neurotoxin，END）是一種細(xì)胞毒蛋白，由活化的嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒時(shí)釋放，本質(zhì)為具有抗病毒和抗菌活性的RNA酶［4］。近年來陸續(xù)有研究關(guān)注EDN 在哮喘中的作用，并發(fā)現(xiàn)在哮喘患者外周血中EDN 水平顯著升高，且與哮喘的嚴(yán)重程度和氣道高反應(yīng)性相關(guān)［5-6］。也有研究發(fā)現(xiàn)EDN 可以通過誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞性鼻竇炎患者的氣道重塑［7］。這些發(fā)現(xiàn)均提示EDN在氣道炎性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。但是目前尚無研究探索EDN 在AR 患者中的表達(dá)以及與SLIT 療效的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象本研究選取2017 年5月至2018 年5 月就診于莆田學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科門診診斷為AR 并接受SLIT 的患者79 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴年齡≥18歲且≤60歲；⑵符合變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南（2015 年，天津）［8］中AR 的診斷標(biāo)準(zhǔn)；⑶中-重度持續(xù)性AR。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并慢性鼻-鼻竇炎等其他鼻部疾??；⑵合并風(fēng)濕免疫性疾病或惡性腫瘤；⑶入組前4周內(nèi)曾全身使用糖皮質(zhì)激素或抗組胺藥等藥物；⑷既往曾接受AIT。

對(duì)照組則選擇同時(shí)期在體檢中心進(jìn)行健康體檢的性別年齡相匹配的健康志愿者40 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴年齡≥18 歲且≤60 歲；⑵經(jīng)血清特異性IgE 檢測(cè)為陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并慢性鼻-鼻竇炎等鼻部疾?。虎坪喜⒆儜?yīng)性哮喘等變態(tài)反應(yīng)性疾?。虎呛喜L(fēng)濕免疫性疾病或惡性腫瘤；⑷入組前4 周內(nèi)全身使用糖皮質(zhì)激素或抗組胺藥等藥物；⑸存在既往過敏病史。

本研究由莆田學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有檢查和治療均經(jīng)患者知情同意并簽署知情同意書，本研究的開展符合赫爾辛基宣言。

1.2 研究方法

1.2.1臨床資料收集收集入組病例的相關(guān)臨床資料，包括性別、年齡、外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和比例、血清總IgE 濃度、合并哮喘情況、合并變應(yīng)性皮炎情況、治療前后藥物癥狀評(píng)分（Symptom and medication score，SMS）以及視覺模擬量表評(píng)分（Visual analog scale，VAS）、鼻部癥狀總評(píng)分（Total nasal symptoms score，TNSS）等。將治療后SMS 較治療前基線下降水平≥30%的患者歸為有效組，SMS下降＜30%患者歸為無效組［9］。

1.2.2研究對(duì)象血清樣本收集及EDN 濃度檢測(cè)

采集入組的研究對(duì)象外周靜脈血5 mL，于室溫下靜置2 h。隨后利用高速離心機(jī)在4 ℃環(huán)境下以800 rmp·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min，將淡黃色上清液轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，在4 ℃環(huán)境下以3 000 rmp·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min，收集上清液至1.5 mL EP 管中，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ∏捌谑占耐庵苎鍢颖?，靜置于室溫下解凍。使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒檢測(cè)血清樣本中的EDN 濃度。為提高該檢測(cè)方法精準(zhǔn)度，所有檢測(cè)孔均設(shè)立副孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究采用GraphPad Prism 7.0和SPSS 23.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以-x±s表示，組間比較兩獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)和多獨(dú)立樣本采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher's 精確檢驗(yàn)。EDN 的表達(dá)水平和臨床資料間的相關(guān)性探討采用Spearman相關(guān)性分析。利用二元Logistic 回歸模型和ROC 曲線分析目標(biāo)蛋白與SLIT 療效的相關(guān)性及檢驗(yàn)效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照組和AR 組臨床資料比較本研究共納入AR 患者（AR 組）79 例，健康志愿者（對(duì)照組）40例。兩組患者的性別、年齡、合并變應(yīng)性皮炎情況、合并哮喘情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。AR組的外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及比例和血清總IgE濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見表1。

表1 對(duì)照組和AR組臨床資料比較

AR 組79 例，其中完成3 年療程患者共46 例。我們?cè)u(píng)估療效后將患者分為有效組（n=31）和無效組（n=15）。兩組間性別、年齡、合并變應(yīng)性皮炎情況、合并哮喘情況、外周血嗜酸性粒細(xì)胞比例及治療前的VAS 評(píng)分、TNSS 評(píng)分和SMS 評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），有效組外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和血清總IgE 濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見表2。

表2 有效組和無效組臨床資料對(duì)比

2.2 血清EDN 濃度與臨床指標(biāo)相關(guān)性AR 患者血清EDN 濃度［（100.6±6.2） ng·mL-1］顯著高于對(duì)照組［（61.3±5.5） ng·mL-1］（P＜0.000 1）；SLIT 有效組血清EDN 濃度［（63.0±9.7） ng·mL-1］顯著低于SLIT 無效組［（93.41±6.74） ng·mL-1］（P=0.012），見圖1。Spearman 相關(guān)性分析：血清EDN 濃度與外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（r=0.288，P=0.002）及比例（r=0.284，P=0.002）、血清總IgE 濃度（r=0.460，P＜0.000 1）以及SMS 評(píng)分（r=0.253，P=0.024）均呈正相關(guān)，與鼻部癥狀VAS 評(píng)分（r=0.446，P=0.215）以及TNSS 評(píng)分無明顯相關(guān)性（r=0.152，P=0.178），見圖2。

圖1 各組血清EDN濃度比較

圖2 AR患者血清EDN濃度各臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

2.3 血清EDN 預(yù)測(cè)SLIT 療效的應(yīng)用價(jià)值評(píng)估

利用二分類Logistic 回歸分析外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清總IgE 濃度以及血清EDN 水平對(duì)研究對(duì)象SLIT 療效的影響，結(jié)果血清EDN 水平與SLIT療效明顯相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007），見表3。進(jìn)而繪制血清EDN 水平預(yù)測(cè)SLIT 療效的ROC曲線并計(jì)算曲線下面積（Area under the curve，AUC），該指標(biāo)的AUC 為0.812，敏感度為0.742，特異度為0.8，見圖3。

圖3 血清EDN濃度對(duì)SLIT療效的ROC曲線分析

表3 與SLIT預(yù)后相關(guān)臨床變量的二元Logistic回歸分析

3 討 論

本研究通過檢測(cè)入組病例的血清EDN 濃度，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，AR 組EDN 濃度顯著升高并與外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及比例、血清總IgE 濃度呈正相關(guān)。此外根據(jù)SLIT 療效分組后，有效組中EDN濃度顯著低于無效組，二元Logistic 回歸和ROC 曲線分析提示血清EDN 濃度具有較好的SLIT 療效預(yù)測(cè)效能。因此，EDN 有可能在AR 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，是潛在的預(yù)測(cè)SLIT 療效的客觀生物學(xué)指標(biāo)。

嗜酸性粒細(xì)胞是一種含有嗜酸性顆粒蛋白（Eosinophilic granule proteins，EGPs）的炎性細(xì)胞，其在AR的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。EGPs包括主要堿性蛋白、嗜酸性陽(yáng)離子蛋白、嗜酸性過氧化物酶以及EDN，具有抗寄生蟲和抗菌活性，參與機(jī)體免疫反應(yīng)［10］。KIM H S 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，特應(yīng)性皮炎患者血清EDN 水平與其癥狀評(píng)分呈顯著正相關(guān)，且在嚴(yán)重頑固性組的復(fù)發(fā)患者中升高，提出血清EDN 水平對(duì)復(fù)發(fā)性特應(yīng)性皮炎患者具有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值。RYCYK A 等［12］發(fā)現(xiàn)與胃腸道功能紊亂的嬰兒相比，變應(yīng)性結(jié)直腸炎患兒糞便中的EDN 水平顯著增加，糞便EDN 水平的檢測(cè)可鑒別食入變應(yīng)原誘導(dǎo)的變應(yīng)性結(jié)直腸炎癥。然而目前尚無相關(guān)研究對(duì)EDN在變應(yīng)性鼻炎患者中的表達(dá)情況進(jìn)行探索。本研究通過檢測(cè)研究對(duì)象的血清EDN 水平，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，EDN 在變應(yīng)性鼻炎患者外周血中的表達(dá)水平顯著上調(diào)；而Spearman 相關(guān)性分析同樣顯示AR患者血清EDN 水平與疾病的VAS 評(píng)分、TNSS 評(píng)分呈顯著正相關(guān)，提示EDN 可能參與AR 的發(fā)生發(fā)展，其表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。

有研究表明，AR 以Th2 型炎癥反應(yīng)為主，嗜酸性炎癥反應(yīng)為其主要組織病理特征，表現(xiàn)為嗜酸性粒細(xì)胞活化、增殖，并趨化聚集至鼻黏膜局部［13］。EDN 由活化的嗜酸性粒細(xì)胞合成分泌，可通過誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的成熟和遷徙，增強(qiáng)Th2型免疫應(yīng)答［14］。近年來有研究者在嗜酸性粒細(xì)胞性鼻竇炎人群血清樣本發(fā)現(xiàn)EDN 表達(dá)水平顯著上調(diào)，與疾病的活動(dòng)呈顯著正相關(guān)，且可誘導(dǎo)鼻上皮細(xì)胞生成基質(zhì)金屬蛋白酶-9，通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑調(diào)控剔出-合并-重排-簡(jiǎn)化（Elimination-combination-rearrangement-simplification，ECRS）的病理進(jìn)程，參與局部嗜酸性炎癥［7］。本研究通過Spearman 相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)AR 患者血清EDN 水平與外周血總IgE 濃度和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及比例呈正相關(guān)，這一結(jié)果與既往前期研究相符，提示EDN 同樣參與AR 患者的嗜酸性炎癥反應(yīng)，且其水平上調(diào)提示嗜酸性炎癥反應(yīng)加重。AIT 可通過誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受，治療或減輕AR臨床癥狀，是目前唯一可改變AR 疾病進(jìn)程的治療手段。其中，SLIT 相對(duì)無創(chuàng)、耐受性好［15］，但整體療效尚不明確，因此，預(yù)測(cè)SLIT 療效的可靠生物學(xué)指標(biāo)亟待探索。AN J 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，與外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)相比，EDN 可較可靠地反應(yīng)變應(yīng)性哮喘患者的疾病控制狀態(tài)，且可以預(yù)測(cè)哮喘患者對(duì)美泊利單抗的治療反應(yīng)［17］。近期RUTTEN B等［18］對(duì)EDN的穩(wěn)定性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其不受吸煙以及晝夜節(jié)律影響，且在樣本離體后可穩(wěn)定存在，-80 ℃環(huán)境下可保存1 年，是一種穩(wěn)定的生物標(biāo)志物。而本研究利用ROC 曲線對(duì)患者血清EDN 水平和SLIT 療效進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)EDN 可有效預(yù)測(cè)其療效。因此，結(jié)合既往研究結(jié)果，本研究初步認(rèn)為血清EDN 參與AR 的免疫應(yīng)答反應(yīng)，其濃度可反應(yīng)AR 患者嗜酸性炎性反應(yīng)程度，并可較好地預(yù)測(cè)SLIT 對(duì)于AR 患者的療效，且離體后可在一定時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定存在，具有成為SLIT療效預(yù)測(cè)的生物標(biāo)記物的潛力。

綜上所述，在AR 患者血清中可有EDN 濃度的增加，且增加程度和患者癥狀嚴(yán)重程度以及外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清總IgE 濃度呈正相關(guān)。血清EDN 水平的檢測(cè)具有診斷AR 以及預(yù)測(cè)AR 患者對(duì)SLIT 反應(yīng)的生物學(xué)潛在價(jià)值。但本研究樣本量小，隨訪時(shí)長(zhǎng)尚顯不足，且未對(duì)EDN 在AR 中的作用機(jī)制進(jìn)行深入探索，研究結(jié)論尚待遠(yuǎn)期大樣本多中心研究加以驗(yàn)證。