黑骨藤中強心苷類成分研究進(jìn)展

張 馳，楊燕玲，陳 壘，劉 濤

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；2. 江西贛南海欣藥業(yè)股份有限公司，江西 贛州 341000）

黑骨藤（Periploca forrestiiSchltr.）為蘿藦科，杠柳屬植物，別名又稱為黑骨藤、飛仙藤、青蛇膽、黑骨頭、達(dá)風(fēng)藤（云南）、西南杠柳（俗稱）等。植株有小毒，葉含強心甙，全株可供藥用。依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論，黑骨藤具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)的功效，臨床可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、胃痛、消化不良、閉經(jīng)、瘧疾等癥［1-2］。黑骨藤作為草藤科類最為有效的風(fēng)濕治療藥物， 在民間被稱為“萬藤之王”［3］。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黑骨藤具有多種生物活性，包括抗炎、促進(jìn)傷口愈合、抗腫瘤、強心作用等［4-6］。植物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黑骨藤中化學(xué)成分結(jié)構(gòu)多樣，其中強心苷是其主要成分之一，也被認(rèn)為是黑骨藤發(fā)揮多種生物學(xué)功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［7］。作為黑骨藤中一類重要的天然產(chǎn)物，強心苷一直備受關(guān)注，被學(xué)者們廣泛研究。目前，黑骨藤在臨床已得到廣泛應(yīng)用，然而其確切的活性物質(zhì)基礎(chǔ)或活性物質(zhì)群仍未得到明確歸屬，作用機制也有待進(jìn)一步研究。

本文對黑骨藤的傳統(tǒng)用法、藥物分析方法及毒理作用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并聚焦于其中的強心苷類成分，重點介紹其化學(xué)成分和藥理活性，從植物化學(xué)和藥理作用的角度揭示其傳統(tǒng)用法的現(xiàn)代生物學(xué)內(nèi)涵，為黑骨藤的后續(xù)研究與開發(fā)提供思路。

1 植物特征與分布

黑骨藤（Periploca forrestiiSchltr.）為蘿藦科（Asclepiadaceae），杠柳屬（Periploca）植物。藤狀灌木，長達(dá)10 m，具乳汁，多分枝，全株無毛。葉革質(zhì)，披針形，長3.5～7.5 cm，寬5～10 mm，頂端漸尖，基部楔形；中脈兩面略凸起，側(cè)脈纖細(xì)，密生，幾平行，兩面扁平，在葉緣前連結(jié)成1條邊脈；葉柄長1～2 mm。聚傘花序腋生，比葉為短，著花1～3 朵；花序梗和花梗柔細(xì)；花小，黃綠色；花萼裂片卵圓形或近圓形，長1.5 mm，無毛；花冠近輻狀，花冠筒短，裂片長圓形，長2.5 mm，兩面無毛，中間不加厚，不反折；副花冠絲狀，被微毛；花粉器匙形，四合花粉藏在載粉器內(nèi)；雄蕊著生于花冠基部，花絲背部與副花冠裂片合生，花藥彼此粘生，包圍并粘在柱頭上；子房無毛，心皮離生，胚珠多個，柱頭圓錐狀，基部具五棱。蓇葖雙生，長圓柱形，長達(dá)11 cm，直徑5 mm；種子長圓形，扁平，頂端具白色絹質(zhì)種毛；種毛長3 cm。花期3～4 月，果期6～7 月。黑骨藤生于海拔2 000 m以下山地疏林向陽處或蔭濕的雜木林下或灌木叢中，主要分布于西藏、青海、四川、貴州、云南和廣西等地［1］。

2 傳統(tǒng)用法

黑骨藤始載于《滇南本草》，如今在《中國植物志》和《中華本草》以及一些地方藥用植物志等均有收錄。于秋冬季采收，洗凈，切片或切段后曬干，根或全株可作藥用。根據(jù)中藥藥性理論，其味辛、苦，性熱，有小毒，入冷經(jīng)。具有祛風(fēng)除濕，舒筋活絡(luò)的功效，因此常用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、骨折、胃痛、牙痛、消化不良、閉經(jīng)、瘧疾等疾病的治療。臨床使用中，內(nèi)服（3～6 g 煎湯或泡酒）和外用（適量藥材搗爛外敷）均可。例如，黑骨藤15 g 和大青藤根9 g 泡酒服，可用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛的治療，同時溫酒擦拭患處。黑骨藤9 g 溫酒煎服可用于治療跌打損傷后筋骨疼痛。黑骨藤6 g、紅糖5 g 水煎服可用于治療牙痛。以黑骨藤、大風(fēng)藤和追風(fēng)傘按30∶20∶17 比例配伍而成的復(fù)方制劑“黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊”，具有祛風(fēng)除濕，通絡(luò)止痛的功效，治療風(fēng)寒濕痹、肩臂腰腿疼痛，對于肝炎、潰瘍病患者禁服，一日用量不宜超過10 g。過量會出現(xiàn)抽搐，甚至死亡［2］。

3 強心苷類成分

通過調(diào)研國內(nèi)外文獻(xiàn)，截至目前，從黑骨藤中一共分離和鑒定了28 種強心苷類成分。其中化合物（5、8、9、10、12、15、18、28）是通過質(zhì)譜裂解規(guī)律鑒定得到。結(jié)構(gòu)差異主要表現(xiàn)為C-3、5、7、8、14 位羥基個數(shù)和位置不同以及C-3 位糖的類型和個數(shù)不同。具 體 化 學(xué) 結(jié) 構(gòu) 和 相 應(yīng) 參 考 文 獻(xiàn)［5，8-12］見 表1和圖1。

圖1 黑骨藤中分離得到的強心苷類化合物

表1 黑骨藤中分離鑒定的強心苷類化合物

4 藥理作用

4.1 抗炎在臨床實踐中，黑骨藤常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，這與中醫(yī)“祛風(fēng)除濕”的理論一致。例如，黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)顆粒是一個以黑骨藤為主要成分的抗風(fēng)濕中藥復(fù)方制劑，被（中國）國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)作為治療關(guān)節(jié)炎的OTC 藥。KANG Z 等［13］通過生物信息學(xué)探討了該復(fù)方制劑治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機制，并在膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（Collagen-induced arthritis， CIA）小鼠和U937細(xì)胞上進(jìn)行了驗證。結(jié)果顯示，該復(fù)方制劑主要通過阻斷IL-12 信號通路活化，抑制炎性細(xì)胞浸潤和關(guān)節(jié)腫脹，從而發(fā)揮對關(guān)節(jié)炎的治療作用。

大量研究均表明，黑骨藤具有顯著的抗炎作用，然而其抗炎活性成分目前未有統(tǒng)一的結(jié)論。劉明等［14］考查了黑骨藤水、正丁醇、氯仿、醋酸乙酯、石油醚等不同萃取部位的抗炎鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果顯示，灌胃給藥后，黑骨藤各提取部位對醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體反應(yīng)均表現(xiàn)出抑制作用，其中黑骨藤正丁醇提取部位高劑量組（3 g·kg-1）效果最好，其疼痛抑制率為80.2%，同時正丁醇部位對小鼠肉芽濕質(zhì)量和干質(zhì)量也表現(xiàn)出抑制作用。以上結(jié)果證明了正丁醇部位是黑骨藤抗炎鎮(zhèn)痛的有效部位，而正丁醇對強心苷類成分萃取效果較好，因此我們推測黑骨藤的抗炎鎮(zhèn)痛作用可能與其中的強心苷類成分有關(guān)。

BAO C M 等［15］對 黑 骨 藤 根 部 進(jìn) 行 回 流 提 ?。?0%乙醇），提取液石油醚脫脂后利用正丁醇進(jìn)行萃取獲得強心苷富集部位。干浸膏以50 mg·kg-1劑量進(jìn)行小鼠灌胃給藥，研究強心苷富集部位對膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（CIA）的治療作用。他們發(fā)現(xiàn)強心苷部位能抑制NF-κB p65磷酸化和阻斷AP-1/c-Fos轉(zhuǎn)錄活性，降低炎癥因子如IgG2a、TNF-α的表達(dá)，并且在CIA 小鼠和破骨細(xì)胞分化因子（Receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞中，下調(diào)Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4， TLR4）、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）和MMP-9 的表達(dá)。同時，研究發(fā)現(xiàn)，杠柳苷（黑骨藤中的代表性強心苷成分）能以劑量依賴的方式（0.5～10 μg·mL-1）抑 制RANKL 誘 導(dǎo) 的 破 骨 細(xì) 胞 形 成。LIU Y Q 等［16］也通過大鼠灌胃給藥治療，評價了黑骨藤強心苷提取部位對佐劑誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎（Adjuvant-induced arthritis， AIA）的治療作用。同樣地，強心苷部位（50 mg·kg-1）能改善關(guān)節(jié)病理變化，降低AIA 大鼠脾細(xì)胞IL-6 和TGF-β1水平，抑制關(guān)節(jié)滑膜STAT3 和IKK-α 蛋白磷酸化。同時，他們也證明，黑骨藤中主要強心苷類成分杠柳苷（Periplocin）能抑制脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的AIA大鼠脾細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子的生成。LIU T 等［17］也證實黑骨藤強心苷富集部位口服給 藥 后（125 mg·kg-1，250 mg·kg-1和500 mg·kg-1）能抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹，改善踝關(guān)節(jié)病理損傷，降低血清類風(fēng)濕因子（Rheumatoid factor，RF）、TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2、NO 和MDA 水平，以及上調(diào)血清SOD活性。其抗炎作用機制與NF-κB和MAPK信號通路抑制有關(guān)。

CHEN L 等［18］研究證實，黑骨藤乙醇提取物灌胃給藥后（200～400 mg·kg-1）能改善膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)腫脹和炎性浸潤，降低血清中IL-1β、TNF-α 和IL-6水平，并揭示其抗炎作用機制與Src/NF-κB信號通路抑制有關(guān)。同時，通過HPLC-QTOF-MS/MS 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)從總提物中一共鑒定了38個化合物，其中強心苷或苷元14 個［6］。眾所周知，強心苷是Na/K-ATPase 的常見配體。研究發(fā)現(xiàn)，Na/K-ATPase 除了離子泵活性外，還具有受體功能，能與Src 相互作用，形成一個復(fù)合受體，誘導(dǎo)酪氨酸蛋白磷酸化和下游信號通路活化，引起多種生物學(xué)效應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、遷移和炎癥反應(yīng)等［19］。因此，他們也推測黑骨藤治療關(guān)節(jié)炎的分子作用機制可能與強心苷類成分和Na/K-ATPase 的相互作用有關(guān)，通過與Na/K-ATPase 結(jié)合，抑制Src 活化，從而阻斷NF-κB p65磷酸化以及核轉(zhuǎn)位，抑制COX-2 表達(dá)和TNF-α、IL-6和PGE-2等炎性介質(zhì)的釋放［18］。

4.2 傷口愈合中醫(yī)理論認(rèn)為，黑骨藤具有“舒筋活絡(luò)”的作用， 民間也廣泛用于跌打損傷。如黑骨藤伸筋透骨噴霧劑是以黑骨藤為君藥，由13種天然藥用植物組成的中藥復(fù)方制劑，可用于治療急性軟組織損傷。曹晴晴等［20］通過臨床試驗評價該噴霧劑對急性軟組織損傷的療效和安全性。將80 例急性軟組織損傷患者隨機分為黑骨藤伸筋透骨噴霧組（治療組）和對照組。治療組用黑骨藤伸筋透骨噴霧劑擦拭傷口，每次10～20 滴（約2～3 mL），一日3次；對照組采用正骨水，每次10～20 滴（約2～3 mL），一日3 次。治療10 天后，治療組在疼痛、腫脹、關(guān)節(jié)功能改善方面優(yōu)于對照組，有效率為96.67%，證實了該噴霧劑具有治療急性軟組織損傷的療效且無毒副作用。

傷口愈合由4 個連續(xù)又相互交錯的時期組成，其中增殖期是傷口修復(fù)的關(guān)鍵階段。該時期成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞大量增殖、血管新生，和膠原蛋白一起形成肉芽組織［21］。LI J S 等［22］通過L929 小鼠成纖維細(xì)胞評價了黑骨藤的促傷口愈合作用。與對照組相比，50 μg·mL-1的黑骨藤莖部乙醇提取液孵育24 h 后，能夠顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，其增殖作用高達(dá)168%。同時促進(jìn)L929 細(xì)胞分泌膠原蛋白和遷移。通過大孔吸附樹脂，分離篩選得到65%乙醇洗脫部位為活性部位，并利用HPLCQTOF-MS/MS 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定其主要成分為強心苷類。為了闡明活性部位促創(chuàng)口愈合的作用機制，將活性部位制成濃度為0.1%（g/g）的水凝膠。治療10～12 天后，大鼠皮膚傷口面積由13.3%縮小至5.3%，與重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子（rbFGF）陽性對照組（4.0%）相當(dāng)，并且遠(yuǎn)小于正常對照組（22.1%）。同時研究發(fā)現(xiàn)，活性部位能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和遷移，刺激膠原蛋白分泌，促使肉芽組織快速形成。其作用機制與Src介導(dǎo)的MEK/ERK和PI3K/Akt信號通路活化有關(guān)［22］。

接下來，對65%乙醇活性部位中的杠柳苷進(jìn)行了系統(tǒng)地體內(nèi)和體外促傷口愈合活性評估和作用機制闡明。10 μM 的杠柳苷作用48 h 后，能促進(jìn)L929 細(xì)胞增殖、遷移和分泌膠原蛋白，此過程依賴于Src/ERK 和PI3K/Akt通路的激活。與體外結(jié)果一致，在大鼠全層皮膚切除傷口模型中，杠柳苷也表現(xiàn)出顯著的促傷口愈合作用，20 μg·mL-1的杠柳苷（每天給藥1 次，每次200 μL）治療9 天后，相比對照組（34%），其傷口面積縮小至7%。HE 組織病理分析也顯示，給藥后能顯著促進(jìn)傷口再上皮化和肉芽組織形成。已知Na/K-ATPase 和Src 可以通過兩對結(jié)構(gòu)域相互作用組合成一個復(fù)合受體，介導(dǎo)下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了驗證Na/K-ATPase 在杠柳苷介導(dǎo)的傷口愈合中的調(diào)控作用，選擇性地對Na/K-ATPase α1亞基進(jìn)行敲減。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在敲減Na/K-ATPase α1亞基后，杠柳苷無法有效激活Src/ERK 和PI3K/Akt信號通路，促增殖作用也顯著減弱。因此我們推測，杠柳苷促傷口愈合作用是由Na/K-ATPase 介導(dǎo)的Src/ERK和PI3K/Akt通路活化所介導(dǎo)。此外，杠柳苷能降低單核細(xì)胞炎癥浸潤，降低創(chuàng)面組織中IL-1β、TNF-α 水平，表現(xiàn)出一定的抗炎作用。由于劇烈的炎癥反應(yīng)不利于創(chuàng)面愈合，所以其抗炎活性也可能對傷口愈合起到一定的作用［23］。WANG X Y 等［24］檢測了杠柳苷對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用，MTT和BrdU摻入實驗均顯示，杠柳苷能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，進(jìn)而有利于血管新生。而血管新生對于傷口肉芽組織形成是一個至關(guān)重要的步驟。

4.3 抗腫瘤現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黑骨藤尤其是其中的強心苷類成分具有顯著的抗腫瘤作用。LI Y等［5］從黑骨藤莖中分離出一系列強心苷成分，活性篩選結(jié)果顯示，這些強心苷類成分對5 種不同的人癌 細(xì) 胞 株（HCT-8，大 腸 癌；BEL-7402，肝 癌；BGC823，胃癌；A549，肺癌；A2780，卵巢癌）具有顯著的細(xì)胞毒性，IC50值范圍為0.06～6.52 μM。阿霉素作為陽性對照，對于不同的細(xì)胞株，其IC50值為0.13～0.66 μM。其中Periforoside E 對5種人癌細(xì)胞系的活性最為顯著，其IC50值僅為0.06～0.29 μM。

通過對化合物的結(jié)構(gòu)特征和抗腫瘤活性進(jìn)行比較，初步總結(jié)其構(gòu)效關(guān)系。首先，糖苷元的活性比C-3 位糖鏈的強心苷低約10～100 倍，表明C-3 位的親水基團(tuán)對細(xì)胞毒活性至關(guān)重要。其次，以烯烴＞環(huán)氧＞8-羥基＞7-羥基順序取代C-7 和C-8 后，其細(xì)胞毒活性依次下降。第三，C/D 環(huán)結(jié)構(gòu)和C-14 羥基在細(xì)胞毒活性中起重要作用。同時，他們也推測強心苷類成分抗腫瘤機制與Na/K-ATP酶結(jié)合有關(guān)，通過相互作用促發(fā)一系列分子生物學(xué)事件和蛋白激酶活化，如Src、EGFR和p42/44絲裂原活化蛋白激酶活化，線粒體活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）增加，最終通過細(xì)胞凋亡或自噬相關(guān)機制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡［5］。XIE J X 等［19］已對該假設(shè)進(jìn)行了廣泛論證，并認(rèn)為強心苷可能作為一種新型抗腫瘤藥物，通過靶向調(diào)節(jié)Na/K-ATP酶及其相關(guān)信號通路對腫瘤進(jìn)行殺傷。

此外，杠柳苷孵育24～48 h后， 對胃癌細(xì)胞表現(xiàn)出劑量依賴性的抑制作用，并能通過ERK1/2-EGR1通路誘導(dǎo)其凋亡［25］。50～200 ng·mL-1的杠柳苷單獨使用或與TRAIL 合用均能誘導(dǎo)ESCC 細(xì)胞凋亡。其機制可能是下調(diào)FoxP3，促進(jìn)DR4/DR5 的表達(dá)，使ESCC 細(xì)胞對TRAIL 更加敏感，發(fā)揮協(xié)同作用［26］。杠柳苷元（Periplogenin）在體外對HaCaT 細(xì)胞具有選擇性的細(xì)胞毒作用（IC50=1.56 μg·mL-1），在體內(nèi)具有抗銀屑病的作用。其作用機制與ROS 介導(dǎo)的HaCaT 細(xì) 胞 漸 進(jìn) 性 壞 死（Necrobiotic cell death）有關(guān)［27］。

4.4 強心作用強心苷是Na/K-ATPase 的常見配體，在心肌細(xì)胞收縮中起重要作用。但迄今為止關(guān)于黑骨藤中強心苷對Na/K-ATPase 及心肌細(xì)胞收縮的影響研究仍較少。近來，一項研究評估了黑骨藤正丁醇部位對大劑量阿霉素所致大鼠急性心力衰竭的保護(hù)作用及其機制。結(jié)果表明，黑骨藤醇提物正丁醇部位對阿霉素所致急性心衰具有顯著的預(yù)防作用，可能是由于黑骨藤醇提物正丁醇部位中強心苷類成分含量過低，其對心肌細(xì)胞Na/K-ATPase 酶無明顯影響［28］。另一項研究［29］揭示了黑骨藤根的乙醇提取物的乙酸乙酯部分對離體青蛙心臟的強心作用。分別用1.74 mg·mL-1和3.48 mg·mL-1劑量的乙酸乙酯部分灌注離體青蛙心臟，與正常對照組相比，使用醋酸乙酯部分治療后心肌平均收縮力明顯下降，但對心率無明顯影響。隨著細(xì)胞外Ca2+濃度的增加，乙酸乙酯部分對離體青蛙心臟收縮的抑制作用也逐漸增強。乙酸乙酯部分能抑制離體青蛙心臟的收縮活性，并有一定的負(fù)性肌力作用，但不影響心臟組織中Na/K-ATPase 的活性。其機制可能與Ca2+-Mg2+-ATPase 活性的增加、AChE 活性的抑制、細(xì)胞膜鈣通道的阻斷以及M 受體的激活和β 受體的阻斷有關(guān)［29］。

5 藥物分析

5.1 定性分析CHEN L 等［6］建立了一個HPLCQTOF-MS/MS 液質(zhì)聯(lián)用方法，對黑骨藤總提物進(jìn)行了化學(xué)表征和鑒定。通過標(biāo)準(zhǔn)品和文獻(xiàn)信息對比精確分子量、相應(yīng)碎片離子和保留時間，最后一共從黑骨藤中分析鑒定了38 個化合物，其中14 個強心苷或苷元、8個酚酸類、10個三萜類、2個甾體和其他成分。LI Y 等［9］通過液質(zhì)連用（HPLC-DAD/ESI-MSn）和液核連用（HPLC/NMR）實現(xiàn)了對黑骨藤中微量強心苷的在線分析。首先對分離得到的9個強心苷進(jìn)行質(zhì)譜裂解規(guī)律總結(jié)和關(guān)鍵核磁信號分析，然后將所總結(jié)的規(guī)律應(yīng)用于鑒定結(jié)構(gòu)相似的其他強心苷類成分。最后，通過精確分子質(zhì)量、代表性碎片離子和特征性的1H NMR 信號，從黑骨藤中一共鑒定了9 個微量強心苷類化合物。其中1 個化合物首次在黑骨藤中報道，另外8個均為新化合物。

5.2 定量分析強心苷是黑骨藤中一類非常重要的代表性成分，因此目前國內(nèi)外學(xué)者主要以強心苷作為指標(biāo)性成分來建立相應(yīng)的定量分析方法，從而對黑骨藤及相應(yīng)中成藥進(jìn)行質(zhì)量控制和評價。張宏等［30］以乙腈-水（27∶73）作為流動相，檢測波長221 nm，通過高效液相色譜法對不同產(chǎn)地黑骨藤中杠柳苷含量進(jìn)行分析。徐宏等［31］以乙腈-水作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長214 nm，通過反相高效液相色譜法對黑骨藤中的滇杠柳苷Ⅰ進(jìn)行含量測定。強心苷的紫外吸收主要來自五元不飽和內(nèi)酯環(huán)，其吸收強度弱，最大吸收波長在217 nm 左右。因此，由于信號響應(yīng)弱、低分辨率和嚴(yán)重的基線漂移，使用HPLC 對中藥復(fù)雜體系中多種強心苷類成分同時進(jìn)行定量分析也就顯得尤為困難。為此，CHEN L 等［6］建立了LC-MS液質(zhì)聯(lián)用方法，對黑骨藤中杠柳苷（Periplocin）、杠柳次苷（Periplocymarin）和杠柳苷元（Periplogenin）進(jìn)行含量測定，結(jié)果分別為（4 243.79±182.17） μg·g-1，（72.77±0.67） μg·g-1和（29.98±1.11） μg·g-1。該方法在節(jié)省時間、分辨率和靈敏度等方面具有顯著優(yōu)勢，可用于黑骨藤中多種強心苷類成分含量測定。由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)品，其他一些含量較高的成分，如periforoside Ⅰ，periplogenin 3-O-β-D-glucopyranosyl-β-digitaloside 和periforgenin A-3-O-β-digitoxopyranoside 未能被納入測定，該方法有待進(jìn)一步優(yōu)化。

此外，HE J 等［32］也建立了一個穩(wěn)健的LC-MS 方法，用于杠柳苷及其代謝產(chǎn)物的藥代動力學(xué)研究。大鼠單次以50 mg·kg-1劑量進(jìn)行灌胃給藥。結(jié)果顯示，杠柳苷僅在給藥后幾個時間點內(nèi)被檢測到，兩個代謝產(chǎn)物杠柳次苷和杠柳苷元作為主要成分參與代謝過程。杠柳次苷和杠柳苷元的最大血藥濃度時間（Tmax）在8～10 h 內(nèi)，半衰期（T1/2）分別為8.22 h和13.58 h。該結(jié)果也證實了杠柳苷需要一定的時間才能轉(zhuǎn)化成杠柳次苷和杠柳苷元。

6 毒理作用

黑骨藤在《中華本草》中記載為小毒，肝炎、潰瘍病患者禁服，一日用量不宜超過10 g。過量會出現(xiàn)抽搐甚至死亡。馮劍春等［33］對2014 年11 月至2015 年12 月診斷為黑骨藤相關(guān)性肝損傷22 例患者的一般資料、臨床表現(xiàn)及實驗室檢查采用國際醫(yī)學(xué)科學(xué)組織理事會推薦的藥物性肝損傷分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分型和回顧性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患者中女性（12例）多于男性（10例），平均服藥時間1周至2年，生物化學(xué)指標(biāo)主要表現(xiàn)為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（TBil）、堿性磷酸酶（ALP）及γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）異常。22 例ALT、AST 均增高，19 例TBil 增高，ALP增高13 例，GGT 增高20 例。臨床分型結(jié)果為：肝細(xì)胞損傷型18 例，膽汁淤積型0 例，混合型3 例，未分型1例。1例患者死亡，其余患者最后完全恢復(fù)。田芝奧等［34］也對本院2 年內(nèi)收治的17 例患者進(jìn)行研究，他們年齡均超過58 歲，服用黑骨藤制劑用于治療關(guān)節(jié)疼痛。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，服用黑骨藤制劑后，患者們均出現(xiàn)不同程度的藥物性肝損傷，所有案例在出現(xiàn)中毒癥狀前，均有黑骨藤泡酒服或泡茶喝的病史。根據(jù)臨床特點，黑骨藤所致肝損傷多發(fā)生于服藥后1～4 周，大部分患者在4 個月之內(nèi)。主要表現(xiàn)為急性肝細(xì)胞損傷型。幸運的是，在停止用藥并接受適當(dāng)治療后，他們都能較好的恢復(fù)。

CHEN L 等［18］在小鼠中評價了黑骨藤的急性口服毒性，以4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 g·kg-1劑量灌胃給藥，連續(xù)觀察7天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑骨藤在4 g·kg-1及以下不會引起小鼠死亡，對日?；顒雍腕w重也未見顯著影響。金文淵等［35］評價了黑骨藤不同提取部位的急性毒性，SD 大鼠連續(xù)灌胃給藥7 天（9.75 g·kg-1）。結(jié)果顯示，黑骨藤不同極性部位給藥7 d 后，大鼠未出現(xiàn)死亡，石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位組對肝臟和腎臟生化指標(biāo)均無顯著性影響，水部位組大鼠血清中 的ALP 和BUN 顯著升高，表現(xiàn)出一定的毒性。孫達(dá)等［36］進(jìn)行了杠柳苷單次給藥的毒性研究。結(jié)果顯示，杠柳苷灌胃給藥小鼠 在66、83 和103 mg·kg-1劑 量 下 沒 有 死 亡；在20.65、17.55、14.92、12.68 和10.78 mg·kg-15 個劑量下，杠柳苷腹腔給藥小鼠死亡率分別為100%、70%、60%、10%和0%。杠柳苷灌胃給藥小鼠最大耐受劑量（Maximum tolerance dose，MTD）為103 mg·kg-1；杠柳苷腹腔注射給藥小鼠半數(shù)致死量（LD50）為15.20 mg·kg-1。

總的來說，黑骨藤在傳統(tǒng)醫(yī)籍中被記載為小毒植物，在臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究中，也表現(xiàn)出一定的毒性。但是，只要在適當(dāng)?shù)膭┝恐潞侠碛盟帲捎行П苊馄涠拘?，并取得不錯的臨床效果。在未來研究中，應(yīng)更多關(guān)注其慢性毒性和臨床長期毒性以及毒性物質(zhì)。

7 總結(jié)與展望

現(xiàn)代藥理學(xué)揭示了黑骨藤的多種生物活性，包括抗炎、傷口愈合、抗腫瘤、強心作用等。不僅為傳統(tǒng)用法提供了科學(xué)依據(jù)，也為黑骨藤的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了方向。糖尿病足潰瘍是臨床糖尿病重要并發(fā)癥之一。由于長期高血糖，導(dǎo)致局部出現(xiàn)神經(jīng)和血管病變，氧化應(yīng)激水平升高，多種細(xì)胞因子及生長因子表達(dá)降低，引起慢性炎癥持續(xù)發(fā)生，傷口增殖缺陷，導(dǎo)致難愈合傷口的形成［37］。而黑骨藤一方面具有顯著的抗炎作用，能改善傷口局部炎癥反應(yīng)；另一方面還能增強成纖維細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生，以及促進(jìn)膠原蛋白分泌，加快肉芽組織形成。因此，黑骨藤對糖尿病足潰瘍也表現(xiàn)出了巨大的治療潛力。其中，強心苷類組分可能是其潛在活性成分之一。

關(guān)于作用機制，目前已取得一定的進(jìn)展，但是很多問題仍有待進(jìn)一步闡明。然而，無論對于抗炎、傷口愈合還是抗腫瘤，許多研究都指向一個重要的靶點——Na/K ATPase。其受體功能已被廣泛論證，具有調(diào)節(jié)酪氨酸激酶磷酸化和下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)［19］。由于黑骨藤中存在大量的強心苷成分，我們推測黑骨藤的多種生物學(xué)作用或多或少與Na/K ATPase 有關(guān)。相關(guān)問題值得深入研究，并有賴于分子生物學(xué)和代謝組學(xué)等相關(guān)學(xué)科的交叉應(yīng)用。

目前，人們對黑骨藤已進(jìn)行了大量的定性和定量分析。然而，中國藥典未收載任何黑骨藤及其相關(guān)制劑的定性和定量方法［38］。當(dāng)前，黑骨藤生藥的鑒定還主要依賴于性狀鑒別和理化鑒別［39-40］。因此開發(fā)建立相應(yīng)的定性和定量方法是當(dāng)下一項迫切的任務(wù)。隨著LC-MS 技術(shù)的不斷普及，該技術(shù)也將逐漸成為中藥復(fù)雜體系定性定量分析的重要手段。

本綜述系統(tǒng)介紹了黑骨藤的傳統(tǒng)用法、藥物分析方法和毒理學(xué)研究，重點總結(jié)了其中所含的強心苷成分和相關(guān)藥理作用研究進(jìn)展，并將傳統(tǒng)用法和現(xiàn)代藥理活性、強心苷成分做了適當(dāng)關(guān)聯(lián)，為黑骨藤的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論參考。