不同生長(zhǎng)年限云南重樓藥材質(zhì)量比較研究△

王璇，賈天穎，珍桑拉姆，徐文娟，李春帥，楊琳琳，張姝妍，文佳，程水清，王旭星，徐新房，李向日*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院/北京市中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102488；

2.北京市同仁堂股份有限公司 同仁堂制藥廠，北京 102629

百合科植物云南重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.為《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020年版規(guī)定的中藥重樓基原之一[1]，以根莖入藥，味苦，性微寒，有小毒，歸肝經(jīng)，具有清熱解毒、消腫止痛、止血等作用，能夠治療蛇蟲(chóng)咬傷、跌打損傷、驚風(fēng)抽搐等[2]。其含有甾體皂苷、黃酮、植物甾醇及植物蛻皮激素等多種化學(xué)成分[3]，其中甾體皂苷類為主要活性成分[4]，以薯蕷皂苷類、偏諾皂苷類和原型皂苷類為主，約占化合物總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%[5]?，F(xiàn)代研究表明，薯蕷皂苷在抗腫瘤、抗感染、調(diào)血脂、降血糖等方面有良好的藥理活性[6]；偏諾皂苷則在鎮(zhèn)痛、抗炎等方面療效突出[7]。在《中國(guó)藥典》2020 年版中將薯蕷皂苷類的重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ及偏諾皂苷類的重樓皂苷Ⅶ作為重樓質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，規(guī)定其總量不得少于0.60%[8]。

近年來(lái)，隨著市場(chǎng)對(duì)重樓藥材需求量的增加，其價(jià)格突飛猛漲，刺激了藥農(nóng)采挖的積極性，野生重樓資源已呈瀕臨滅絕之勢(shì)[9]。為緩解重樓資源緊張問(wèn)題，云南重樓的人工栽培規(guī)模不斷擴(kuò)大[10]。然而，因其為多年生草本植物，種子休眠期長(zhǎng)，生長(zhǎng)周期緩慢，種植者為保證藥材質(zhì)量，往往需要栽培數(shù)年。為保證重樓藥材質(zhì)量和種植者利益，科學(xué)選擇種植年限尤為重要。本研究依據(jù)課題組前期建立方法[11]，對(duì)不同生長(zhǎng)年限云南重樓的外觀性狀、浸出物及9 種重樓皂苷的含量進(jìn)行比較，旨在為云南重樓種植年限選擇和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 樣品

于2017 年在云南省會(huì)澤縣駕車鄉(xiāng)采集4 年生、5 年生、6 年生、7 年生、8 年生云南重樓各3 批，樣品信息見(jiàn)表1，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所李恒研究員鑒定為百合科植物云南重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.的干燥根莖，標(biāo)本藏于云南省藥物研究所。

表1 云南重樓藥材樣品信息

1.2 儀器

2695 型高效液相色譜儀（包括2489 型紫外檢測(cè)器，美國(guó)Waters 公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA-1004 型電子分析天平（上海天平儀器廠）；PL2002 型電子天平（梅特勒-托科多儀器有限公司）。

1.3 試藥

對(duì)照品重樓皂苷Ⅰ（批號(hào)：111590-201604，純度：93.6%）、重樓皂苷Ⅱ（批號(hào)：111591-201604，純度：91.4%）、重樓皂苷Ⅵ（批號(hào)：111592-201604，純度：97.0%）、重樓皂苷Ⅶ（批號(hào)：111593-201604，純度：94.0%）、薯蕷皂苷（即重樓皂苷Ⅳ，批號(hào)：111707-201703，純度：96.1%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品纖細(xì)薯蕷皂苷（即重樓皂苷Ⅲ，批號(hào)：CF0227QC14，純度：98%）、重樓皂苷Ⅴ（批號(hào)：Y19F7H9835，純度：98%）、重樓皂苷H（批號(hào)：C12A8G33615，純度：98%）均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；對(duì)照品重樓皂苷D（批號(hào)：16063003，純度：97%，成都普菲德生物科技有限公司）；乙腈（色譜級(jí)，美國(guó)Fisher 公司）；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 性狀鑒別

按《中國(guó)藥典》2020 年版（一部）“重樓”項(xiàng)下方法[1]對(duì)云南重樓藥材的表皮顏色、斷面顏色、質(zhì)地進(jìn)行鑒別，同時(shí)測(cè)定藥材的單個(gè)質(zhì)量。

2.2 浸出物測(cè)定

按參考文獻(xiàn)[11]方法測(cè)定藥材浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.3 含量測(cè)定

按參考文獻(xiàn)[12]方法測(cè)定云南重樓樣品中重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷Ⅳ、重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷D和重樓皂苷H的含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 25軟件對(duì)云南重樓生長(zhǎng)年限與薯蕷皂苷、偏諾皂苷、總皂苷含量進(jìn)行相關(guān)性分析；組間比較采用單因素方差分析，運(yùn)用GraphPad Prism 5軟件對(duì)藥材的薯蕷皂苷（重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷Ⅳ、重樓皂苷Ⅴ）、偏諾皂苷（重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷D、重樓皂苷H）及總皂苷含量進(jìn)行分析；采用SⅠMCA 13軟件進(jìn)行主成分分析（PCA），考察不同年限云南重樓與不同種類皂苷含量間的關(guān)系。

3 結(jié)果

3.1 性狀鑒別

3.1.1外觀性狀 4 年生云南重樓樣品過(guò)小，長(zhǎng)度不符合《中國(guó)藥典》2020 年版標(biāo)準(zhǔn)，5 年及以上云南重樓樣品性狀基本符合《中國(guó)藥典》2020 年版要求。5 年及以上云南重樓樣品藥材表面特征較為明顯，可見(jiàn)層狀突起的粗環(huán)紋，一面結(jié)節(jié)明顯，結(jié)節(jié)上可見(jiàn)橢圓形凹陷莖痕，另一面有疏生的須根或疣狀須根痕，頂端具鱗葉和莖的殘基；云南重樓表皮多為黃棕色，斷面多為白色至乳黃色，均呈粉質(zhì)。不同生長(zhǎng)年限云南重樓藥材外觀性狀明顯，差異多體現(xiàn)在長(zhǎng)度和直徑，隨著生長(zhǎng)年限的增長(zhǎng)，云南重樓的長(zhǎng)度、直徑均明顯增長(zhǎng)。同時(shí)，隨著生長(zhǎng)年限的增加，藥材性狀差異逐漸變大，7 年生、8 年生云南重樓性狀更接近拳狀。不同生長(zhǎng)年限云南重樓藥材外觀性狀見(jiàn)圖1。

圖1 不同生長(zhǎng)年限云南重樓藥材外觀性狀

3.1.2單個(gè)質(zhì)量 云南重樓單個(gè)質(zhì)量一定程度上可以反映藥材的質(zhì)量，如表2 所示，云南重樓藥材質(zhì)量隨生長(zhǎng)年限的增長(zhǎng)而增加，8 年生云南重樓藥材質(zhì)量最大。

3.2 浸出物

不同生長(zhǎng)年限云南重樓藥材浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)見(jiàn)表2。其中，8 年生樣品的醇溶性浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。

表2 不同生長(zhǎng)年限云南重樓藥材單個(gè)質(zhì)量、浸出物測(cè)定結(jié)果

3.3 含量測(cè)定

對(duì)9 種重樓皂苷類成分含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。由測(cè)定結(jié)果可知，隨著生長(zhǎng)年限增加，云南重樓藥材9 種重樓皂苷的含量發(fā)生不同程度的變化。其中，重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ的含量隨生長(zhǎng)年限增長(zhǎng)而增加的趨勢(shì)較明顯，且在7年生藥材中含量最高。藥材中9種重樓皂苷含量個(gè)體差異較明顯，所含皂苷以薯蕷皂苷為主。薯蕷皂苷類含量（如重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ）隨生長(zhǎng)年限增長(zhǎng)而增加，而偏諾皂苷含量隨年限增長(zhǎng)未發(fā)現(xiàn)明顯變化規(guī)律。從9 種重樓皂苷含量來(lái)看，云南重樓的薯蕷皂苷及總皂苷含量以7 年生含量為最高。根據(jù)薯蕷皂苷、偏諾皂苷及總皂苷的含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行PCA，結(jié)果見(jiàn)圖2。數(shù)據(jù)顯示，可將不同年限藥材分為2 類，其中7 年生、8年生為一類，4年生、5年生、6年生為一類，提示7 年生、8 年生藥材較其他生長(zhǎng)年限藥材在有效成分含量上存在較大差異?！吨袊?guó)藥典》2020 年版“重樓”項(xiàng)下規(guī)定，重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ和重樓皂苷Ⅶ的總量不得少于0.60%[1]，而本研究結(jié)果顯示，7 年生、8 年生樣品均達(dá)到規(guī)定，6 年生樣品1 批未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，而4年生、5年生樣品均不合格。

圖2 不同生長(zhǎng)年限云南重樓PCA圖

表3 云南重樓樣品中重樓皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（n=4）

3.4 統(tǒng)計(jì)分析

3.4.1相關(guān)性分析 采用SPSS 25軟件對(duì)生長(zhǎng)年限與薯蕷皂苷、偏諾皂苷、總皂苷含量間進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表4。雙變量Pearson檢驗(yàn)結(jié)果顯示，生長(zhǎng)年限與薯蕷皂苷、總皂苷含量均呈正相關(guān)（r1=0.645，P=0.009＜0.01；r2=0.668，P=0.007＜0.01），適宜采用多元統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行進(jìn)一步分析。

表4 云南重樓生長(zhǎng)年限與3類皂苷含量的相關(guān)性分析

3.4.2PCA 采用SⅠMCA 13 統(tǒng)計(jì)軟件，基于薯蕷皂苷、偏諾皂苷、總皂苷的含量測(cè)定結(jié)果對(duì)不同年限的云南重樓藥材進(jìn)行PCA，結(jié)果見(jiàn)圖2。正交偏最小二乘-判別分析法（OPLS-DA）分析結(jié)果顯示，不同年限的云南重樓藥材可明顯分為2類，其中7年生、8 年生為一類，4年、5年、6年生為一類，說(shuō)明根據(jù)薯蕷皂苷、偏諾皂苷、總皂苷含量可以很好地區(qū)分不同生長(zhǎng)年限的云南重樓藥材，且7年生、8年生藥材的質(zhì)量較好。

綜上可知，從外觀性狀、浸出物、有效成分含量來(lái)看，生長(zhǎng)年限對(duì)云南重樓的質(zhì)量有較大影響，隨著生長(zhǎng)年限的增加，云南重樓藥材外觀性狀發(fā)生明顯變化，單個(gè)質(zhì)量、浸出物均明顯增長(zhǎng)，各種有效成分含量也發(fā)生一定程度的規(guī)律性變化。其中，7 年生、8年生藥材有效成分含量差異較小，考慮到種植者的收益，經(jīng)各項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)得出結(jié)論，建議云南重樓藥材的栽培年限為7年。

4 討論

生長(zhǎng)年限是影響云南重樓藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素，種植年限不同往往會(huì)直接導(dǎo)致藥材外觀性狀、浸出物及有效成分含量存在較大差異。本研究發(fā)現(xiàn)，于外觀性狀而言，4 年生藥材長(zhǎng)度過(guò)小，5 年生及以上藥材才能達(dá)到《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定；8 年生藥材浸出物含量高于其余生長(zhǎng)年限，提示生長(zhǎng)年限的增加有助于有效成分的積累，使浸出物含量增加。值得一提的是，本研究所收集的云南重樓即使是相同生長(zhǎng)年限，其浸出物含量仍存在較大差異，所得數(shù)據(jù)暫未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能是由于樣品產(chǎn)地不同，個(gè)體差異較大所致，其具體原因值得課題組后續(xù)深入研究。與此同時(shí)，隨著生長(zhǎng)年限的增加，9 種重樓皂苷含量也會(huì)發(fā)生較大變化，7年生、8 年生藥材較其他年生藥材存在明顯差異。以上結(jié)果均說(shuō)明，種植年限是藥材質(zhì)量的重要影響因素，科學(xué)合理選擇種植年限是保證云南重樓藥材質(zhì)量的關(guān)鍵。

隨著臨床需求不斷增大和藥農(nóng)長(zhǎng)期掠奪式采挖，目前很多中藥面臨野生資源匱乏不能滿足藥用的問(wèn)題，尤其是以多年生藥用植物的根及根莖部位入藥的藥材，如防風(fēng)、三七、白芍等[13]，故多地進(jìn)行了各類藥材的人工栽培研究。雖然人工栽培是緩解野生資源壓力的有效途徑[14]，但在栽培過(guò)程中遵從科學(xué)的種植方法、保證藥材質(zhì)量尤為重要。本研究采用傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別結(jié)合9 種重樓皂苷含量測(cè)定的方法對(duì)不同生長(zhǎng)年限云南重樓藥材質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，提出藥材種植年限的合理建議，從而在提高云南重樓藥材產(chǎn)量的同時(shí)保證藥材質(zhì)量，為中醫(yī)臨床安全有效用藥提供保障。