北京地區(qū)一種菘藍(lán)白粉病病原菌的鑒定△

王紓琪，劉燕敏，王蓉，丁萬(wàn)隆，李勇

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

菘藍(lán)Isatis indigoticaFort.為十字花科菘藍(lán)屬草本藥用植物，其干燥根為板藍(lán)根，是我國(guó)常用大宗中藥材[1]。板藍(lán)根味苦，性寒，歸心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、涼血利咽等功效[2]。研究發(fā)現(xiàn)，其含多種抗菌、抗病毒成分，可增強(qiáng)機(jī)體免疫力[3]。以板藍(lán)根為主要原料的復(fù)方板藍(lán)根顆粒、板藍(lán)根軟膠囊等常用于治療流行性感冒、流行性乙型腦炎、腮腺炎、肝炎等疾病[1,4]。菘藍(lán)在我國(guó)河北、河南、安徽、陜西、甘肅、內(nèi)蒙古、山東、浙江、黑龍江等省份均有大面積栽培，湖北、山西、遼寧、北京、上海、四川、新疆等地也有少量栽培[5]。人工栽培易受氣候及栽培管理模式影響，根腐病、霜霉病、白粉病等在菘藍(lán)各產(chǎn)區(qū)時(shí)有發(fā)生[6]。

2021 年8—10 月，北京地區(qū)降雨頻繁，田間持續(xù)低溫、高濕導(dǎo)致中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所試驗(yàn)地種植的菘藍(lán)暴發(fā)白粉病，平均發(fā)病率高達(dá)30%，對(duì)其生長(zhǎng)及產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響。查閱文獻(xiàn)，僅發(fā)現(xiàn)關(guān)于新疆烏魯木齊菘藍(lán)白粉菌的形態(tài)描述[7]。我國(guó)各省份菘藍(lán)產(chǎn)區(qū)雖然也有白粉病發(fā)生，但未見(jiàn)相關(guān)病原菌研究報(bào)道。不同地域種植的菘藍(lán)白粉病菌是否一致目前尚不清楚。為此，筆者于2021 年采集菘藍(lán)白粉病樣品，結(jié)合形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法，對(duì)菘藍(lán)白粉病病原進(jìn)行鑒定，以期為菘藍(lán)白粉病防控提供參考。

1 材料

1.1 病原菌樣本

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所試驗(yàn)地（E116°16'41.30″，N40°2'5.52″）種植的1 年生菘藍(lán)，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所丁萬(wàn)隆研究員鑒定為菘藍(lán)Isatis indigoticaFort.。2021 年10 月，在菘藍(lán)白粉病葉片上收集白粉菌。采樣前將無(wú)菌稱(chēng)量紙平鋪于葉片下方，手指輕彈將葉片上附著的白粉菌振落，轉(zhuǎn)入2 mL無(wú)菌離心管，備用。

1.2 儀器

XSP-12CA 型生物顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠(chǎng)）；T100 型熱循環(huán)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司）；京N9548R型自動(dòng)研磨機(jī)（北京赫得科技有限公司）；DYY-6C 型電泳儀（北京市六一儀器廠(chǎng)）。

1.3 試藥

TaqDNA 聚合酶（日本TaKaRa 公司）；真菌基因組DNA 提取試劑盒（美國(guó)Omega 公司）；DNA凝膠回收試劑盒（北京匯天東方生物技術(shù)有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 田間癥狀觀(guān)察

田間觀(guān)察菘藍(lán)白粉病的發(fā)病部位、發(fā)病規(guī)律及病斑顏色、大小、形狀等。

2.2 病原菌形態(tài)特征觀(guān)察

采用粘貼法[8]從新鮮病組織上粘取少量菌絲，無(wú)菌水作為浮載劑，顯微鏡下觀(guān)察白粉菌的菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子及其著生方式等，拍照記錄。

2.3 病原菌分子鑒定

稱(chēng)取菘藍(lán)白粉菌約0.1 g，液氮冷卻條件下振蕩研磨60 s，真菌基因組DNA 提取試劑盒提取白粉菌基因組DNA。引物內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ⅠTS1，5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）/PM6（5'-GYCRCYCTGTCGCGAG-3'）用于白粉菌rDNA-ⅠTS 區(qū)段擴(kuò)增[9]。擴(kuò)增體系25 μL，包括：5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.2 μL、10×PCR buffer（100 mmol·L-1Tris、500 mmol·L-1KCl、2 mmol·L-1Mg2+）2.5 μL、dNTP（2.5 mmol·L-1）1 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL、模板DNA（約20 ng·μL-1）3 μL、ddH2O 16.3 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后，送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。經(jīng)與GenBank 中同源序列進(jìn)行Blast 比對(duì)，選取核酸序列一致性較高的菌株用MegaX 軟件中的鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。用于檢驗(yàn)支持率的重復(fù)抽樣數(shù)為1000次。

3 結(jié)果

3.1 菘藍(lán)白粉病田間癥狀

菘藍(lán)白粉病易在持續(xù)高濕的多雨季節(jié)發(fā)生，每年7 月上旬至10 月上旬高發(fā)，多見(jiàn)于葉片及葉柄部位。白粉病自靠近地表的下層葉片開(kāi)始侵染，然后自下層葉片向上層葉片傳播。發(fā)病早期，菘藍(lán)葉片正面出現(xiàn)多個(gè)不規(guī)則形褪綠病斑，中心淺褐色，外緣白色，病斑上菌絲稀疏，白色（圖1A）；條件適宜時(shí)，菌絲放射狀生長(zhǎng)，相鄰病斑相互融合，形成不規(guī)則形菌絲層（圖1B）；末期，病株葉片布滿(mǎn)白色粉狀霉層，病葉變?yōu)楹稚▓D1C）；最終葉片干枯死亡（圖1D）。

圖1 菘藍(lán)白粉病田間癥狀

3.2 病原菌形態(tài)特征

病菌菌絲直或略彎，寬5～7 μm，上有淺裂葉狀附著胞（圖2A）。分生孢子梗直立或微彎，不分枝，75～124 μm×8～14 μm，頂端串生分生孢子（圖2B）。分生孢子長(zhǎng)橢圓形或近圓柱形，34～47 μm×12～19 μm（圖2C）。芽管在分生孢子近端處萌發(fā)，直或彎曲，芽管頂端有吸器（圖2D）。無(wú)性世代形態(tài)特征與白粉菌目（Erysiphales）白粉菌科（Erysiphaceae）白粉菌屬（Erysiphe）相關(guān)描述一致[10]。由于未發(fā)現(xiàn)該病原菌的有性世代，僅通過(guò)無(wú)性世代形態(tài)特征難以對(duì)該病菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，初步推測(cè)其可能屬于白粉菌屬。

圖2 菘藍(lán)白粉菌顯微形態(tài)特征

3.3 病原菌rDNA ⅠTS序列分析

經(jīng)白粉菌特異引物擴(kuò)增，獲得1 條長(zhǎng)496 bp 的條帶（GenBank登錄號(hào)：OL884216）。Blast分析結(jié)果表明，菘藍(lán)白粉菌特異引物擴(kuò)增序列與十字花科白粉菌Erysiphe cruciferarum（GenBank 登錄號(hào)分別為MT309701、MK341128、MF192845、KY660929）的序列同源性為100%。從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBⅠ）數(shù)據(jù)庫(kù)選取同源性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，供試菘藍(lán)白粉菌與十字花科白粉菌聚在同一分枝，與其他白粉菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3）。結(jié)合對(duì)病菌形態(tài)鑒定的初步推測(cè)，最終將其鑒定為十字花科白粉菌。

圖3 基于rDNA ITS序列構(gòu)建的菘藍(lán)白粉菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

4 討論

白粉病菌屬于子囊菌門(mén)（Ascomycota）白粉菌目（Erysiphales）白粉菌科（Erysiphaceae），為高等植物專(zhuān)性寄生病原真菌。其家族成員眾多，根據(jù)新分類(lèi)系統(tǒng)，至少包括15 屬650 余種[10-11]。白粉病菌的寄主范圍、專(zhuān)化性、有性及無(wú)性階段孢子及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征一直是白粉菌分類(lèi)鑒定的重要依據(jù)[12-13]。然而，有時(shí)采集到的病菌僅有無(wú)性世代，這無(wú)疑給病菌鑒定工作帶來(lái)困擾。分子生物學(xué)方法為解決該問(wèn)題提供了新途徑。真菌rDNA-ⅠTS 序列在真菌種內(nèi)既有高度的保守性，又存在豐富的種屬間變異。根據(jù)此特性，可利用專(zhuān)用引物擴(kuò)增白粉菌基因組ⅠTS 區(qū)段，結(jié)合核酸序列同源性分析，將此作為白粉菌屬病原分類(lèi)鑒定的輔助參考依據(jù)[14-16]。

十字花科白粉菌寄主廣泛，可侵染十字花科蕓薹屬芥菜Brassica juncea（L.）Czern.、雪里蕻B.junceavar.multicepsTsen et Lee、榨菜B.junceavar.tumidaTsen et Lee、甘藍(lán)B.oleraceavar.capitataL.、卷 心 菜B.oleraceavar.capitataL.、油 菜B.campestrisL.、青菜B.chinensisL.、大頭菜B.junceavar.megarrhizaTsen et Lee、白菜B.pekinensisRupr.、蔓菁B.rapaL.、蕪菁B.rapaL.，獨(dú)行菜屬獨(dú)行菜Lepidium apetalumWilld.、寬葉獨(dú)行菜L.latifoliumL.、柱毛獨(dú)行菜L.ruderaleL.，芝麻菜屬芝麻菜Eruca vesicariasubsp.sativa（Mill.）Thell.、蕓 芥E.vesicaria（L.）Cav.subsp.sativa（Mill）Thellung，諸葛菜屬二月蘭Orychophragmus violaceus（L.）O.E.Schulz，播娘蒿屬播娘蒿Descurainia sophia（L.）Webb.ex Prantl、菘藍(lán)屬歐洲菘藍(lán)Isatis tinctoriaL.等多種植物[17-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，侵染北京地區(qū)菘藍(lán)的白粉病菌為十字花科白粉菌，這與前人描述基本一致[7]。上述研究結(jié)果表明，除歐洲菘藍(lán)外，菘藍(lán)也是該病菌的一個(gè)重要寄主。

白粉病是板藍(lán)根生產(chǎn)上的主要病害之一。每年環(huán)境條件適宜時(shí)，白粉病在產(chǎn)區(qū)大面積流行，給板藍(lán)根生產(chǎn)造成較大危害。目前，化學(xué)殺菌劑仍是菘藍(lán)白粉病防治的主要手段。由于殺菌劑濫用，菘藍(lán)白粉病菌已對(duì)多種殺菌劑產(chǎn)生抗藥性[26]。針對(duì)該問(wèn)題，一方面應(yīng)篩選高效低毒可替代的化學(xué)殺菌劑，嚴(yán)格控制殺菌劑的使用頻次和劑量，以減緩病菌抗藥性產(chǎn)生；另外，通過(guò)加強(qiáng)田間管理、合理密植及科學(xué)施肥、培育推廣抗病品種等措施，結(jié)合生物防治、物理防治等手段，減少化學(xué)殺菌劑使用的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)菘藍(lán)白粉病害的早期預(yù)防和控制。