酸棗仁對失眠大鼠HPA軸功能的干預(yù)作用研究△

花玥，郭盛，2*，朱悅，朱昭穎，謝紅，陶偉偉，段金廒*

1.南京中醫(yī)藥大學 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點研究室，江蘇 南京 210023

2.中國中藥協(xié)會 藥食同源物質(zhì)評價和利用專業(yè)委員會，北京 100061

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子，具有養(yǎng)心補肝、寧心安神、斂汗、生津之功，常用于虛煩不眠、驚悸多夢、體虛多汗、津傷口渴等證的治療，是中醫(yī)臨床治療失眠癥的常用藥味[1-2]。臨床多以苯二氮?類藥物治療失眠，長期服用易出現(xiàn)成癮性、戒斷性等不良反應(yīng)[3]，而酸棗仁作為中醫(yī)臨床治療失眠的藥食同源類中藥具有安全有效的優(yōu)勢[4]?，F(xiàn)代研究表明，酸棗仁養(yǎng)心安神功效確切，其含有的黃酮類[2]、三萜皂苷類[5]、生物堿類[6]及脂肪酸類等[1]化學成分，均表現(xiàn)出一定防治失眠的作用，但其作用機制有待進一步研究。

現(xiàn)代研究表明，失眠癥的發(fā)生發(fā)展多與下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能紊亂、中樞神經(jīng)遞質(zhì)失衡、炎性反應(yīng)因子釋放、迷走神經(jīng)張力變化、褪黑素系統(tǒng)功能下降、邊緣皮質(zhì)系統(tǒng)環(huán)路功能或結(jié)構(gòu)異常等密切相關(guān)[7-8]。其中，應(yīng)激是導致失眠的重要原因，HPA軸過度興奮和亢進，可表現(xiàn)出促覺醒作用，通過調(diào)節(jié)HPA 軸功能可改善睡眠狀態(tài)從而達到治療失眠癥的效果[9]。因此，調(diào)節(jié)HPA 軸功能亢進已成為近年來治療失眠障礙的新靶標[10]。

本研究選擇腹腔注射對氯苯丙氨酸（PCPA）復(fù)制失眠大鼠模型，在前期考察酸棗仁提取物改善模型動物記憶及認知功能，并調(diào)控其內(nèi)源性代謝網(wǎng)絡(luò)及腸道菌群結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上[10]，選擇與HPA 軸功能相關(guān)的調(diào)節(jié)因子，包括下丘腦分泌的促腎上皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）、垂體分泌的促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、腎上腺分泌的皮質(zhì)酮（CORT）為主要評價指標，結(jié)合動物行為、病理組織及生化指標分析等，評價酸棗仁對HPA 軸的干預(yù)作用，進而探討其防治失眠癥的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）級雄性SD 大鼠30只，體質(zhì)量180～220 g，2 月齡，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2017-0005，合格證編號：20170005010252。本實驗經(jīng)南京中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準（倫理學審查批號：201905A029），動物接收后飼養(yǎng)在屏障系統(tǒng)內(nèi)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，每籠3只，自由進食、進水。

1.2 藥物與試劑

酸棗仁飲片（批號：8017002）產(chǎn)自河北邢臺，由南京中醫(yī)藥大學段金廒教授鑒定，為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子。

PCPA（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10438621）；地西泮片（上海上藥信誼藥廠有限公司，批號：14181201）；戊巴比妥鈉（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司，批號：060222）；聚山梨酯-80（Tween-80，批號：20130703，成都市科龍化工試劑廠）；羧甲基纖維素鈉（批號：20191203，天津市科密歐化學試劑有限公司）；4%多聚甲醛（批號：70085400，中國Biosharp公司）。

蘇木精-伊紅（HE）染液試劑盒、免疫組化筆、檸檬酸鈉緩沖液（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號：GA19120085310）均購自北京索萊寶科技有限公司）；中性樹膠、二甲苯、甲醇、乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；MaxVision 試劑盒（兔）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒、耐高溫塑料染色架（福州邁新生物科技有限公司）；蘇木精染色液（南京建成生物工程研究所）；大鼠血清白細胞介素-1β（ⅠL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、CRH、ACTH、CORT、5-羥色胺（5-HT）酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELⅠSA）試劑盒及一氧化氮（NO）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；大鼠組織CRH、ACTH、CORT酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.3 儀器

R-250 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）；ML204、MS105 型電子分析天平（上海Mettler-Toledo 儀器有限公司）；XO25-12DT 型超聲波清洗機（南京先歐儀器制造有限公司）；Tissuelyser-48型全自動樣品快速研磨儀（上海凈信科技）；VX-Ⅱ型多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）；Microfuge 22R Centrifuge 型高速離心機（美國Beckman Coulter 公司）；ST60-4 型微孔板恒溫振蕩器（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；EnSpire 型酶標儀（美國PerkinElmer 公司）；Direct-Q5 純水制備儀（美國Millipore 公司）；DigBehv 型動物分析系統(tǒng)（上海吉量軟件科技有限公司）；THZ-312型臺式恒溫振蕩器（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；101AS-3型電熱鼓風干燥箱（上海圣欣科學儀器有限公司）；BCD-258A/C型冰箱（海爾公司）；BX43型生物倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；E200A 型萬分之一電子分析天平（德安特公司）。

2 方法

2.1 供試藥物的制備

本實驗采用筆者前期開展酸棗仁提取物改善模型動物記憶及認知功能實驗用樣品[11]，其制備方法為將酸棗仁粉碎成粗粉（過二號篩），加2.5 倍量石油醚浸泡1 h 后，回流提取2 次，每次2 h，濾過。濾渣置通風櫥揮干溶劑，得灰白色脫脂藥渣，加8倍量70%乙醇回流提取2 次，每次2 h，濾過，合并濾液，60 ℃減壓濃縮至生藥質(zhì)量濃度4 g·mL-1，得到酸棗仁醇提物。供試藥物均置于-20 ℃冰箱中備用，臨用時稀釋至所需劑量。

2.2 動物分組與模型制備

隨機將30 只大鼠分為5 組，每組6 只，分別為正常組、模型組、地西泮陽性藥組、酸棗仁醇提物高劑量組、酸棗仁醇提物低劑量組。除正常組外，各組大鼠參照文獻[12-13]方法腹腔注射PCPA 混懸液（350 mg·kg-1·d-1，含0.1% Tween-80 的0.9%氯化鈉溶液配制），正常組腹腔注射等劑量的0.9%氯化鈉溶液，體積均為10 mL·kg-1體質(zhì)量，每天1 次，連續(xù)3 d。

2.3 動物給藥

造模同期給藥，地西泮陽性藥組（1 mg·kg-1·d-1）、酸棗仁醇提物高劑量組（20 g·kg-1·d-1）、酸棗仁醇提物低劑量組（5 g·kg-1·d-1）均灌胃對應(yīng)的藥物，共給藥10 d。正常組和模型組灌胃等劑量的水，給藥體積均為10 mL·kg-1。

2.4 曠場實驗

給藥10 d后，檢測大鼠在曠場環(huán)境的活動情況，測試前將動物放入測試房間內(nèi)30 min，以適應(yīng)環(huán)境。測試時輕輕提起尾巴，頭朝前將大鼠放入曠場中使其自由活動。曠場規(guī)格為40 cm×40 cm，側(cè)壁高40 cm，箱體內(nèi)部為黑色。DigBehv 型動物分析系統(tǒng)拍攝記錄大鼠5 min內(nèi)的活動軌跡，檢測大鼠在曠場內(nèi)活動的總路程，中心區(qū)域滯留時間及爬壁情況，用于評價動物焦慮樣行為[14]。

2.5 標本的采集及處理

曠場實驗結(jié)束后禁食12 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1，0.9%氯化鈉溶液配制）進行麻醉。腹主動脈采集血液于負壓管中，靜置30 min，699.3×g離心10 min，分取上層血清，置于-80 ℃冰箱中保存，用于血清生化指標測定[15]。取血后，迅速摘取下丘腦、垂體、腎上腺組織，每組取部分置于4%多聚甲醛組織固定液中，用于組織病理分析，剩余用于組織生化指標測定。

2.6 HPA軸功能分析

2.6.1組織病理分析 對固定在4%多聚甲醛中的下丘腦、垂體、腎上腺組織進行HE染色。經(jīng)無水乙醇脫水，二甲苯透明后，將組織浸入石蠟中包埋，切片烤片，石蠟切片脫蠟，經(jīng)蘇木精、伊紅染色封片后，于400×光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)，每個組織取3 個區(qū)域拍照，用ⅠmageJ 1.8.0 軟件統(tǒng)計每組400×圖片中所有染色細胞的數(shù)量，觀察不同組織細胞數(shù)量在給藥前后的變化。

2.6.2ELⅠSA 分析HPA 軸激素水平 根據(jù)ELⅠSA試劑盒說明書記載的操作方法，測定各組大鼠血清中HPA軸激素（CRH、ACTH、CORT）的含量。稱取適量組織（下丘腦、垂體、腎上腺）于1.5 mL 離心管中，加入鋯珠和一定量的PBS（pH 7.2～7.4），使用全自動樣品快速研磨儀充分勻漿后，離心取上清液，得10%組織勻漿液。采用BCA 試劑盒測定勻漿液蛋白濃度，并按照相應(yīng)ELⅠSA 試劑盒的操作說明，分別測定大鼠組織下丘腦中的CRH、垂體中的ACTH 及腎上腺中的CORT 含量，并以蛋白濃度校正。

2.7 血清ⅠL-1β、TNF-α、NO水平分析

根據(jù)試劑盒說明書描述的操作方法，ELⅠSA 測定各組大鼠血清中ⅠL-1β、TNF-α水平；按NO 試劑盒說明書方法測定血清中NO的含量。

2.8 統(tǒng)計學分析

3 結(jié)果

3.1 模型驗證結(jié)果

造模最后一天禁食12 h后，眼眶取血分取血清，用ELⅠSA 試劑盒測定5-HT 含量。5-HT 是公認參與睡眠-覺醒機制的神經(jīng)遞質(zhì)，而PCPA 是5-HT 拮抗劑，腹腔注射PCPA 能造成晝夜節(jié)律消失，以復(fù)制失眠模型。與正常組比較，模型組大鼠血清中5-HT的含量顯著降低，說明模型復(fù)制成功[16-17]（圖1）。

圖1 正常組與模型組大鼠血清中的5-HT含量（,n=6）

3.2 酸棗仁對大鼠行為的影響

與正常組比較，模型組大鼠晝夜節(jié)律消失，毛發(fā)粗糙無光澤、對刺激敏感、興奮且攻擊性強等行為，表明失眠模型復(fù)制成功。末次給藥后，對失眠大鼠進行曠場實驗，選擇動物曠場內(nèi)活動總路程、中心區(qū)域時間和爬壁情況作為評價指標，其中總路程反映大鼠的運動情況，中央?yún)^(qū)域時間反映大鼠的焦慮情況；爬壁反映大鼠的探究行為。如圖2 所示，在本實驗中，模型組大鼠總路程、中心時間及爬壁均較正常組減少（P＜0.05），給藥酸棗仁提取物后，上述指標均有不同程度回歸正常水平的趨勢。上述結(jié)果表明失眠大鼠有一定的焦慮狀表現(xiàn)，給藥酸棗仁提取物可以改善這些癥狀。

圖2 酸棗仁對失眠模型大鼠曠場實驗活動總路程、中心區(qū)域時間和爬壁情況的影響（,n=6）

3.3 酸棗仁對HPA軸功能的影響

3.3.1酸棗仁對HPA 軸組織病理變化的影響 HE染色結(jié)果如圖3 所示，與正常組比較，模型組大鼠下丘腦中神經(jīng)元數(shù)量減少但差異無統(tǒng)計學意義，而各給藥組均有一定程度的回調(diào)（圖4）。模型大鼠垂體中嗜色細胞數(shù)量較正常組明顯減少，與正常組相比差異有統(tǒng)計學意義，取而代之的是細胞質(zhì)較少、蘇木精著色淺、細胞邊界不清的嫌色細胞，提示模型動物垂體發(fā)生病理改變。給藥酸棗仁后，組織病理改變出現(xiàn)回調(diào)，酸棗仁醇提物高、低劑量組細胞數(shù)量均回調(diào)且差異有統(tǒng)計學意義。模型組大鼠腎上腺中束狀帶和網(wǎng)狀帶細胞均出現(xiàn)體積變大、呈圓形、核染色變淺、核仁清晰可見的病理改變，提示細胞代償性增大，腎上腺分泌功能增強，且造模后細胞數(shù)量與正常組相比顯著減少。酸棗仁給藥組對腎上腺的病理改變均有不同程度的回調(diào)，酸棗仁醇提物高、低劑量組細胞數(shù)量均回調(diào)且差異有統(tǒng)計學意義。

圖3 酸棗仁對失眠模型大鼠下丘腦、垂體、腎上腺組織HE染色的影響（400×）

圖4 酸棗仁對失眠模型大鼠下丘腦、垂體、腎上腺組織HE染色細胞數(shù)量的影響（,n=6）

3.3.2酸棗仁對HPA 軸激素水平的影響 研究結(jié)果（圖5）顯示，失眠模型大鼠血清中的HPA 軸相關(guān)激素CRH、ACTH、CORT 水平較正常組均顯著升高，酸棗仁可不同程度地改善這種變化，其中酸棗仁醇提物低劑量組可顯著降低血清中CRH 水平，酸棗仁醇提物高劑量組可顯著降低血清中ACTH 水平，酸棗仁醇提物高、低劑量組均可降低血清中CORT 水平但無顯著性差異。失眠模型大鼠下丘腦CRH 水平較正常組顯著升高，給藥酸棗仁醇提物高、低劑量均可顯著降低CRH 水平；失眠模型大鼠垂體的ACTH 水平較正常組顯著升高，給藥酸棗仁醇提物高劑量組可顯著降低ACTH 水平；失眠模型大鼠腎上腺的CORT 水平較正常組顯著升高，給藥酸棗仁醇提物高劑量可顯著降低CORT 水平，而酸棗仁醇提物低劑量組差異無統(tǒng)計學意義。

圖5 酸棗仁對失眠模型動物血清和組織HPA軸相關(guān)激素水平的影響（,n=6）

3.4 酸棗仁對血清ⅠL-1β、TNF-α和NO水平的影響

血清生化指標分析結(jié)果（圖6）顯示，失眠模型大鼠血清中NO 含量顯著低于正常大鼠（P＜0.05），炎癥因子ⅠL-1β、TNF-α水平均顯著高于正常大鼠（P＜0.05）。給藥酸棗仁提取物后，血清中ⅠL-1β、TNF-α水平均有顯著降低趨勢（P＜0.05），提示酸棗仁提取物可降低失眠動物的機體炎癥水平，推測酸棗仁可通過降低機體炎癥水平發(fā)揮干預(yù)失眠的作用。

圖6 酸棗仁對失眠模型動物血清生化指標的影響（,n=6）

4 討論

失眠是臨床上最常見的睡眠障礙類型?，F(xiàn)代研究顯示，PCPA 是一種色氨酸羥化酶（TPH）抑制劑，可選擇性抑制TPH，進而阻斷5-HT 的合成[16]，常被用于腹腔注射建立睡眠剝奪動物模型，進而研究催眠藥物的藥理作用機制，但鑒于實驗動物的個體差異，睡眠剝奪效果不易掌控[17]。

本研究采用腹腔注射PCPA 混懸液3 d，通過觀察失眠大鼠造模后行為驗證失眠模型復(fù)制的成功與否。模型復(fù)制期間，失眠大鼠表現(xiàn)出對刺激敏感、暴躁且攻擊性強等行為特征，曠場實驗表明失眠大鼠存在一定焦慮狀表現(xiàn)。在模型建立和分組的基礎(chǔ)上，對失眠大鼠的行為、病理切片及生化指標等進行分析，以探討失眠大鼠的生化指標異常及酸棗仁對失眠大鼠的調(diào)節(jié)作用。給藥不同劑量酸棗仁提取物后，失眠大鼠的焦慮樣行為一定程度得到改善，攻擊性減弱。

現(xiàn)代研究表明，HPA 軸在維持警覺和調(diào)節(jié)睡眠中起重要作用[18]，HPA 軸主要由下丘腦、垂體和腎上腺三部分組成，HPA 軸功能紊亂均會影響睡眠，其致病機制為下丘腦釋放CRH，CRH 作用于垂體后使其釋放ACTH，ACTH 通過體循環(huán)作用于腎上腺皮質(zhì)，使其釋放糖皮質(zhì)激素和CORT[19]。過量的CRH 導致垂體ACTH 分泌增加，進而增加CORT 的分泌，最終造成糖皮質(zhì)激素分泌過多，過量的糖皮質(zhì)激素不能有效抑制HPA 軸的活性，使其形成惡性循環(huán)而引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)[20]。糖皮質(zhì)激素作為HPA 軸的最終產(chǎn)物，會導致覺醒及失眠，睡眠對應(yīng)激系統(tǒng)有抑制作用[21-22]。

HPA 軸亢進會導致睡眠障礙，當應(yīng)激等因素使HPA 軸功能亢進時，機體出現(xiàn)非快速眼動（NREM）睡眠減少，快速眼動（REM）睡眠增多[23]。失眠患者血清CRH 較正常人水平升高，疲勞、疼痛、焦慮等癥狀均可作為壓力源引起CRH分泌，CRH可引起非壓力或壓力性的覺醒，CRH 還可減少促進睡眠的生長激素分泌[24]。ACTH 能夠提高大腦皮質(zhì)的應(yīng)激性，是睡眠-覺醒調(diào)控機制中的重要組成。應(yīng)激狀態(tài)下，ACTH 濃度會隨之升高，但應(yīng)激長時間持續(xù)，則可能使機體調(diào)節(jié)能力減弱，進而出現(xiàn)HPA 軸功能減退[25]。CORT 被稱為“應(yīng)激性激素”，目前被認為是應(yīng)激反應(yīng)經(jīng)典指標，CORT 水平升高，影響機體物質(zhì)吸收及新陳代謝，進而出現(xiàn)失眠癥狀。有文獻表明，中老年慢性失眠患者有HPA 軸相關(guān)的內(nèi)分泌失衡，表現(xiàn)為總睡眠時間＜5 h 時，CORT 水平明顯增高，CORT 和ACTH 水平與總睡眠時間呈負相關(guān)[26-27]。

本研究結(jié)果表明，失眠會對下丘腦、垂體及腎上腺造成一定程度的病理改變，表現(xiàn)為模型組大鼠下丘腦中非神經(jīng)元細胞數(shù)量增多；垂體中嗜色細胞減少，而嫌色細胞增多，嗜色細胞主要分泌生長激素、催乳素（嗜酸性細胞）、促甲狀腺素、促腎上腺素和促性腺激素等（嗜堿性細胞），嗜酸性細胞和嗜堿性細胞不易在HE染色下分辨，嫌色細胞主要是退化的嗜色細胞，或者是形成初期的嗜色細胞，提示失眠大鼠的垂體功能受到影響；腎上腺中細胞代償性增大，腎上腺分泌功能增強。綜上分析，失眠使HPA軸激素分泌功能紊亂。同時，失眠模型組大鼠血清中的CRH、ATCH、CORT 含量，下丘腦中的CRH、垂體中的ACTH、腎上腺中的CORT 含量均較正常組上升，HPA 功能呈亢進狀態(tài)。上述指標均證明，失眠模型大鼠會出現(xiàn)HPA 軸功能亢進，長時間的應(yīng)激狀態(tài)使得垂體分泌功能減退，與文獻報道一致[28]。

血清生化指標分析結(jié)果表明，酸棗仁可改善失眠引起的多種生化指標異常。HPA 軸功能亢進可能會導致機體炎癥因子紊亂，已有研究證實睡眠不足會誘發(fā)先天性免疫反應(yīng)，誘導促炎細胞因子（如ⅠL-1β和TNF-α）的表達增加。ⅠL-1β作為炎性細胞因子，廣泛參與炎癥反應(yīng)，局部高濃度ⅠL-1β主要發(fā)揮內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用，可作用于下丘腦引起發(fā)熱，刺激下丘腦釋放CRH，使垂體釋放ACTH，促進糖皮質(zhì)激素的釋放[29-30]。本研究結(jié)果顯示，給予酸棗仁提取物后可不同程度地降低模型動物血清ⅠL-1β和TNF-α的表達，提示其可緩解因失眠導致的機體炎癥反應(yīng)，同時降低促炎因子對HPA軸激素釋放作用。

NO參與了學習與記憶的調(diào)節(jié)過程，有誘導多種睡眠因子促進睡眠的作用[31]，其含量與人的神經(jīng)系統(tǒng)具有密切聯(lián)系，具有第二信使和神經(jīng)遞質(zhì)的作用，調(diào)節(jié)多種病理生理過程[32]。本研究結(jié)果表明失眠大鼠血清NO 含量降低，酸棗仁提取物可升高失眠大鼠血清NO 含量，該作用可能為酸棗仁鎮(zhèn)靜催眠及治療失眠癥的作用機制之一。

綜上所述，本研究基于PCPA 致失眠大鼠模型，證實HPA 軸功能紊亂與失眠的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而酸棗仁可一定程度緩解失眠造成的HPA 軸過激狀態(tài)，其中酸棗仁高劑量對調(diào)節(jié)HPA 軸功能紊亂具有較好的效果，為后續(xù)基于HPA 軸研究失眠癥的作用機制提供了研究基礎(chǔ)。