縊蟶糖原磷酸化酶基因多態(tài)性與糖原含量的關(guān)聯(lián)分析

陳燕園 ，林志華 ，劉圣，姚韓韓，董迎輝

(1.浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315100；2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；3.浙江萬(wàn)里學(xué)院 寧海海洋生物種業(yè)研究院，浙江 寧海 315604)

1 引言

糖原是儲(chǔ)存于動(dòng)物肝臟、肌肉中的支鏈多糖，是一種易于儲(chǔ)存、隨時(shí)可用的葡萄糖儲(chǔ)備[1]。糖原的存在既保證了機(jī)體的正常運(yùn)行，又對(duì)維持能量動(dòng)態(tài)平衡起著至關(guān)重要的作用。在海洋雙殼貝類(lèi)中，有些種類(lèi)的糖原儲(chǔ)存于特定囊泡細(xì)胞中，其含量的變化與配子發(fā)育、生長(zhǎng)、繁殖、抗逆、風(fēng)味等密切相關(guān)[2]。在滑項(xiàng)薄殼鳥(niǎo)蛤（Fulvia mutica）[3]、魁蚶（Scapharca broughtonii）[4]、縊蟶（Sinonovacula constricta）[5]等多種貝類(lèi)的研究中發(fā)現(xiàn)，性腺成熟過(guò)程中糖原含量顯著下降；在夏季不利的環(huán)境中，糖原含量高的貝類(lèi)抵抗能力強(qiáng)、死亡率低[6]；在長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）[7]、縊蟶[8]中，高糖原含量能顯著增加肉質(zhì)的鮮味和口感。

糖原磷酸化酶（Glycogen Phosphorylase，GPH）是糖原分解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，催化糖原的磷酸解反應(yīng)[9]。GPH基因最早在家兔肌肉中發(fā)現(xiàn)，隨后獲得糖原磷酸化酶基因的cDNA 序列[10-11]。在海水貝類(lèi)中，已克隆獲得長(zhǎng)牡蠣和福建牡蠣（Crassostrea angulata）GPH基因的cDNA 全長(zhǎng)序列，并發(fā)現(xiàn)GPH基因表達(dá)水平與糖原含量變化有關(guān)[12-13]。此外，在長(zhǎng)牡蠣GPH基因中篩查到了1 個(gè)與糖原含量關(guān)聯(lián)的SNP 位點(diǎn)[14]。目前，尚未見(jiàn)對(duì)縊蟶糖原磷酸化酶基因的相關(guān)研究。

縊蟶廣泛分布于我國(guó)沿海灘涂，是浙江、福建等省份的主養(yǎng)貝類(lèi)[15]。不同季節(jié)縊蟶的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、鮮味變化很大，一般春季3-6 月最佳，與其糖原含量密切相關(guān)[16]，然而目前有關(guān)縊蟶糖原調(diào)控的分子機(jī)制尚不明晰。本研究克隆了縊蟶糖原磷酸化酶基因（Sc-GPH）cDNA 全長(zhǎng)，分析其在縊蟶不同組織和月份的表達(dá)水平，并篩選與糖原含量相關(guān)的SNP 位點(diǎn)，為高糖原縊蟶的分子育種提供候選基因和標(biāo)記。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

以浙江宏野海產(chǎn)品有限公司養(yǎng)殖的縊蟶“甬樂(lè)1 號(hào)”為材料，自2019 年2 月開(kāi)始采集縊蟶樣品（16 月齡，殼長(zhǎng)為（61.63±3.69）mm，殼寬為（15.28±2.35）mm，殼高為（19.53±2.26）mm，體重為（14.08±2.11）g），此后每?jī)蓚€(gè)月定時(shí)采樣，樣品均為同一批，直至12 月采樣結(jié)束。每次取樣，隨機(jī)選取12 顆縊蟶，活體解剖取8 個(gè)組織（足、外套膜、性腺、閉殼肌、肝胰腺、水管、鰓和唇瓣），經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱，用于糖原含量測(cè)定和RNA 提取。

用于SNP 分析的縊蟶群體分別為“甬樂(lè)1 號(hào)”（YL1）和臺(tái)州市野生群體（TZ），各取100 顆個(gè)體的足肌，一部分用于RNA 提取，一部分經(jīng)真空冷凍干燥置于-20℃保存，用于糖原含量測(cè)定。

2.2 糖原含量分析

取縊蟶不同組織、不同月份及不同群體樣品，按照南京建成生物研究所生產(chǎn)的肝/肌糖原檢測(cè)試劑盒（A043）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行糖原含量的測(cè)定。凍干樣品中加入堿液，100°C 加熱20 min 進(jìn)行皂化。冷卻后，加入蒽酮-硫酸溶液進(jìn)行反應(yīng)后，在Spark 多功能酶標(biāo)儀（TECAN，瑞士）620 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.3 Sc-GPH cDNA 全長(zhǎng)克隆

根據(jù)縊蟶轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中獲得的Sc-GPH轉(zhuǎn)錄本序列，設(shè) 計(jì)3′-RACE 和5′-RACE 特異性引物（表1）。以成貝足中總RNA 為模板，用SMART RACE 5′/3′試劑盒（Clontech，美國(guó)）合成cDNA 第一條鏈。以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行3′-RACE和5′-RACE 擴(kuò)增，其產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，割膠回收純化后的PCR 產(chǎn)物與pEASY?-T1 克隆載體（全式金，北京）進(jìn)行連接，接著轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞（全式金，北京）中，挑選陽(yáng)性菌落送上海生工公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 所用的引物及信息Table 1 The information of primers used in this experiment

2.4 Sc-GPH 序列及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用DNAMAN 6.6 軟件將所獲得Sc-GPH的5′-RACE 和3′-RACE 片段序列與轉(zhuǎn)錄本拼接，獲得cDNA 全長(zhǎng)；通過(guò)ORF Finder 網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測(cè)基因的開(kāi)放閱讀框（OpeanReading Frame,ORF）及氨基酸序列；利用Expasy（https://web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)、Signalp（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)信號(hào)肽；用Smart（http://smart embl-heidelberg.de/）預(yù)測(cè)功能域；通過(guò)BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）在線工具對(duì)Sc-GPH所編碼的氨基酸序列進(jìn)行相似性分析，并用DNAMAN 6.6 軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)；用MEGA 6.0 軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析

將縊蟶8 個(gè)組織和不同月份縊蟶足、外套膜的cDNA 稀釋50 倍作為模板，用18S rDNA 基因作為內(nèi)參基因，利用LightCycler?480（Roche，德國(guó)）熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。反應(yīng)體系（20μL）：2×SYBR GreenⅠMaster（Roche，德國(guó)）10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 模板2 μL，ddH2O 6 μL；反應(yīng)程序：95°C 預(yù)變性10 min，然后95°C 10 s、60°C 1 min，45 個(gè)循環(huán)。為了保證熒光定量PCR 的可靠性，每個(gè)樣品做3 個(gè)技術(shù)重復(fù)，每組做4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，Sc-GPH的相對(duì)表達(dá)量按照2-ΔΔct法計(jì)算，并用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 22.0 軟件進(jìn)行方差分析，p＜0.05為差異顯著，p＜0.01 為差異極顯著。

2.6 糖原含量相關(guān)SNP 的篩選

取縊蟶“甬樂(lè)1 號(hào)”（YL1）和臺(tái)州市野生群體（TZ）2 個(gè)群體各100 顆的足肌，提取RNA 并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)Sc-GPHcDNA 序列，用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物H-S-F 和H-S-R（表1），PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger 測(cè)序。使用MEGA 6.0 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，運(yùn)用SPSS 22.0 軟件將得到SNP 位點(diǎn)的基因型值與基因型值對(duì)應(yīng)的糖原含量進(jìn)行線性回歸分析，將其中一種等位基因純合子賦值為2，另一種等位基因純合子基因型值賦值為0，雜合子賦值為1[17]。

3 結(jié)果

3.1 縊蟶糖原含量的組織差異和月份變化分析

取浙江縊蟶軟體部糖原含量最高的4 月份樣品[17]的不同組織（鰓、閉殼肌、足、外套膜、肝胰腺、性腺、水管、唇瓣），用于糖原含量組織差異分析。結(jié)果顯示，足和外套膜糖原含量分別為（103.1±8.3）mg/g 和（111.0±10.5）mg/g，極顯著高于除閉殼肌外的其他組織（p＜0.01，圖1A）?？O蟶足和外套膜周年的糖原含量測(cè)定結(jié)果表明，上半年的糖原含量顯著高于下半年，從2 月份逐漸增加，4 月份達(dá)到峰值，足和外套膜糖原含量分別為（141.3±9.8）mg/g 和（148.3±4.7）mg/g（p＜0.01），隨后逐漸下降至10 月份的最低值，足和外套膜糖原含量分別為（13.0±1.2）mg/g 和（15.3±1.6）mg/g（圖1B）。

圖1 縊蟶不同組織（A）和不同月份足和外套膜（B）的糖原含量變化Fig.1 Changes of glycogen content in different tissues (A) and different months in foot and mantle (B) of Sinonovacula constricta

3.2 Sc-GPH 全長(zhǎng)cDNA 序列分析

Sc-GPHcDNA 全長(zhǎng)3 963 bp（GenBank 登錄號(hào)：MT125681），包括5′非編碼區(qū)（Untranslated Region，UTR）112 bp、3′UTR 1 310 bp、開(kāi)放閱讀框2 541 bp，共編碼846 個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)其蛋白分子質(zhì)量（Mw）為97.23 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為6.11；該蛋白質(zhì)的氨基酸組成中，極性氨基酸所占比例較高，表現(xiàn)為親水性，沒(méi)有明顯的信號(hào)肽；預(yù)測(cè)Sc-GPH 蛋白在113～828 aa含有1 個(gè)功能域，為Phosphorylase。

選取16 種動(dòng)物GPH 氨基酸序列與Sc-GPH 氨基酸序列作多重比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sc-GPH 與蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis，OWF50424.1）、歐洲大扇貝（Pecten maximus，XP_033734012.1）、長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas，CCN27372.1）GPH 的氨基酸序列相似性較高，分別為78.34%、78.11%和77.87%，與日本對(duì)蝦（Penaeus japonicus，BAJ23879.1）、家蠶（Bombyx mori，ACB41088.1）、智人（Homo sapiens，NP_059125.2）等物種的相似性為70.45%～75.86%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，縊蟶與歐洲大扇貝、蝦夷扇貝、長(zhǎng)牡蠣等貝類(lèi)親緣關(guān)系較近，聚為一支；與昆蟲(chóng)類(lèi)、甲殼類(lèi)、哺乳動(dòng)物類(lèi)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖2）。

圖2 縊蟶與其他物種GPH 氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree of GPH among Sinonovacula constricta and other species

3.3 不同組織、不同月份Sc-GPH 的表達(dá)模式

取8 月份縊蟶的不同組織樣品，利用qRT-PCR 檢測(cè)Sc-GPH的組織表達(dá)特征，結(jié)果顯示，Sc-GPH在8 個(gè)組織均有表達(dá)，其中足、外套膜的表達(dá)量最高（p＜0.01，圖3A）。Sc-GPH在縊蟶不同月份外套膜和足的表達(dá)結(jié)果表明，Sc-GPH在8 月的表達(dá)水平極顯著高于其他月份（p＜0.01，圖3B）。

圖3 Sc-GPH 在縊蟶不同組織（A）和不同月份足和外套膜（B）的的表達(dá)特征Fig.3 The expression characteristics of Sc-GPH in different tissues (A) and different months in foot and mantle (B)

3.4 Sc-GPH SNP 位點(diǎn)與糖原含量的關(guān)聯(lián)分析

在縊蟶YL1 群體中，Sc-GPH編碼區(qū)域共發(fā)現(xiàn)33 個(gè)SNP 位點(diǎn)，其中4 個(gè)位點(diǎn)（c.874C＞T、c.930T＞C、c.1133T＞C、c.1284T＞A）與糖原含量的相關(guān)性較為顯著，c.1133T＞C、c.1284T＞A 位點(diǎn)差異顯著（p＜0.05，表2）；在TZ 群體同樣篩選到c.930T＞C 位點(diǎn)（表2），且該位點(diǎn)為同義突變。在縊蟶兩個(gè)群體中，c.930T＞C 位點(diǎn)與糖原含量相關(guān)性均為差異顯著（p＜0.05，表2），CC 基因型個(gè)體的糖原含量比TT 基因型的個(gè)體高（p＜0.05），說(shuō)明該位點(diǎn)與縊蟶糖原含量相關(guān)。

表2 縊蟶“甬樂(lè)1 號(hào)”（YL1）和臺(tái)州野生群體（TZ）Sc-GPH SNPs 位點(diǎn)與糖原含量的相關(guān)性分析Table 2 Association of SNPs of Sc-GPH with glycogen content in YL1 and TZ of Sinonovacula constricta

4 討論

糖原是一種可以直接利用的儲(chǔ)能物質(zhì)，包括儲(chǔ)存于肌肉中的肌糖原和肝臟中的肝糖原。在哺乳動(dòng)物中，骨骼肌中的肌糖原占身體糖原總量的2/3，肝臟中的肝糖原占糖原總量的1/3。研究發(fā)現(xiàn)，不同海洋貝類(lèi)貯存糖原的部位不盡相同，如長(zhǎng)牡蠣的糖原主要貯存于性腺、唇瓣中[12]，紫貽貝（Mytilus edulis）的糖原則貯存在外套膜中[18]，而墨西哥灣扇貝（Argopecten irradians concentricus）的糖原貯存在閉殼肌中，并因繁殖周期、環(huán)境而發(fā)生變化[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，縊蟶足和外套膜組織的糖原含量高于其他組織，與Yan 等[20]的研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明這兩個(gè)組織是縊蟶糖原的主要貯存部位，它們具有較高的肌肉含量，肌糖原分解可為其收縮供給充足能量。另外，在縊蟶肝胰腺中亦有較高的糖原含量，推測(cè)主要存在于肝細(xì)胞中的肝糖原，其分解可以維持血糖濃度的恒定，從而保證機(jī)體的正常生理功能。

糖原代謝的多個(gè)調(diào)節(jié)過(guò)程，如葡萄糖的增加和糖原降解的減少，均可能由糖原磷酸化酶引起[21]。研究表明，糖原磷酸化酶激活催化糖原水解為葡萄糖，導(dǎo)致GPH基因表達(dá)量增加，從而為機(jī)體提供能量[22-23]。此外，GPH基因在不同發(fā)育時(shí)期和組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在明顯差異，如福建牡蠣GPH基因在性腺和閉殼肌中表達(dá)量較高[13]。本研究結(jié)果表明，在縊蟶8 個(gè)組織中均檢測(cè)到Sc-GPH的表達(dá)，其中足和外套膜呈現(xiàn)高表達(dá)，與其對(duì)應(yīng)的高糖原含量及其存儲(chǔ)糖原能力有關(guān)。在許多物種中發(fā)現(xiàn)，肌肉是活性糖原的儲(chǔ)存庫(kù)，以便快速提供ATP[24]。2-5 月為縊蟶性腺發(fā)育的休止期，糖原含量較高，與此同時(shí)檢測(cè)到Sc-GPH在足和外套膜中低表達(dá)，說(shuō)明縊蟶體內(nèi)正在合成儲(chǔ)存糖原；隨著配子的發(fā)生，Sc-GPH的表達(dá)量顯著增加，而糖原含量降低，表明糖原儲(chǔ)存向糖原分解轉(zhuǎn)變。因此，Sc-GPHmRNA 表達(dá)水平的變化與縊蟶繁殖周期關(guān)系緊密，其在配子發(fā)生期間可利用足和外套膜中的糖原。

多數(shù)SNP 位于基因組的非編碼區(qū)，在群體遺傳和生物進(jìn)化研究中起著重要作用[25-26]，而編碼區(qū)的SNP 位點(diǎn)則具有較高的遺傳穩(wěn)定性[27]。本實(shí)驗(yàn)在縊蟶Sc-GPH的編碼區(qū)共檢測(cè)到個(gè)33 個(gè)SNP 位點(diǎn)，SNP 平均密度達(dá)到1/72 bp，這與縊蟶生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2 基因外顯子上 SNP 平均密度（1/65 bp）[28]、長(zhǎng)牡蠣糖原磷酸化酶基因外顯子SNP 平均密度（1/35 bp）[29]等存在差異，說(shuō)明同一物種不同基因或不同物種之間SNP 分布密度不同。在縊蟶Sc-GPH與糖原含量的關(guān)聯(lián)分析中發(fā)現(xiàn)，1 個(gè)SNP 位點(diǎn)與糖原含量相關(guān)，c.930T＞C 位點(diǎn)的CC 基因型個(gè)體的糖原含量比TT 基因型的個(gè)體高，該位點(diǎn)可作為縊蟶高糖原遺傳育種的重要候選分子標(biāo)記。