紫杉醇對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞功能的破壞及其潛在機(jī)制

葉亞婷,竇國睿,常天芳 ,孫 宇,牛亞麗1，,周子義 ,儲(chǔ)昭節(jié)

0引言

紫杉醇(paclitaxel, PTX)是一種微管穩(wěn)定藥物，已獲得美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration, FDA)的批準(zhǔn)，可用于治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肉瘤、淋巴瘤和白血病等多種腫瘤的抗腫瘤藥物[1]。但需要注意的是其應(yīng)用所并發(fā)的諸多不良反應(yīng)給腫瘤患者日常管理帶來了一些困難。較為常見且報(bào)道較多的不良反應(yīng)主要包括骨髓抑制、過敏反應(yīng)、消化系統(tǒng)反應(yīng)、神經(jīng)毒性、肌肉/關(guān)節(jié)痛、手足麻木以及肝臟損傷等[2]。近些年關(guān)于PTX治療引起黃斑水腫[3]陸續(xù)被報(bào)道，為一種PTX使用相關(guān)的少見眼部并發(fā)癥。目前關(guān)于PTX導(dǎo)致黃斑水腫的研究較少且機(jī)制不明，有文獻(xiàn)猜測(cè)PTX導(dǎo)致的黃斑水腫與視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE)細(xì)胞損害[4]和視網(wǎng)膜屏障[5]有關(guān)，但尚未有研究證實(shí)。為明確PTX對(duì)RPE細(xì)胞存在潛在影響，我們應(yīng)用體外培養(yǎng)的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究其對(duì)RPE細(xì)胞及屏障功能的影響，以闡明PTX致黃斑水腫的發(fā)病機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1試劑人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE-19)購自于賽百慷公司(中國)。DME/F12培養(yǎng)基劑購自HyClone公司(美國)。胎牛血清等培養(yǎng)試劑購自Gibco公司(美國)。PTX購自于MedChemExpress(MCE)公司(美國)。流式細(xì)胞儀以及配套試劑盒購自Invitrogen(美國)。CCK8試劑盒購自武漢華美公司(中國)。酶標(biāo)儀(ELX 800,Bio-Teck,美國)。Cleaved-caspse-3、Bcl-2、Bax、ZO-1、Occludin購自Abcam公司(英國)。β-actin抗體以及二抗購自CST公司(美國)。

1.1.2細(xì)胞的培養(yǎng)及分組將ARPE-19細(xì)胞系在含10%胎牛血清、1%雙抗的DME/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將ARPE-19細(xì)胞分為五組:對(duì)照組(正常培養(yǎng)基)、0.005、0.05、0.5、5mg/L PTX組。當(dāng)細(xì)胞融合至60%～70%時(shí)，換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h后加不同濃度的PTX刺激12、24、36、48、72h。

1.2方法

1.2.1CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況將ARPE-19細(xì)胞以每毫升2×104個(gè)接種于96孔板中，每孔加入細(xì)胞懸浮液100μL。置細(xì)胞于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁后換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h后按對(duì)照組、0.005、0.05、0.5、5mg/L PTX刺激12、24、36、48、72h，每孔加入10μL CCK8溶液繼續(xù)孵育，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度。

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞按每毫升1×106個(gè)接種于6孔板，置細(xì)胞于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁后換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h后按對(duì)照組、0.005、0.05、0.5、5mg/L PTX刺激12、24、36、48、72h，胰酶消化加1×Binding Buffer輕輕重懸細(xì)胞，1000r/min離心5min。加入Annexin V-FITC，室溫避光孵育15min。加入PI染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置5min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.2.2，當(dāng)細(xì)胞貼壁后換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h后按對(duì)照組、0.005、0.05、0.5、5mg/L PTX刺激24h,0.1%胰酶消化,70%冷乙醇固定4h,Triton-100震蕩,RNA酶37℃水浴30min,碘化丙啶染色后,置于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析細(xì)胞周期。

1.2.4免疫熒光觀察細(xì)胞形態(tài)將ARPE-19細(xì)胞按每毫升2×105個(gè)接種于共聚焦培養(yǎng)皿中,當(dāng)細(xì)胞生長至70%時(shí)換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h之后以換液的方式將對(duì)照組和0.05mg/L PTX的培養(yǎng)基加入共聚焦培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)24h。4%多聚甲醛固定30min。室溫下,在1%BSA和0.5% Trition X-100(PBS稀釋)的封閉液中封閉30min。加入兔源鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)一抗(1∶200)，一抗用上述封閉液稀釋,4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。PBS清洗3次,每次5min。孵二抗(1∶200)避光室溫1h使用含有DAPI的封片劑染色細(xì)胞核并封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5細(xì)胞屏障模型的建立及檢測(cè)提前1h將Transwell小室浸泡于培養(yǎng)基中,將ARPE-19細(xì)胞按每毫升5×104個(gè)接種于微孔孔徑0.40μm的Transwell小室內(nèi)底面,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育,無細(xì)胞生長僅有濾膜的小室作為空白組。所有的Transwell上室加入500μL細(xì)胞培養(yǎng)液,下室加入1500μL培養(yǎng)液以保持靜水壓相等。用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況，當(dāng)細(xì)胞開始融合時(shí)換為低血清(1% FBS)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),之后隔天以半換液形式進(jìn)行換液。用TER儀測(cè)定跨上皮細(xì)胞電阻,單位為Ω·cm,之后每日同一時(shí)間點(diǎn)測(cè)TER共6次。空白組用同樣的方法測(cè)定,作為背景電阻值；實(shí)驗(yàn)組的TER值為所測(cè)電阻值減去背景電阻值乘以濾膜面積。從3個(gè)取液處進(jìn)行測(cè)量,每孔電阻的測(cè)量至少重復(fù)3遍取其平均值。當(dāng)觀察到細(xì)胞呈緊密連接的六邊形且連續(xù)3d電阻穩(wěn)定即認(rèn)為細(xì)胞極化形成。當(dāng)細(xì)胞極化形成時(shí),以換液的方式將對(duì)照組和含0.005、0.05、0.5、5mg/L PTX的培養(yǎng)基加入Transwell上室,分別在加藥后3、6、12、24h測(cè)量其電阻值變化。同時(shí)，當(dāng)細(xì)胞極化形成時(shí)，以換液的方式將對(duì)照組和含0.05mg/L PTX的培養(yǎng)基加入Transwell上室刺激24h后，提取總蛋白檢測(cè)屏障功能相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.2.6Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平將ARPE-19細(xì)胞接種于6cm培養(yǎng)皿中,細(xì)胞生長至70%時(shí)換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h之后以換液的方式將對(duì)照組和0.05mg/L PTX 的培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)24h后,加細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度,在制備的SDS-PAGE加每孔30μg蛋白用于電泳分離,采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜后置于5%的脫脂牛奶(TBST)中室溫封閉1.5h。孵兔源一抗(1∶1000稀釋)Cleaved-caspse-3、Bcl-2、Bax 4℃過夜,孵二抗室溫1h。通過ECL化學(xué)發(fā)光液在暗室中對(duì)蛋白質(zhì)膜進(jìn)行成像。并通過ImageJ Program掃描和測(cè)量條帶的相對(duì)光密度。β-actin為內(nèi)參。

2結(jié)果

2.1CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況PTX抑制ARPE-19細(xì)胞增殖，且與時(shí)間和藥物濃度呈依賴性(圖1)。藥物處理12h及低濃度(0.005mg/L)的PTX處理24h后對(duì)細(xì)胞增殖基本無影響影響，其細(xì)胞存活率基本在96.7%左右，處理36h，細(xì)胞增殖開始受影響；其余濃度處理下，不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖明顯受到抑制，特別是高濃度(5mg/L)的PTX處理72h后，細(xì)胞存活率僅為28.9%。

圖1 各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖圖。

2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況PTX引起ARPE-19細(xì)胞的凋亡與時(shí)間和藥物濃度呈依賴性(圖2)。0.005、0.05、0.5、5mg/L PTX藥物處理12h細(xì)胞凋亡基本不受影響，其凋亡指數(shù)保持在6左右；除高濃度(5mg/L PTX)處理24h細(xì)胞凋亡明顯增加，其凋亡指數(shù)為15.93，其余不同濃度細(xì)胞凋亡基本不受影響；在0.005、0.05、0.5、5mg/L PTX藥物刺激36、48h細(xì)胞凋亡均受影響。而當(dāng)藥物刺激72h時(shí)，細(xì)胞基本壞死。

圖2 各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)凋亡圖。

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期對(duì)照組、0.005、0.05、0.5、5mg/L PTX作用24h后ARPE-19細(xì)胞明顯阻滯于G2/M期(圖3)。且隨著藥物濃度增加細(xì)胞周期變化更明顯。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 A:對(duì)照組；B：0.005mg/L PTX組；C：0.05mg/L PTX組；D：0.5mg/L PTX組；E：5mg/L PTX組。

2.4免疫熒光觀察細(xì)胞形態(tài)0.05mg/L PTX處理24h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變(圖4)。正常細(xì)胞呈現(xiàn)扁梭形、圓形或多角形的細(xì)胞形態(tài)，貼壁良好。加藥物組中，細(xì)胞數(shù)相對(duì)減少且細(xì)胞發(fā)生皺縮，細(xì)胞骨架不清晰細(xì)胞形態(tài)趨于圓形。

圖4 免疫熒光觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.5細(xì)胞屏障模型的建立及檢測(cè)當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)2wk之后極化逐步形成(圖5A)，其跨上皮電阻保持在70Ω·cm2加藥物刺激后細(xì)胞屏障功能被破壞，同一時(shí)間點(diǎn)下藥物濃度高者細(xì)胞屏障受損更嚴(yán)重(圖5B)。0.05mg/L PTX作用細(xì)胞24h后，細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1和跨膜蛋白Occludin的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低(圖5C)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

圖5 細(xì)胞屏障模型檢測(cè) A:細(xì)胞極化形成跨上皮電阻圖；B:藥物刺激后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞跨上皮電阻示意圖；C:細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1和跨膜蛋白Occludin相對(duì)表達(dá)圖。

表1 兩組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

2.6Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況與對(duì)照組相比，0.05mg/L PTX組Bax、Cleaved-caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高,Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1，圖6。

圖6 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況 A:Bax蛋白相對(duì)表達(dá)圖；B:Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)圖；C:Cleaved-caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)圖。

3討論

PTX是FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)天然植物化學(xué)藥物,是一種高效低毒的光譜抗癌藥物,其分子式為：C47H51NO14,分子量為853.92。1992年由美國FDA批準(zhǔn)上市的三環(huán)二萜類抗腫瘤藥物[1]，1971年由Wani等[6]從短葉紅豆杉中分離出來化合物紅豆杉。其在抗腫瘤方面的療效顯著，在眼部的不良反應(yīng)引起了眼科醫(yī)生的注意。

根據(jù)近幾年關(guān)于PTX導(dǎo)致黃斑水腫病例報(bào)道總結(jié)，PTX所導(dǎo)致的黃斑水腫，患者最初出現(xiàn)雙側(cè)視力下降，眼前節(jié)檢查顯示結(jié)果正常。除雙側(cè)黃斑囊性改變外，眼底檢查結(jié)果均在正常范圍內(nèi)。熒光素血管造影(fundus fluorescence angiography, FFA)顯示無滲漏或滲漏極小，光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography, OCT)顯示黃斑中心凹厚度增加[7-9]。PTX引起黃斑水腫的病理機(jī)制尚不明確，沒有推薦的治療指南。治療策略主要為停止化療，也有學(xué)者嘗試碳酸酐酶抑制劑[10]、皮質(zhì)類固醇藥物[8]以及抗血管內(nèi)皮生長因子[11]藥物進(jìn)行治療，但治療效果都不顯著。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PTX可以抑制體外培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞生長，且呈時(shí)間、濃度依賴性,0.05mg/L PTX處理細(xì)胞36h細(xì)胞增殖受到抑制。在早些年，有研究者發(fā)現(xiàn)PTX可抑制原代ARPE-19的增殖，且使細(xì)胞表面微絨毛減少，細(xì)胞器減少等[12]。而且長時(shí)間(72h)的藥物處理細(xì)胞基本壞死，短時(shí)間較高濃度的藥物處理細(xì)胞出現(xiàn)凋亡；凋亡標(biāo)志物Cleaved-caspase-3較對(duì)照組顯著增加，促凋亡因子Bax及Bcl-2抗凋亡因子是調(diào)節(jié)凋亡的關(guān)鍵因子。在細(xì)胞受刺激下，細(xì)胞線粒體外膜遭到破壞，細(xì)胞膜通透性增加，進(jìn)而激活胱天蛋白酶3(Caspase-3)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。在早前的研究中，羅莉霞等[14]研究發(fā)現(xiàn)PTX可通過誘導(dǎo)兔晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡而抑制細(xì)胞增殖。

血-視網(wǎng)膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)包括內(nèi)BRB(inner blood-retinal barrier,iBRB)和外BRB(outer blood-retinal barrier,oBRB)，它們分別由視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(retinal capillary endothelial cells，RCEC)和RPE細(xì)胞與Bruch膜和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管共同形成[15]。眾所周知，人類視網(wǎng)膜的三分之二通過iBRB由視網(wǎng)膜毛細(xì)血管提供營養(yǎng)，其余部分通過oBRB由脈絡(luò)膜毛細(xì)血管提供[16-17]。由RPE形成的oBRB對(duì)于維持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[18]。oBRB調(diào)控著視網(wǎng)膜與脈絡(luò)膜循環(huán)之間的養(yǎng)分和代謝產(chǎn)物進(jìn)出，是視網(wǎng)膜維持生理狀態(tài)和功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之一[19]。oBRB的建立取決于視網(wǎng)膜最外層的單層排列的六角形細(xì)胞——RPE細(xì)胞間的緊密連接(tight junction,TJ)和細(xì)胞極化形態(tài)[20]。因此，如何維持或重建oBRB結(jié)構(gòu)和功能，是維持視網(wǎng)膜正常穩(wěn)態(tài)和生理功能的關(guān)鍵，也是多種視網(wǎng)膜疾病防治的潛在靶點(diǎn)。如在糖尿病性視網(wǎng)膜病變中，oBRB的破壞起著重要作用。一項(xiàng)研究報(bào)告稱，oBRB占糖尿病視網(wǎng)膜總血管滲漏的三分之一[21]。年齡相關(guān)性黃斑病變(age-related macular degeneration,ARMD)，oBRB的完整性可防止脈絡(luò)膜血管反應(yīng)侵入視網(wǎng)膜并將干性ARMD轉(zhuǎn)變?yōu)闈裥訟RMD[19]。本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，0.05mg/L PTX組跨膜蛋白Occludin和結(jié)構(gòu)連接蛋白ZO-1的相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，同時(shí)0.05mg/L PTX組細(xì)胞跨上皮電阻顯著降低。根據(jù)本研究，我們推測(cè)在疾病發(fā)生過程中，RPE細(xì)胞的增殖受到抑制、凋亡增加、形態(tài)異常及極化丟失會(huì)引起oBRB的破壞進(jìn)而導(dǎo)致黃斑水腫的發(fā)生。

然而這種特殊的黃斑水腫，與其他黃斑水腫，如糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema,DME)，繼發(fā)于視網(wǎng)膜靜脈阻塞(macular edema secondary to retinal vein occlusion,RVO-ME)或葡萄膜炎相比，其特點(diǎn)是不表現(xiàn)出經(jīng)典的眼底血管造影結(jié)果。在PTX引起的黃斑水腫中，OCT顯示黃斑中心凹不同程度增厚，F(xiàn)FA檢查未發(fā)現(xiàn)明顯滲漏源。此外，黃斑水腫在停藥后的不同時(shí)間會(huì)自行消失。這種特殊類型的黃斑水腫迄今為止還沒有明確的發(fā)病機(jī)制的研究發(fā)表，只有病例報(bào)道。對(duì)這類黃斑水腫的發(fā)病機(jī)制有不同的推測(cè)：(1)有學(xué)者認(rèn)為藥物引起的黃斑水腫可能是由于PTX抑制細(xì)胞內(nèi)微管重組引起的細(xì)胞毒性所致[9]；(2)Nomi等[7]認(rèn)為其機(jī)制可能是細(xì)胞內(nèi)液體在內(nèi)部積累和BRB的微小損害；(3)也可以解釋血管造影的結(jié)果，有學(xué)者將無滲漏或極少滲漏的成像結(jié)果解釋為Müller細(xì)胞的細(xì)胞毒性。因?yàn)镸üller細(xì)胞負(fù)責(zé)維持視網(wǎng)膜的神經(jīng)感覺滲透梯度，它們的功能障礙導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)液體的積累[22]。那么，此類黃斑水腫到底是oBRB的破壞進(jìn)而導(dǎo)致的水腫還是由于Müller細(xì)胞的細(xì)胞毒性所致，或者說是兩者均參與仍還需進(jìn)一步研究證明。目前我們的研究結(jié)果表明oBRB的破壞是參與此類黃斑水腫的發(fā)病機(jī)制。

綜上所述，抗腫瘤藥物PTX可對(duì)視網(wǎng)膜存在潛在毒性作用，其可能通過抑制RPE細(xì)胞的增殖、促進(jìn)凋亡、改變細(xì)胞極化形態(tài)等造成視網(wǎng)膜外屏障的破壞，從而誘發(fā)視網(wǎng)膜黃斑水腫，提示腫瘤患者使用PTX治療的疾病管理中需要監(jiān)測(cè)眼部副作用。