表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑治療后非小細胞肺癌患者預(yù)后的影響因素分析

于 淼 陳曉玲 張瀛丹 李孝琪 烏蘭圖雅 張彬彬 門桐林

1.沈陽市第十人民醫(yī)院腫瘤一科，遼寧沈陽 110045；2.沈陽市第十人民醫(yī)院病理科，遼寧沈陽 110045；3.沈陽市第十人民醫(yī)院介入科，遼寧沈陽 110045

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）已成為全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。自發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）為驅(qū)動NSCLC 的關(guān)鍵基因以來，EGFR 信號通路也成為治療NSCLC 的重要途徑[2]。而EGFR 酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitors，EGFRTKIs）可延長EGFR 突變的NSCLC 患者的無進展生存期[3-4]。盡管絕大數(shù)EGFR 突變NSCLC 患者對EGFRTKIs 治療呈陽性反應(yīng)，但仍有5%～30%的EGFR 突變NSCLC 患者對EGFR-TKIs 治療不敏感，影響預(yù)后[5]。Hsu 等[6]的研究表明EGFR 突變的NSCLC 患者對程序性死亡配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）檢查點阻斷反應(yīng)低；Brody 等[7]進行的匯總分析顯示，對EGFR-TKIs 治療不敏感的EGFR 突變NSCLC 患者具有更高的PD-L1 表達水平，以上研究提示PD-L1參與了EGFR-TKIs 治療后NSCLC 患者的預(yù)后過程。但EGFR-TKIs 治療后NSCLC 患者預(yù)后具體受何種因素的影響，目前國內(nèi)臨床鮮有報道，因此本研究選取經(jīng)EGFR-TKIs 治療的NSCLC 患者，收集其臨床資料，檢測其PD-L1 水平，探討EGFR-TKIs 治療后NSCLC 患者預(yù)后的影響因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年1 月至2019 年9 月沈陽市第十人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）就診的161 例NSCLC 患者，其中男55 例，女106 例；年齡50～75 歲，平均（63.80±5.12）歲。

納入標準：①符合NSCLC 的診斷標準[8]，并經(jīng)病理學檢查確診為原發(fā)性NSCLC；②臨床分期Ⅲb～Ⅳ期且為EGFR 突變的NSCLC；③經(jīng)EGFR-TKIs 治療；④簽署知情同意書。排除標準：①伴有T790M 和第20 外顯子插入；②合并嚴重肝腎、心血管系統(tǒng)等疾病或合并其他器官或組織腫瘤；③治療中途停藥、換藥、減藥；④依從性差。記錄患者的預(yù)后情況，參照世界衛(wèi)生組織發(fā)布的實體瘤臨床療效評價標準1.1[9]評定，分為4 個等級：進展、穩(wěn)定、部分緩解、完全緩解。其中進展為預(yù)后不良，穩(wěn)定、部分緩解、完全緩解為預(yù)后良好。按照預(yù)后情況將患者分為預(yù)后不良組（32 例）和預(yù)后良好組（129 例）。

1.2 研究方法

收集患者入院時的基本資料，包括年齡、性別、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、吸煙史、飲酒史、合并基礎(chǔ)疾病情況、臨床分期、血清學指標[癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、白蛋白、球蛋白]、血肌酐、尿素氮、動脈血二氧化碳分壓、動脈血氧分壓、呼吸雙相平均肺密度比值（mean lung density ratio of expiration/inspiration，MLD E/I）、呼吸雙相體素指數(shù)介于-850 HU 到-950 HU 肺容積占總肺容積百分比的變化量（change in lung volume as a percentage of total lung volume with a respiratory bipolar voxel index between -850 HU and -950 HU，VI-850/-950E-I）、第一秒用力呼氣量占用力肺活量百分率。

PD-L1 表達水平檢測：患者入院后及治療前空腹采集外周靜脈血5 ml，靜置30 min 后收集血清冷凍于-20°C 冰箱中備用。使用RNA 提取試劑盒（購自Thermo Fisher Scientifc 公司，批號：S01925）進行提取，提取后置于-80℃冰箱保存。使用TRIzol 分離總RNA；使用BioTek SynergyTMH1 雜交解讀器測定RNA純度；使用Takara Biotechnology 公司生產(chǎn)的PrimeScript RT 試劑盒將RNA 樣本逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；使用Thermo Fisher Scientific 生產(chǎn)的SYBR Green PCR Master Mix試劑盒和ABI 7500 Real-Time PCR 系統(tǒng)進行RTqPCR 反應(yīng)，并進行PD-L1 mRNA 相對于甘油醛-3-磷酸脫氫酶的水平檢測。PCR 條件設(shè)置：在95℃初始變性1 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，在72℃延伸1 min，35 個循環(huán)，最終延伸至72°C，持續(xù)10 min。使用2-ΔΔCt公式計算基因表達的相對倍數(shù)變化。PCR 引物序列為5’-TTGCTGAACGCCCCATACAA-3’（正向引物），5’-TCAGTGCTACACCAAGAGCAT-3’（反向引物），5’-AAGTCAATGCCCCAT ACCGC-3’（正向引物），5’-TTCTGGATAACCCTCGGCCT-3’（反向引物）。免疫印跡法檢測PD-L1 蛋白表達：將蛋白樣品懸浮于10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液中，以80 V 持續(xù)30 min 后，90 V 持續(xù)90 min 進行電泳。應(yīng)用電轉(zhuǎn)儀將凝膠上的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜膜上，3%BSA 在37℃封閉2 h。以1∶1000 稀釋兔抗人PD-L1 單克隆抗體（Abcam 公司，ab205921）和內(nèi)參β-actin 抗體（1∶4000 稀釋）4℃孵育過夜；用武漢艾美捷科技有限公司PD-L1抗血清[純化的山羊抗兔（二抗抗體1∶10 000）稀釋]進行免疫印跡。采集圖像后，用凝膠成像儀對免疫印跡條帶灰度值進行分析，最終得到PD-L1 的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，經(jīng)Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料采用例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。等級資料采用秩和檢驗。采用logistic 回歸模型分析影響因素。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料及PD-L1 水平比較

預(yù)后不良組的PD-L1、血清CEA 水平高于預(yù)后良好組，血清白蛋白、MLD E/I、VI-850/-950E-I 低于預(yù)后良好組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 兩組基線資料及PD-L1 水平比較

2.2 EGFR-TKIs 治療后NSCLC 患者預(yù)后的影響因素分析

以單因素分析中差異有統(tǒng)計學差異因素為自變量，以預(yù)后情況作為因變量（預(yù)后不良=0，預(yù)后良好=1），進行多因素分析，結(jié)果顯示，PD-L1、血清CEA、血清白蛋白是EGFR-TKIs 治療后NSCLC 患者預(yù)后的影響因素（P ＜0.05）。見表2。

表2 EGFR-TKIs 治療后NSCLC 患者預(yù)后的影響因素分析

3 討論

近年來，隨著致癌驅(qū)動EGFR 基因突變/易位的發(fā)現(xiàn)和TKIs 療法的發(fā)展，NSCLC 治療進入了新時代，患者的生存期有了極大提高[10-11]。然而約30%的EGFR突變NSCLC 患者對EGFR-TKIs 治療出現(xiàn)內(nèi)源性耐藥，嚴重影響其預(yù)后[12]。Incorvaia 等[13]通過測量腫瘤和免疫細胞上PD-L1 的表達水平發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)耐藥的患者中PD-L1 水平升高，Kloten 等[14]指出PD-L1 的高表達預(yù)示著EGFR 突變NSCLC 患者對EGFR-TKIs治療不敏感。

本研究多因素分析結(jié)果顯示PD-L1 是EGFRTKIs 治療后NSCLC 患者預(yù)后的影響因素。NSCLC 的癌癥因子通過EGFR 途徑增強了腫瘤組織對PD-1阻斷的敏感性，而EGFR-TKIs 的關(guān)鍵在于抑制PD-1和EGFR 的結(jié)合[15]。PD-L1 可誘導(dǎo)PD-1 的構(gòu)象變化從而導(dǎo)致細胞質(zhì)免疫受體酪氨酸基抑制基序和免疫受體酪氨酸基開關(guān)基序磷酸化，磷酸化的酪氨酸基序隨后募集蛋白酪氨酸磷酸酶（Src homology，SHP）-2和SHP-1 蛋白酪氨酸磷酸酶以減弱T 細胞激活信號，降低T 細胞的活性[16-17]；PD-L1 還可與CD80 相互作用，并將抑制信號傳遞至活化的T 細胞，減弱患者免疫功能。PD-L1 可保護腫瘤細胞免受Ⅰ型和Ⅱ型干擾素作用及細胞毒性T 細胞介導(dǎo)的細胞溶解作用，使NSCLC 腫瘤細胞經(jīng)EGFR-TKIs 治療后仍可以生長增殖[18]。在Han 等[19]的研究中發(fā)現(xiàn)，基于抗體的PDL1 靶向治療可降低NSCLC 腫瘤細胞中的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白活性和糖酵解代謝，抑制腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移過程。Kang 等[20]的研究指出，高PD-L1 水平與NSCLC 患者經(jīng)EGFR-TKIs 治療后疾病進展相關(guān)，證實PD-L1 參與了EGFR-TKIs 治療后NSCLC患者預(yù)后過程。

CEA 是僅存在于癌癥和胚胎組織中的一種糖蛋白，直接作用于腫瘤細胞之間的黏附反應(yīng)，可調(diào)節(jié)癌細胞的分化、凋亡、浸潤和轉(zhuǎn)移[21]。血清CEA 在阻斷分化過程中起主導(dǎo)作用，與細胞轉(zhuǎn)化中的Myc 基因和B 淋巴細胞瘤-2 基因具有協(xié)同作用，可抑制細胞死亡[22]。有研究指出，經(jīng)EGFR-TKIs 治療后NSCLC 患者血清CEA＞32 ng/ml 與其水平為5～32、＜5 ng/ml 時的無進展生存期分別為8.8、11.3、14.4 個月；血清CEA≥5 ng/ml患者的無進展生存期的相對危險度是血清CEA＜5 ng/ml 患者的2.161 倍，提示血清CEA 是影響EGFR-TKIs 治療后NSCLC 患者預(yù)后的因素[23-24]。NSCLC患者由于腫瘤細胞的活躍代謝狀態(tài)和能量的大量消耗，使白蛋白合成減少，導(dǎo)致患者處于營養(yǎng)不良狀態(tài)，可增加感染風險和EGFR-TKIs 治療毒性，降低患者免疫功能等[25]。在Dal 等[26]的研究中也指出低水平血清白蛋白的EGFR-TKIs 治療后NSCLC 患者（<35 g/L）與正常血清白蛋白水平（≥35 g/L）患者預(yù)后不良的風險比為1.73，證實血清白蛋白與EGFR-TKIs 治療后NSCLC 患者的預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，PD-L1、血清CEA、血清白蛋白與EGFR-TKIs 治療后NSCLC 患者的預(yù)后情況存在密切關(guān)系。但本研究仍存在一定的局限性，例如樣本量較小等，今后將深入研究。