超高效合相色譜法拆分及測定板藍(lán)根中（R，S）-告依春對映異構(gòu)體含量*

蔡雪萍，朱乃軍，錢 嘯，陳 蓉，郝 剛

（江蘇省蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測研究中心，江蘇 蘇州 215104）

板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigoticaFortune.的干燥根，其性寒、味苦，有清熱解毒、涼血利咽功效［1-2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，板藍(lán)根具有抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用［3-5］，臨床廣泛用于治療病毒性感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、流行性腮腺炎、扁桃體炎、病毒性肝炎、帶狀皰疹等疾病。雖然其藥效顯著，但化學(xué)成分復(fù)雜，活性指標(biāo)成分不明，一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［6-9］。板藍(lán)根藥材中的R-告依春可發(fā)揮抗流感病毒作用［10］，而其對映體S-告依春可導(dǎo)致甲狀腺腫大［11］，故分離該對對映異構(gòu)體具有臨床價值。2020年版《中國藥典（四部）》中采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定板藍(lán)根中（R，S）-告依春含量［1］，但在該色譜條件下未能分離對映體。高效液相色譜（HPLC）法、氣相色譜（GC）法和超臨界流體色譜（SFC）法等均在手性化合物分離領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用［12-14］。近年來，超高效合相色譜（UPC2）法越來越多地應(yīng)用于手性化合物的分離［15-17］。UPC2基于超高效液相色譜（UPLC）法與SFC，以超臨界流體CO2為流動相主體，依靠其溶劑化能力進(jìn)行分離［15］。采用HPLC法、SFC法分離（R，S）-告依春已有相關(guān)研究［18-20］，與HPLC 法比較，UPC2法分析時間短、效率高，且有機(jī)溶劑的用量極少，對環(huán)境友好；與SFC 法比較，UPC2法具有體系重現(xiàn)性、穩(wěn)定性更高的優(yōu)勢。UPC2法是一種經(jīng)濟(jì)高效、快捷環(huán)保的分離方法，可有效彌補(bǔ)HPLC 法和SFC 法在分離手性化合物時的不足。本研究中建立了拆分板藍(lán)根藥材中（R，S）-告依春對映體并測定其含量的UPC2法，為手性化合物的拆分和含量測定提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Acquity UPC2型超高效合相色譜儀，包括Empower 3工作站（美國Waters公司）；XSE205DU型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Biofuge Primo R 型高速離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Direct-Q3 型超純水機(jī)（美國Millipore 公司）；SK8210HP 型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；XMTD-204 型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 試藥

（R，S）-告依春對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111753-201706，含量為100.0%）；R-告依春、S-告依春單一對照品（本實(shí)驗(yàn)室自制，含量分別為99.82%，99.83%）；板藍(lán)根藥材（來源見表1），經(jīng)本中心中藥室鑒定為正品；CO2（蘇州市金宏氣體股份有限公司，體積分?jǐn)?shù)≥99.995%）；甲醇為色譜純，水為超純水。

表1 板藍(lán)根藥材來源及批號Tab.1 Sources and batch numbers of Isatidis Radix samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：TrefoilTMAMY1 柱（150 mm × 3.0 mm，2.5 μm）；流動相：CO2（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～4.5 min時95%A→80%A，4.5～5 min時80%A→60%A，5～7 min時60%A，7～8 min時60%A→95%A；8～10 min時95%A）；流速：1.2 mL/min；檢測波長：245 nm；柱溫：45 ℃；動態(tài)背壓：1 800 psi；進(jìn)樣量：2 μL。

2.2 溶液制備

取R-告依春、S-告依春對照品各適量，精密稱定，以甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度分別為0.321 6，0.161 9 mg/mL的混合對照品溶液；取R-告依春、S-告依春對照品各適量，精密稱定，分別以甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度分別為0.046 0，0.044 1 mg/mL 的單一對照品溶液。取藥材樣品粉末（過4 號篩）0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 水，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取60 min，放至室溫，再次稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻并靜置5 min，取上清液，12 000 r/min離心5 min，取上清液5 mL 置坩堝中，蒸干，以甲醇復(fù)溶并定容至5 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液各2 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液色譜相應(yīng)位置有吸收峰，分離度均大于1.5。詳見圖1。

線性關(guān)系考察：分別取混合對照品溶液適量，以甲醇稀釋制成R-告依春質(zhì)量濃度為2.01，4.02，8.04，16.08，32.16，64.32 μg/ mL，S-告依春質(zhì)量濃度為1.01，2.02，4.05，8.10，16.19，32.38 μg/mL 的系列混合對照品溶液，各量取2 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以R-告依春、S-告依春的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程R-告依春為Y1=10 469X2+1 563.7（r=0.999 9，n=6），S-告依春為Y2=10 229X2+873.1（r=1.000 0，n=6）。結(jié)果表明，R-告依春和S-告依春質(zhì)量濃度分別在2.01～64.32 μg/mL和1.01～32.38 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限考察：分別取2.2 項(xiàng)下R-告依春和S-告依春單一對照品溶液各適量，倍比稀釋，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比（S/N）3∶1和10∶1時的質(zhì)量濃度記作檢測限和定量限。結(jié)果R-告依春和S-告依春的檢測限均為0.09 μg/mL，定量限分別為0.46 μg/mL和0.44 μg/mL。

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果R-告依春和S-告依春峰面積的RSD分別為0.25%和0.24%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h 時按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果R-告依春和S-告依春峰面積的RSD分別為2.50%和2.39%（n=6），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取藥材樣品（批號為AG1180402001）粉末適量，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果R-告依春和S-告依春含量的RSD分別為1.80%和1.86%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的藥材樣品（批號為AG1180402001）粉末0.2 g，共6份，分別精密加入0.5 mL混合對照品溶液，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取藥材樣品粉末適量，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，按外標(biāo)法測定樣品中R-告依春和S-告依春的含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（%，n=3）Tab.3 Results of the content determination of R-goitrin and S-goitrin in the samples（%，n=3）

3 討論

3.1 單一對照品的制備與純化

基于Waters Prep SFC 80制備型超臨界流體色譜系統(tǒng)結(jié)合REGIS（S，S）-Whelk-O1型（250 mm×30 mm，10 μm）手性制備色譜柱制備2種對映異構(gòu)體，其色譜條件參考文獻(xiàn)［21］，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，最終確定流動相為超臨界CO2和乙醇（含0.1% NH3·H2O，20∶80，V/V），流速為8 mL/min，動態(tài)背壓為1 450 psi，紫外檢測波長為220 nm，進(jìn)樣量為2 μL。分離得到的2 個組分分別經(jīng)25 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥和冷凍干燥，再經(jīng)旋光鑒定及純度檢測，最終獲得R-告依春對照品及S-告依春對照品。

3.2 色譜柱選擇

預(yù)試驗(yàn)中分別考察了TrefoilTMAMY1 柱（150 mm×3.0 mm，2.5 μm），TrefoilTMCEL1柱（150 mm×3.0 mm，2.5 μm），TrefoilTMCEL2柱（150 mm×3.0 mm，2.5 μm），結(jié)果TrefoilTMCEL1柱和TrefoilTMCEL2柱不能完全分離該對對映異構(gòu)體，分離度小于1.5；而TrefoilTMAMY1 柱分離效果較好，分離度可達(dá)1.98。故選擇TrefoilTMAMY1手性色譜柱用于R-告依春及S-告依春的分離。

3.3 樣品處理方法確定

預(yù)試驗(yàn)中分別比較了水煎煮［1］和超聲提取方法，水、50%甲醇、甲醇為提取溶劑，0.5，1，2 h 提取時間對（R，S）-告依春提取效率的影響。結(jié)果超聲提取法的提取效率明顯高于水煎煮法。有文獻(xiàn)報(bào)道，溫度越高，（R，S）-告依春穩(wěn)定性越低［22］，故長時間的高溫水煎煮使得（R，S）-告依春的穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致其含量降低；以水為提取溶劑時，UPC2法測得的R-告依春和S-告依春含量最高，且明顯高于以50%甲醇及甲醇作為提取溶劑時的含量，表明兩者在水中的溶解度高。以水為提取溶劑對藥材樣品進(jìn)行超聲提取時，隨著超聲時間的延長，提取效率隨之提高，但超聲時間＞1 h 時，兩者的含量均不再明顯增加，故最終選擇超聲時間為1 h。

3.4 樣品含量測定結(jié)果

由本研究結(jié)果可知，不同廠家板藍(lán)根藥材中R-告依春的含量均明顯高于S-告依春（約為后者的2 倍）。推測R-告依春的含量可能是影響板藍(lán)根制劑抗病毒效果的關(guān)鍵因素。

3.5 方法評價

本研究中采用UPC2法拆分板藍(lán)根藥材中抗病毒活性成分R-告依春及其對映異構(gòu)體S-告依春，并建立了兩者的含量測定方法。該方法穩(wěn)定性、重復(fù)性均較好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且環(huán)保，為（R，S）-告依春手性化合物的分離開拓了新思路，對于板藍(lán)根藥材及其制劑的質(zhì)量控制也有一定指導(dǎo)意義。