穿山龍總皂苷對(duì)去卵巢模型大鼠骨質(zhì)疏松的改善作用*

司 敏，孫倩舒，丁洪成，黃明煒

（湖北省十堰市人民醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北 十堰 442000）

骨骼是有機(jī)基質(zhì)礦化而連續(xù)形成的組織，成骨細(xì)胞的骨形成和破骨細(xì)胞的骨吸收促進(jìn)了骨重塑平衡，破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的形成和功能失衡導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥［1］。絕經(jīng)后女性卵巢性激素缺乏是引起骨質(zhì)疏松癥的主要危險(xiǎn)因素［2］。目前，對(duì)于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，主要采用雌激素替代、雙膦酸鹽和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑等藥物治療，但有一定的藥品不良反應(yīng)（如胃腸道耐受）［3］。有研究表明，部分中藥能有效緩解或治療骨損失［4］。穿山龍總皂苷廣泛存在于自然界，具有抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡等多種藥理活性，還可促進(jìn)骨折愈合［5］。本研究中探討了穿山龍總皂苷對(duì)去卵巢模型大鼠骨質(zhì)疏松的改善作用，以及Wnt/ERK 信號(hào)通路［6］在其中起到的作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

1.1.1 儀器

Lunar DPXIQ 型骨密度儀（美國(guó)GE Healthcare 公司）；Endura TELELF 3200 型機(jī)械測(cè)試儀（美國(guó)Bose 公司）；DP73 型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；DH-54152 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Electron公司）。

1.1.2 試藥

穿山龍總皂苷（廣東省惠州市中藥廠有限公司，批號(hào)為6365412.63，含量為99.958）；17β-雌二醇（中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)為1265963）；Trizol試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司，批號(hào)為BG-48596.36）；PrimescriptTMRT 試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)＜北京＞有限公司，批號(hào)為SA-474152.38）；RIPA 裂解緩沖液（批號(hào)為SD-526996.48），BCA 試劑盒（批號(hào)為CV-569633.36），均購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所；10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE，批號(hào)為XZ-56969658.36），電化學(xué)發(fā)光底物蛋白質(zhì)印跡試劑盒（批號(hào)為XC-585963.3），均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國(guó)EMD Millipore 公司，批號(hào)為CB-458582.36）；抗Wnt，ERK，GAPDH 蛋白的一抗（批號(hào)分別為sc-47724，sc-47952，sc-47156），羊抗小鼠二抗（批號(hào)為BV-2563.36），均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司；乙二胺四乙酸（EDTA，批號(hào)為MN-415895.65），蘇木素-伊紅（HE，批號(hào)為MN-2365.36），均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)SD 大鼠100 只，雌雄兼用，體質(zhì)量為（212.32±25.52）g，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（魯）2020-01145。喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，并保持環(huán)境溫度為（25 ± 1）℃，相對(duì)濕度為70%，12 h明暗循環(huán)。本研究符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》。

1.2 方法

1.2.1 模型復(fù)制及分組、給藥

選取80只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，切開腹部約1.5 cm 長(zhǎng)的皮膚，暴露腹腔、肌肉，暴露卵巢，用絲線結(jié)扎輸卵管，切除雙側(cè)卵巢［7］，以股骨骨密度（BMD）低于1.0 g/ cm3為去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型復(fù)制成功。將建模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組（等體積0.9%氯化鈉溶液）、17β-雌二醇組（1.6 g/kg）和穿山龍總皂苷低、高劑量組（2 g/kg和4 g/kg）［8］，各20只，灌胃給予相應(yīng)藥物（10 mL/ kg），每天1 次，持續(xù)8 周。另取20只大鼠作為正常對(duì)照組，灌胃給予等體積0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 BMD 檢測(cè)

末次給藥后，處死大鼠，分離雙側(cè)后肢股骨組織。采用骨密度儀檢測(cè)大鼠右股骨的BMD。

1.2.3 股骨生物力學(xué)性能檢測(cè)

采用機(jī)械測(cè)試儀，將垂直載荷施加到股骨的左中軸和左股骨頭的頂部，保持機(jī)械負(fù)荷速率5 mm/ min，直至股骨中軸和股骨頸斷裂。記錄斷裂負(fù)荷數(shù)據(jù)，包括彈性模量、剛度、最大應(yīng)力、最大承載力。

1.2.4 組織病理形態(tài)學(xué)觀察

將股骨近端組織以4%多聚甲醛固定48 h，用EDTA 脫鈣30 d，石蠟包埋，5 μm 厚切片，二甲苯中脫蠟，經(jīng)系列乙醇水合后，HE 染色，用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠股骨近端組織病理形態(tài)學(xué)。

1.2.5 股骨組織Wnt 和ERK mRNA 表達(dá)水平檢測(cè)

采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法。取大鼠股骨組織，在液氮中研磨成粉末，Trizol 法取總RNA，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳分別檢測(cè)RNA 的純度和濃度，以及RNA 的完整性。反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，37 ℃逆轉(zhuǎn)錄15 min，85 ℃逆轉(zhuǎn)錄5 s。Wnt，ERK，GAPDH 引物由中國(guó)寶酒生醫(yī)有限公司合成，序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件如下，95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，退火20 s，72 ℃延伸34 s（40 個(gè)循環(huán)）。反應(yīng)系統(tǒng)包括2 μL DNA 模板，0.4 μL PCR 反向引物（10 μmol/L），0.4 μL PCR正向引物（10 μmol/L），10 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ和7.2μL無(wú)菌蒸餾水。以GAPDH作內(nèi)參，并采用2-ΔΔCt法計(jì)算Wnt 和ERK mRNA的相對(duì)表達(dá)量。各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 Wnt，ERK，GAPDH引物序列Tab.1 Primer sequences of Wnt，ERK and GAPDH

1.2.6 股骨組織Wnt 和ERK 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用Western blot 法。取1.2.5 項(xiàng)下大鼠股骨組織粉末，加入含PMSF 的RIPA 裂解緩沖液提取總蛋白，以BCA 法檢測(cè)總蛋白質(zhì)含量。用10%SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。在含5%脫脂牛奶的TBST 中封閉1 h，加入抗Wnt，ERK，GAPDH 蛋白的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 清洗3 次，加入羊抗小鼠二抗，室溫振搖2 h，加入電化學(xué)發(fā)光底物蛋白質(zhì)，通過(guò)Image J 軟件將條帶灰度值數(shù)字化，目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值為各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 股骨BMD

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠BMD 顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，17β-雌二醇組及穿山龍總皂苷低、高劑量組大鼠BMD 顯著升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠股骨BMD比較（，n=20）Tab.2 Comparison of femoral BMD index of rats in each group（，n=20）

表2 各組大鼠股骨BMD比較（，n=20）Tab.2 Comparison of femoral BMD index of rats in each group（，n=20）

注：與正常對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05。下表同。Note：Compared with those in the normal control group，*P ＜0.05（for Tab.2-5）；Compared with those in the model group，#P ＜0.05（for Tab.2-5）.

2.2 股骨生物力學(xué)性能指標(biāo)

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠彈性模量、剛度、最大應(yīng)力、最大承載力均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，17β-雌二醇組及穿山龍總皂苷低、高劑量組大鼠的彈性模量、剛度、最大應(yīng)力、最大承載力均顯著升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠股骨生物力學(xué)性能指標(biāo)比較（，n=20）Tab.3 Comparison of biomechanical indexes of femoral bone in each group（，n=20）

表3 各組大鼠股骨生物力學(xué)性能指標(biāo)比較（，n=20）Tab.3 Comparison of biomechanical indexes of femoral bone in each group（，n=20）

2.3 股骨組織病理形態(tài)學(xué)

正常對(duì)照組大鼠股骨結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠股骨小梁稀疏，出現(xiàn)空骨空洞；17β-雌二醇組及穿山龍總皂苷低、高劑量組大鼠股骨遠(yuǎn)端小梁的形態(tài)結(jié)構(gòu)改善，股骨小梁密度增加，空骨腔減少，小梁排列有序，且穿山龍總皂苷低劑量組仍可見(jiàn)一定程度的骨質(zhì)疏松。詳見(jiàn)圖1。

2.4 股骨組織Wnt 和ERK mRNA 表達(dá)水平

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠股骨Wnt 和ERK mRNA 表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，17β-雌二醇組及穿山龍總皂苷低、高劑量組大鼠股骨Wnt和ERK mRNA 水平均顯著升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠股骨組織Wnt 和ERK mRNA 表達(dá)水平比較（，n=20）Tab.4 Comparison of the expression levels of Wnt and ERK mRNA in femur tissues of rats in each group（，n=20）

表4 各組大鼠股骨組織Wnt 和ERK mRNA 表達(dá)水平比較（，n=20）Tab.4 Comparison of the expression levels of Wnt and ERK mRNA in femur tissues of rats in each group（，n=20）

2.5 股骨組織Wnt 和ERK 蛋白表達(dá)水平

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠Wnt 和ERK 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，17β-雌二醇組及穿山龍總皂苷低、高劑量組大鼠股骨Wnt和ERK蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠股骨組織Wnt和ERK蛋白表達(dá)水平比較（，n=20）Tab.5 Comparison of the expression levels of Wnt and ERK protein in femur tissues of rats in each group（，n=20）

表5 各組大鼠股骨組織Wnt和ERK蛋白表達(dá)水平比較（，n=20）Tab.5 Comparison of the expression levels of Wnt and ERK protein in femur tissues of rats in each group（，n=20）

3 討論

骨質(zhì)疏松癥分為原發(fā)性和繼發(fā)性2種。前者常由衰老和性腺功能下降（如雌激素水平降低）而引起，后者常由其他健康問(wèn)題和藥物（如長(zhǎng)期使用皮質(zhì)類固醇激素治療）引起［9］。絕經(jīng)后婦女中約40%受骨質(zhì)疏松癥影響，且隨著人口老齡化程度的加劇，這一數(shù)字將持續(xù)增長(zhǎng)。目前臨床常使用的治療藥物包括雙膦酸鹽、抗RANKL、甲狀旁腺激素和雷奈酸鍶，均可降低初次和反復(fù)骨折的風(fēng)險(xiǎn)，但價(jià)格昂貴［10］。

本研究結(jié)果顯示，穿山龍總皂苷可改善去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度，逆轉(zhuǎn)股骨的微觀結(jié)構(gòu)，并增強(qiáng)生物力學(xué)性能。同時(shí)17β-雌二醇組及穿山龍總皂苷低、高劑量組大鼠股骨組織的Wnt 與ERK mRNA 和蛋白表達(dá)水平均高于模型組。提示穿山龍總皂能促進(jìn)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠股骨組織的Wnt 與ERK mRNA和蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而激活Wnt/ERK 信號(hào)通路。Wnt/ERK 信號(hào)通路參與包括骨骼組織在內(nèi)的許多組織的生長(zhǎng)、發(fā)育和維持的重要途徑［11］。經(jīng)典的Wnt/ERK 信號(hào)傳導(dǎo)極復(fù)雜，并受到廣泛的反饋控制。在無(wú)Wnt 配體的情況下，胞質(zhì)β-連環(huán)蛋白結(jié)合APC-Axin-GSK-3β降解復(fù)合物，而該復(fù)合物中的GSK-3β 磷酸化β-連環(huán)蛋白以誘導(dǎo)其蛋白體降解。當(dāng)Wnt蛋白與受體卷曲蛋白和共受體蛋白LRP5/6 結(jié)合時(shí)信號(hào)蛋白Dsh 被激活，導(dǎo)致絲氨酸/ 蘇氨酸激酶（GSK-3β）失活，從而抑制ERK 的泛素化和降解，導(dǎo)致ERK 聚集于細(xì)胞核中并與LEF-1/ TCF 結(jié)合，以上調(diào)成骨細(xì)胞中Wnt 靶基因Runx2 和Osx 的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增殖［12-14］。成骨細(xì)胞中的Wnt/ ERK 信號(hào)可誘導(dǎo)骨保護(hù)素（OPG）的表達(dá)，從而抑制破骨細(xì)胞的分化［15-16］。LI等［17］的研究顯示，成骨細(xì)胞的分化減弱，骨髓基質(zhì)細(xì)胞中的脂肪細(xì)胞分化增強(qiáng)，表明Wnt/ERK信號(hào)是促成骨細(xì)胞分化的決定因素［17］。ERK 是Wnt/ ERK 信號(hào)通路中的重要蛋白，小鼠ERK 突變失活，其骨量會(huì)明顯減少［18-20］。

綜上所述，穿山龍總皂苷能增加去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度，逆轉(zhuǎn)股骨的微觀結(jié)構(gòu)，并增強(qiáng)生物力學(xué)性能。其機(jī)制可能與促進(jìn)股骨組織Wnt與ERK mRNA和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而激活Wnt/ERK信號(hào)通路有關(guān)。