茴拉西坦對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用*

柴 娟，張瀟瀟，李 丹，徐沙麗

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢 430077）

腦缺血再灌注（I/R）損傷是嚴(yán)重的健康問(wèn)題［1］，其損傷機(jī)制復(fù)雜，其中炎性損害影響較大，可能成為潛在的治療靶點(diǎn)［2］。NLRP3 是重要的組織損傷傳感器，線粒體受損釋放線粒體DNA（mtDNA）和線粒體活性氧（mtROS）激活了NLRP3 炎性體［3］，NLRP3 直接與銜接子分子ASC 結(jié)合，后者隨后募集并激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前體（pro-caspase-1），促進(jìn)NLRP3炎性小體的細(xì)胞質(zhì)多蛋白復(fù)合物形成，該復(fù)合物能將前體白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和前體白細(xì)胞介素18（IL-18）裂解成活性形式，啟動(dòng)和放大炎性反應(yīng)［4］。NLRP3炎性體活性的功能障礙與多種疾病有關(guān)，如阿爾茨海默病、2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥［5］，同時(shí)NLRP3炎性體的激活可促進(jìn)腦I/R損傷的病理發(fā)展。激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）是主要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）反應(yīng)效應(yīng)物，參與多種疾病的進(jìn)程，其在細(xì)胞存活和死亡中的作用尚不完全清楚。嚴(yán)重或長(zhǎng)期的ERS 后，PERK-elF2α-ATF4-CHOP 信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活是ERS 誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞死亡的原因［6］。研究表明，在帕金森癥細(xì)胞模型中，ATF4可抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡［7-8］。茴拉西坦具有神經(jīng)保護(hù)作用，可保護(hù)模型大鼠和小鼠的大腦免受缺血性中風(fēng)的侵襲［9］。茴拉西坦可縮小中風(fēng)急性期缺血性腦梗死的面積，減少DNA片段化和線粒體細(xì)胞色素c釋放并抑制腦中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的活性。本研究中探討了茴拉西坦對(duì)局灶性腦I/ R 模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為腦I/ R 的治療提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：5-0 尼龍單絲（北京奇諾科技有限公司）；IMT-2 型倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）；StepOne Plus 型熒光定量PCR 儀（美國(guó)AB 公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）。

試藥：茴拉西坦（批號(hào)為ED63652.36）、尼莫地平（批號(hào)為XS52963.36），均購(gòu)自亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；聚L-賴氨酸（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)為SX85954）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑（大連寶生物科技有限公司，批號(hào)為DF4569.36）；Trizol 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司，批號(hào)為SE56969.36）；PrimeScriptRT 試劑盒（德國(guó)Merck 公司，批號(hào)為514489）；iCycler IQ 多色檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）；蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，批號(hào)為ER47636）；BCA 蛋白測(cè)定試劑盒（北京活力生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為T(mén)Y45858.36）；SDS-PAGE 凝膠（加拿大TakaraBioInc.，批號(hào)為6569748）；硝酸纖維素膜（美國(guó)Millipore公司，批號(hào)為WS152545.63）；小鼠單克隆抗人ATF4、NLRP3 一級(jí)（1∶1 000，1∶2 000，批號(hào)分別為ED4526.98，ER8597.54），小鼠單克隆抗人類GAPDH（1∶500 0，批號(hào)為XD41586.96），HRP 偶聯(lián)的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG（1∶5 000，批號(hào)為EC52564.74），均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；電發(fā)光ECL試劑盒（美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)為MN5254.67）。

動(dòng)物：SD 大鼠100 只，SPF 級(jí)，雌雄各半，8～10 周齡，體質(zhì)量280～300 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（渝）2020-0003。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境為溫度22～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，人工黑暗和光照交替12 h/12 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

模型復(fù)制與分組、給藥：將100 只SD 大鼠分為對(duì)照組（A 組，等體積0.9%氯化鈉溶液）、模型組（B 組，等體積0.9%氯化鈉溶液）、尼莫地平組（C組，50 mg/kg），以及茴拉西坦低、高劑量組（D1組、D2組，50，100 mg/kg）［10］，各20只。腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉大鼠，然后在腹中線頸部切口，向左暴露并結(jié)扎左頸總動(dòng)脈和外頸動(dòng)脈。將5-0 尼龍單絲的末端涂有聚L-賴氨酸的鈍頭插入頸內(nèi)動(dòng)脈，并向前進(jìn)入大腦中動(dòng)脈起源，直至遇到輕微阻力，局部腦血流量（CBF）較基線水平降低20%；閉塞1 h 后，緩慢抽出尼龍單絲實(shí)現(xiàn)再灌注，CBF為基線的75%表明局灶性腦I/ R 大鼠模型復(fù)制成功。建模成功后灌胃相應(yīng)藥物或等體積0.9%氯化鈉溶液（每100 g體質(zhì)量1 mL），每日1次，連續(xù)4周。

雙側(cè)貼紙去除時(shí)間、平衡木過(guò)桿時(shí)間、Longa 評(píng)分、腦梗死體積測(cè)定：進(jìn)行貼紙去除及平衡木行走實(shí)驗(yàn)［8-9］。采用Longa 評(píng)分評(píng)價(jià)腦神經(jīng)功能。4 分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失；3 分，身體向左側(cè)傾倒；2 分，自主運(yùn)動(dòng)時(shí)向左側(cè)劃圈；1分，不能伸展左側(cè)前爪；0分，無(wú)神經(jīng)功能損傷癥狀。測(cè)定腦梗死體積，并計(jì)算腦梗死體積百分比（右側(cè)腦梗死面積× 切片厚度/ 右側(cè)腦組織總體積×100%）。

腦病理組織學(xué)改變觀察：取出腦組織，固定，脫水，包埋，切片，HE 染色，在顯微鏡下觀察大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)。

ATF4 和NLRP3 mRNA 表達(dá)水平測(cè)定：取凍存的大鼠腦組織樣本50 mg，采用Trizol 法提取 總RNA，鑒定完RNA 純度和完整性后，采用逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。PCR反應(yīng)條件為，95 ℃預(yù)變性10 s；94 ℃變性15 s，40 個(gè)循環(huán)；55 ℃退火30 s；70 ℃延伸30 s終止反應(yīng)。讀取循環(huán)閾值（Ct值），以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA 的表達(dá)量。各組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。由RiboBio（中國(guó)廣州）設(shè)計(jì)的ATF4，NLRP3引物。引物序列為ATF4，5'-GAAGCTCCTACGCCTTTG-3'，5'-TCCTCCCTTCAACATTCTG-3'；NLRP3，5'-AGGGTTCACAGTGGCTAAG-3'，5'-GAGAGGAGAGGAAGAGGGAA-3'；GAPDH，5'-TCCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3'，5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3'。

ATF4 和NLRP3 蛋白表達(dá)水平測(cè)定：取凍存的大鼠腦組織樣本50 mg，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解緩沖液，以BCA 法測(cè)定蛋白含量。各組取20 μg，上樣，10% SDS-PAGE 電泳后電轉(zhuǎn)。用含0.1%Tween-20 Tris緩沖液的5%脫脂奶粉封閉2 h；加入1抗，4 ℃孵育過(guò)夜；加入HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG，室溫振搖1 h；加入ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，將PVDF 膜放入暗盒中，壓上X 膠片，取出膠片后顯影、定影、清洗；然后以Quantity One 軟件將條帶灰度值數(shù)字化，以目的條帶（ATF4，NLRP3）與內(nèi)參條帶（GAPDH）灰度比值為各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 雙側(cè)貼紙去除時(shí)間、平衡木過(guò)桿時(shí)間、Longa 評(píng)分、腦梗死體積

與A 組比較，B 組大鼠雙側(cè)貼紙去除時(shí)間和平衡木過(guò)桿時(shí)間均顯著延長(zhǎng)，腦梗死體積增大，Longa 評(píng)分顯著升高（P ＜0.05）；與B 組比較，C 組、D1組和D2組大鼠雙側(cè)貼紙去除時(shí)間、平衡木過(guò)桿時(shí)間均顯著縮短，腦梗死體積顯著縮小，Longa 評(píng)分顯著降低（P ＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠雙側(cè)貼紙去除時(shí)間、平衡木過(guò)桿時(shí)間、Longa評(píng)分、腦梗死體積比較（，n=20）Tab.1 Comparison of bilateral sticker removal time，balance beam passing time，Longa score and cerebral infarction volume of rats in each group（，n=20）

表1 各組大鼠雙側(cè)貼紙去除時(shí)間、平衡木過(guò)桿時(shí)間、Longa評(píng)分、腦梗死體積比較（，n=20）Tab.1 Comparison of bilateral sticker removal time，balance beam passing time，Longa score and cerebral infarction volume of rats in each group（，n=20）

注：與A組比較，*P ＜0.05；與B組比較，#P ＜0.05。表2同。Note：Compared with those in group A，*P ＜0.05（for Tab.1 and Tab.2）；Compared with those in group B，*P ＜ 0.05（for Tab.1 and Tab.2）.

2.2 腦組織病理形態(tài)學(xué)

A 組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)細(xì)胞均勻分布，無(wú)異常；B 組大鼠腦組織出現(xiàn)空泡壞死灶，神經(jīng)細(xì)胞體積變大（壞死），分布紊亂，可見(jiàn)顯著炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；C 組、D1組和D2組大鼠的腦組織結(jié)構(gòu)均趨于正常，神經(jīng)細(xì)胞壞死顯著減少。詳見(jiàn)圖1。

2.3 腦組織ATF4 和NLRP3 mRNA 表達(dá)水平

與A組比較，B組大鼠腦組織ATF4 mRNA表達(dá)水平顯著降低，NLRP3 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P ＜0.05）；與B 組比較，C 組、D1組和D2組大鼠腦組織ATF4 mRNA表達(dá)水平均顯著升高、NLRP3 mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P ＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腦組織ATF4和NLRP3 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較（，n=20）Tab.2 Comparison of ATF4 and NLRP3 mRNA and protein expression levels in brain tissue of rats in each group（，n=20）

表2 各組大鼠腦組織ATF4和NLRP3 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較（，n=20）Tab.2 Comparison of ATF4 and NLRP3 mRNA and protein expression levels in brain tissue of rats in each group（，n=20）

2.4 腦組織ATF4 和NLRP3 蛋白表達(dá)水平

與A 組比較，B 組大鼠腦組織ATF4 蛋白表達(dá)水平顯著降低，NLRP3 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P ＜0.05）；與B組比較，C組、D1組和D2組大鼠腦組織ATF4 蛋白表達(dá)水平均顯著升高，NLRP3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P ＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，C 組、D1組和D2組大鼠雙側(cè)貼紙去除時(shí)間、平衡木過(guò)桿時(shí)間均短于模型組，腦梗死體積小于B 組，Longa 評(píng)分低于B 組（P ＜0.05）。表明茴拉西坦能縮小局灶性腦I/ R 模型大鼠腦梗死體積，其高劑量效果與尼莫地平相似。尼莫地平為鈣拮抗劑，用于缺血性腦血管病、偏頭痛、輕度蛛網(wǎng)膜下腔出血所致腦血管痙攣的治療，是腦I/R 損傷的經(jīng)典治療藥物［11］。茴拉西坦屬拉西坦類腦細(xì)胞代謝藥，能增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞突觸內(nèi)磷脂酶活性，并增加腦內(nèi)三磷酸腺苷（ATP）的形成和轉(zhuǎn)運(yùn)，增加蛋白質(zhì)和核糖核酸（RNA）的合成，促進(jìn)大腦對(duì)氨基酸、磷脂、葡萄糖和氧的利用，增加機(jī)體反應(yīng)性和興奮性［12］?？诜罾魈箍娠@著抑制硫代巴比妥酸反應(yīng)性物質(zhì)的生成，并減緩前腦I/ R 后大鼠腦中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）的流失［13］。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)論一致。

茴拉西坦可降低大腦中動(dòng)脈閉塞后大鼠的腦內(nèi)細(xì)胞炎性反應(yīng)和氧化損傷，對(duì)腦I/R 具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制與減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)［14］。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)細(xì)胞均勻分布，無(wú)異常；模型組大鼠腦組織出現(xiàn)空泡壞死灶，神經(jīng)細(xì)胞體積變大（壞死），分布紊亂，可見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；尼莫地平組及茴拉西坦低、高劑量組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)趨于正常，神經(jīng)細(xì)胞壞死明顯減少。提示茴拉西坦能減輕灶性腦缺血再灌注大鼠腦神經(jīng)炎性反應(yīng)，與上述結(jié)論一致。

多項(xiàng)研究表明，活化的NLRP3 炎性小體及其相關(guān)細(xì)胞因子對(duì)腦I/ R 損傷有顯著影響［15］。使用siRNA 敲除NLRP3 可減輕腦I/ R 損傷［16］。ATF4 屬細(xì)胞保護(hù)因子，ATF4 上調(diào)在魚(yú)藤素介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡中具有保護(hù)作用；ATF4 誘導(dǎo)的sestrin 2 上調(diào)是保護(hù)一氧化碳誘導(dǎo)肝脂肪變性的原因。目前，ATF4對(duì)腦I/R損傷的作用及其潛在機(jī)制均未完全闡明。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ATF4的過(guò)表達(dá)降低了腦I/R 損傷后IL-1β，IL-18，mtROS及活化的NLRP3 炎性小體水平［17］?？梢?jiàn)，ATF4 可能通過(guò)抑制NLRP3炎性體的活化而在腦I/R 損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。在短暫性腦缺血性損傷中，ATF4可能通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子CHOP 而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致神經(jīng)細(xì)胞凋亡［18］。本研究結(jié)果顯示，尼莫地平組及茴拉西坦低、高劑量組大鼠腦組織ATF4 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平均高于模型組，NLRP3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平低于模型組（P ＜0.05），表明茴拉西坦通過(guò)促進(jìn)局灶性腦I/ R 模型大鼠腦組織ATF4 的表達(dá)而抑制NLRP3 的表達(dá)，與上述結(jié)論一致。

綜上所述，茴拉西坦對(duì)I/ R 模型大鼠具有一定神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制與促進(jìn)大鼠腦組織ATF4 表達(dá)、抑制NLRP3表達(dá)有關(guān)。