低甲氧基果膠在乳品中的應用及其制備方法研究進展

李夢洋，朱佳奕，孫慶申

（1.黑龍江大學 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500；2.黑龍江大學生命科學學院，黑龍江省普通高等學校分子生物學重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；3.黑龍江大學生命科學學院，黑龍江省普通高等學校微生物重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080）

果膠存在于植物的胞間層和初生壁中，能夠維持植物細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，同時，果膠作為益生元，可調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、促進腸道蠕動、提高人體的消化吸收能力[1]等。果膠具有凝膠性、增稠性及穩(wěn)定性，使其可應用在多種食品中，例如果醬、酸乳、果凍等。

植物源果膠大多為高甲氧基果膠（high methoxyl pectin，HMP），而低甲氧基果膠（low methoxyl pectin，LMP）較少。但因為LMP具有特殊的結(jié)構(gòu)特性，能夠與2價金屬離子交聯(lián)，形成凝膠結(jié)構(gòu)，使其在藥物及益生菌遞送方面應用廣泛[2-3]，因此，采取不同的方法將HMP轉(zhuǎn)化為LMP，特別是獲得特定結(jié)構(gòu)的LMP，如block-wise果膠分子[4]，具有重要的研究及應用價值。本文首先概述果膠的結(jié)構(gòu)及其在乳品中的應用現(xiàn)狀，在此基礎上闡述目前制備LMP的不同方法及各方法對于果膠結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的影響，目的是全面闡述基于構(gòu)效關系的LMP制備方案，為進一步拓展果膠在食品，特別是乳制品中的應用提供理論參考。

1 果膠結(jié)構(gòu)概述

果膠由富含半乳糖醛酸的主鏈和同聚半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonans，HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖-Ⅰ（rhamnogalacturonan type Ⅰ，RG-Ⅰ）、鼠李半乳糖醛酸聚糖-Ⅱ（rhamnogalacturonan type Ⅱ，RG-Ⅱ）及木糖半乳糖醛酸聚糖構(gòu)成[5]（圖1）。

圖1 果膠分子結(jié)構(gòu)示意圖[5]Fig. 1 Schematic diagram of pectin molecules[5]

HG區(qū)也稱作“平滑區(qū)”，基本骨架由α-1,4糖苷鍵連接的半乳糖醛酸構(gòu)成[6]，該區(qū)域中酯化半乳糖醛酸殘基和所有酯化殘基的比例及分布直接影響果膠的溶解性、凝膠性、增稠性及水合特性。同時，HG鏈上的乙酰基對鈣離子介導的凝膠性也有影響。從甜菜、土豆及向日葵中提取的果膠在HG鏈上的O-2或O-3處可能會發(fā)生乙?；?；乙?；牧Ⅲw效應在一定程度上阻止了鈣離子接近2 個相鄰的羧基，從而降低陽離子與果膠分子的結(jié)合強度，結(jié)合物的穩(wěn)定性也有所下降，該阻礙效應甚至能夠完全抑制果膠凝膠化的形成；HG鏈的分支程度（支化度）也影響果膠的凝膠性，果膠分子的支化度越低，與鈣離子的交聯(lián)則越有利，反之，支鏈過多會導致凝膠性變差[7-8]。

RG-Ⅰ結(jié)構(gòu)的基本骨架由交替的α-D-半乳糖醛酸-1,2-α-L-鼠李糖-1,4單元構(gòu)成[5]，其中的鼠李糖（Rha）殘基可以被阿拉伯聚糖、半乳糖或阿拉伯半乳聚糖側(cè)鏈取代[9]，因此，RG-Ⅰ的支化度通常根據(jù)RG-Ⅰ側(cè)鏈的阿拉伯糖和半乳糖與鼠李糖的物質(zhì)的量比計算。HG區(qū)和RG-Ⅰ區(qū)的鏈長、單糖組成和連接方式的變化對不同果蔬中果膠性質(zhì)影響較大。例如，HG和RG-Ⅰ區(qū)連接的大量阿拉伯糖側(cè)鏈會導致果膠具有較高的黏度，能被應用于凝膠和增稠方面；此外，RG-Ⅰ區(qū)與半纖維素相連有利于維持細胞壁的穩(wěn)定性[10]。

RG-Ⅱ區(qū)被認為是最復雜、高度保守的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域以半乳糖醛酸作為骨架，兩邊是由12 種不同的糖以20 種不同的連接方式組成的復雜結(jié)構(gòu)；雖然RG-Ⅱ區(qū)在整個分子中占有較低的比例，但因其通過硼原子共價連接形成的二聚體參與細胞壁內(nèi)果膠分子的交聯(lián)作用而至關重要[11]。

果膠主鏈中有一部分半乳糖醛酸殘基在C-6位置會被甲酯化，甲酯化的半乳糖醛酸和總半乳糖醛酸的物質(zhì)的量比即為果膠的酯化度[12]。酯化度大于50%為HMP，酯化度小于50%則為LMP，酯化度對果膠的功能性質(zhì)及應用有一定影響[13-14]。

HMP在早期主要應用于高糖食品的制作，如果汁飲料和酸乳的增稠[15-16]、果醬的凝膠[17]等方面，因為HMP凝膠形成要求的條件較高，即含糖量需高于55%、pH 2.5～3.5才能形成凝膠，而LMP的凝膠性不受pH值和可溶性固形物含量的影響[18]，因此LMP在食品工業(yè)中廣泛應用于制作低糖酸乳[19]、果醬[20]及食品包裝膜[21]等。

果膠的結(jié)構(gòu)對其生物活性起著決定性作用[22]，因早期應用果膠更關注于其凝膠性質(zhì)，因此果膠提取目的在于盡可能提高HG的含量。但RG-Ⅰ區(qū)往往比果膠多糖中的HG區(qū)更具活性，且RG-Ⅰ在果膠結(jié)構(gòu)的完整性中起著關鍵作用，因此現(xiàn)在的提取工藝目的在于體現(xiàn)果膠中RG-Ⅰ結(jié)構(gòu)的重要性[23]。在工業(yè)生產(chǎn)中，從天然植物中提取的果膠大多為HMP，具有抗癌[24]、降血脂[25]及作為益生元刺激腸道菌群生長等作用，但因其溶解度較低且不易被腸道吸收而無法完全作用于人體。為了增加天然果膠的生物利用度，人們開始嘗試對果膠進行改性。商業(yè)上通常使用從橘皮、蘋果渣等天然植物中提取HMP后通過改變果膠的分子結(jié)構(gòu)及分子質(zhì)量制得應用范圍更廣、凝膠條件更簡單的LMP。

2 LMP在乳品中的應用

LMP作為增稠劑和穩(wěn)定劑在發(fā)酵乳（特別是凝固型酸乳）中應用廣泛[26]，汪倩[27]的研究證明，適量的LMP與明膠復配，可使制得的酸乳擁有更加柔軟、順滑的質(zhì)地，果膠本身具有的果香味也可為酸乳增加特殊的風味，且在色澤、香氣、口感、質(zhì)地、穩(wěn)定性等方面均優(yōu)于空白組。果膠還可改善酸乳飲料的穩(wěn)定性和質(zhì)地[28]，增加產(chǎn)品的界面吸附力，從而提高產(chǎn)品穩(wěn)定性[29]。田亞紅[30]從甘薯渣中提取出LMP作為酸乳的增稠劑，結(jié)果表明，果膠對凝固型酸乳的穩(wěn)定性發(fā)揮著重要作用。Wang Hao等[31]的研究證實，LMP作為發(fā)酵乳制品中的增稠劑，在不改變山羊乳原有風味的基礎上，能夠賦予產(chǎn)品良好的流變性質(zhì)及粒度分布，顯著提高保水性、黏度和質(zhì)構(gòu)特性。LMP能夠作為多層乳液中的穩(wěn)定劑，提高產(chǎn)品穩(wěn)定性[32]。Sun Weixuan等[33]將LMP加入酸乳飲品中，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品的黏度上升，流動性、乳清分離度均有所下降。石然然[34]將豆腐柴葉中提取的LMP加入發(fā)酵乳中，所制得的發(fā)酵乳具有細膩、順滑的感官特性，且不改變發(fā)酵乳原有風味。Letendre等[35]利用LMP和瓊脂制得的可食用牛乳蛋白膜在增加水分屏障的同時，其穿刺強度也有所提高。Khubber等[36]研究表明，在酸乳中添加1%的LMP可使乳清損失率降低31.16%，同時增加酸乳中可溶性固形物含量，改善低脂凝固型酸乳的硬度、流變性、質(zhì)量和整體口感，還可以提高抗氧化活性。劉新新等[37]在酸乳中加入不同酯化度的LMP，結(jié)果顯示，LMP能有效提高酸乳的黏度、持水力及質(zhì)構(gòu)特性。Protte等[38]按照5∶1的質(zhì)量比在酸乳中加入乳清蛋白和LMP，使固形物含量增加，具有類似奶油的性質(zhì)[39]。Li Mengyang等[2]利用LMP包埋短雙歧桿菌，添加到酸乳中，在貯藏期及模擬胃腸道處理后，大大提高了短雙歧桿菌的活菌數(shù)量，為高活性益生菌酸乳研究提供了參考。此外，李夢洋等[39]利用LMP將短雙歧桿菌包埋以后，研制出微膠囊奶片。

上述研究顯示，LMP在乳品中的應用已不僅僅局限于作為增稠劑、穩(wěn)定劑等，基于LMP能夠與2 價金屬離子通過離子交聯(lián)形成微膠囊，并以其作為益生菌、其他食品活性成分的遞送載體來開發(fā)新一代功能性乳制品將越來越受到乳制品行業(yè)的青睞，為此，通過各種不同方案制備LMP具有重要的理論意義和應用價值。

3 LMP的制備方法

3.1 酸法脫酯

酸法脫酯是利用高溫、強酸條件去除HMP上的甲氧基，使其轉(zhuǎn)變?yōu)長MP[40]。該法制得的改性果膠分子內(nèi)中性糖及RG-Ⅰ數(shù)量下降，而同型半乳糖醛酸聚糖的相對分子質(zhì)量則變化不大，果膠分子中的支鏈結(jié)構(gòu)變得更加緊湊，且所占空間變小[41]。Thibault等[42]利用0.1 mol/L HCl溶液對HMP進行改性，發(fā)現(xiàn)水解物的固有黏度降低，原因是HMP分子主鏈中的半乳糖醛酸殘基之間的鍵發(fā)生斷裂，糖殘基不斷被釋放。李瑞華[43]的研究證明：在50 ℃條件下，利用1 mol/L HCl對蘋果果膠脫酯8～18 h，樣品的甲氧基含量從71%降低到2.7%～6.7%，即從HMP轉(zhuǎn)變?yōu)長MP；反應的前12 h內(nèi)，果膠的甲氧基含量隨時間延長而不斷下降，12 h后，果膠甲氧基含量下降趨勢逐漸平緩。

利用酸化乙醇脫去果膠分子中的甲基同樣屬于酸法脫酯，并且廣泛應用于LMP工業(yè)生產(chǎn)中。Kurita等[44]利用乙醇-檸檬酸溶液能使改性果膠分子間的氫鍵數(shù)目及羰基數(shù)量均有所上升，結(jié)構(gòu)變得更為緊密。楊東輝等[45]用硫酸提取蘋果渣中的果膠，之后用乙醇沉淀、脫酯得到LMP，這是目前工業(yè)生產(chǎn)LMP的常用方法。但是使用該法脫酯會引起果膠分子鏈酸水解，果膠相對分子質(zhì)量下降[46]。韓莎莎[47]對不同溫度、pH值及處理時間對柚皮果膠脫酯得率的影響進行研究，結(jié)果顯示，在pH 1.5、溫度80 ℃、處理時間100 min時脫酯效果最佳。陳穎等[48]使用商業(yè)HMP在傳統(tǒng)酸法改性的基礎上加入果膠酶進行脫酯，將酯化度降為10%，即使經(jīng)超濾后，酯化度也無明顯變化。

3.2 堿法脫酯

堿法脫酯能去除果膠分子上的甲基，并將同型半乳糖醛酸轉(zhuǎn)化為聚半乳糖醛酸[49]。Wai等[50]利用堿法脫酯制備的LMP中游離羧基較降酯之前有所增加，并且消除了RG-Ⅰ結(jié)構(gòu)域上的阿拉伯糖殘基。Tamaki等[51]用堿法脫酯制得改性果膠，其分子中的RG-Ⅰ結(jié)構(gòu)變短并且支鏈的長度也有所減小。雖然堿法脫酯的效率較酸法高，但缺點是脫酯過程中發(fā)生的β-消除反應會導致果膠解聚，進而影響果膠的相對分子質(zhì)量及凝膠性。利用該法脫酯過程中，隨著反應體系pH值的變化，中間產(chǎn)物積累會抑制氧化反應的繼續(xù)進行[52]。β-消除反應僅發(fā)生在相鄰的經(jīng)甲酯化的半乳糖醛酸間的糖苷鍵位置，因此HMP發(fā)生β-消除反應的概率高于LMP，且受反應溫度和pH值的影響[53]。β-消除反應只能通過低溫減緩消除反應的影響，而無法完全去除[54]。Pillai等[55]對柑橘果膠進行堿法脫酯，改變果膠的酯化度和嵌段型，使果膠相對分子質(zhì)量發(fā)生改變，果膠分子中非甲酯化的半乳糖醛酸隨機分布，使分子鏈更加緊密。覃章龍等[56]利用強堿降低橙皮HMP的酯化度，反應過程中產(chǎn)生的β-消除反應使得果膠分子中的半乳糖醛酸含量有所下降。Willats等[57]證實，用真菌果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）處理后，再利用堿法脫酯，制備完全脫酯果膠，使果膠酯化度及半乳糖醛酸含量均降低且黏度等性質(zhì)也發(fā)生一定的改變。Platt等[58]研究證明，將果膠置于pH 10.0的堿性溶液中反應10 min后，果膠半乳糖含量增加，同時具有降低癌細胞轉(zhuǎn)移速率的效果。同樣，Pratima等[59]發(fā)現(xiàn)，在堿性條件下制備的果膠可以顯著抑制小鼠乳腺癌細胞的增殖。Fraeye等[60]利用堿法處理制得的蘋果LMP酯化度為24%和30%，同時證明在一定范圍內(nèi)，酯化度越低，其凝膠特性越強，但過低的酯化度會使果膠凝膠變?yōu)榇嘈浴Ｇ粭畹萚61]以蘋果渣作為堿法脫酯的原料，探究出最優(yōu)工藝條件為pH 10.14、脫酯時間30 min、反應溫度15 ℃，在此條件制備的果膠酯化度為38%。徐慧[62]利用堿法脫酯技術(shù)，將提取到的酯化度71.2%的辣椒果膠在pH 9、溫度10 ℃、脫酯時間60 min的條件下制備出酯化度為48.3%的LMP。由上述研究結(jié)果可知，不同來源的果膠，其堿法脫酯的條件及方式均不相同，不同方式脫酯后的果膠結(jié)構(gòu)及性質(zhì)也有一定差別，因此，可根據(jù)所需目的采取不同堿法脫酯條件制備LMP。

3.3 酶法改性

酶法改性主要通過內(nèi)源酶和外源酶進行處理，內(nèi)源酶通常利用Na2CO3等激活劑激活果膠內(nèi)的PME，外源酶主要是指直接添加PME，從而達到脫酯目的。水果成熟過程中果皮和果肉所經(jīng)歷的由硬變軟的過程即為水果中內(nèi)源酶作用的結(jié)果。PME的高度專一性代表了該酶能準確、高效地切斷果膠分子鏈中多聚半乳糖殘基上的羧基基團，生成甲醇及游離羧基[63]，使果膠分子主鏈中的HG結(jié)構(gòu)域發(fā)生解聚，果膠酯化度下降，相對分子質(zhì)量呈現(xiàn)小幅度下降，并催化可溶性果膠變?yōu)楣z酸[64]。

3.3.1 內(nèi)源酶法

新鮮的果皮本身含有大量的PME，但是在水果成熟過程中，酶的活性會逐漸減弱，因此可以借助添加激活劑等方式以提高酶的活性。雷激等[64]利用Na2CO3作為激活劑，以激活橘皮中的PME，從而降低橘皮果膠酯化度，確定出制備LMP的最佳工藝為Na2CO3添加量為果皮漿液的0.15%、溫度控制在45 ℃，pH值為8.0，反應1 h后制得酯化度為36.38%的改性果膠。高雪等[65]在柚皮中添加Na2CO3激活劑制備LMP，最終得到酯化度為5.9%的改性果膠且得率較高。劉鳳霞等[66]利用堿性溶液結(jié)合高壓處理橘皮果膠，誘導PME脫酯制得LMP。上述研究表明利用不同條件誘導果膠中原有的甲酯酶降低甲氧基化度的可行性，該法條件溫和，能夠降低使用酶制劑的成本，但該法脫酯的過程中，除了PME，還存在果膠水解酶，該酶能夠使果膠分子主鏈發(fā)生水解，從而導致制得的LMP品質(zhì)下降[67]。

3.3.2 外源酶法

外源酶法是通過直接添加PME制得LMP，該法雖成本較高，但制得的LMP質(zhì)量與內(nèi)源酶法相比大大提高。目前，商業(yè)PME的提取來源為黑曲霉，制得的改性果膠與酸法及堿法對比，酶法脫酯更加精確可控，脫酯后的LMP分子中的HG結(jié)構(gòu)域中游離的半乳糖醛酸分布變?yōu)槠问浇Y(jié)構(gòu)，且純度較高的PME不會導致果膠分子鏈出現(xiàn)顯著的降解反應。Pillai等[68]利用PME對柑橘果膠進行酶法脫酯，在不改變果膠相對分子質(zhì)量的前提下，相鄰的非甲酯化半乳糖醛酸基團的嵌段數(shù)量有所增加。

我國研究酶法改性LMP歷史較短，2004年，焦云鵬[69]利用HMP誘導黑曲霉制得PME，該酶能降低18.84%的酯化度。Zhao Wenting等[70]利用超高壓輔助酶法降低果膠酯化度，從而制備LMP，得到的果膠半乳糖醛酸含量與傳統(tǒng)堿法相比相差無幾，2 種方法制備的果膠相對分子質(zhì)量分布同樣差別不大，但超高壓輔助酶法制備的果膠黏度高于堿法制備的LMP。Sun Qingshen等[71]利用PME去除HMP的甲氧基，得到具有特征結(jié)構(gòu)的改性LMP，將其酯化度從72%降低到35%。Buchholt等[72]使用PME制備低甲氧基的甜菜渣果膠，結(jié)果表明，改性果膠中酯基的分布較其他降酯方式制得的果膠酯基分布不均，原因可能是乙?；鶊F阻礙了酶對底物的作用。Lee等[4]對酶法改性制得的柑橘果膠進行分析，結(jié)果表明，PME增加了果膠分子中鄰近的脫酯基團，同時降低了連續(xù)酯基基團的數(shù)量，使其彈性增加，并且使改性果膠具備特殊功能及較強的凝膠功能。

李川[67]將酶法和堿法所制得的不同改性橘皮果膠進行多種指標對比分析后，證明了利用酶法脫酯制得的LMP提取率、半乳糖醛酸及黏均分子質(zhì)量均優(yōu)于堿法。有學者為了改善酶法脫酯工藝，將酶固定化，如范洋[73]利用海藻酸鈉固定PME后，利用其對HMP進行脫酯，得到酯化度為29.8%的改性果膠，且得率為97.7%。在工業(yè)生產(chǎn)中，由于酶制劑的價格昂貴，制約了工業(yè)酶法改性LMP的應用，相信隨著研究人員對于不同果膠酯酶提取來源的研究，果膠酯酶的價格能夠降低并且廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)中[74]。

3.4 酰胺化法

酰胺化法是利用氨對果膠進行處理，使甲氧基含量下降，從而降低果膠分子中甲氧基的含量，得到的改性果膠也稱為酰胺化果膠。該過程中存在氨解、水解、β-消除3 種反應，β-消除使得果膠的分子質(zhì)量下降的原因是：β-消除反應所產(chǎn)生的雙鍵會使果膠分子鏈發(fā)生斷裂；氨解反應使果膠分子中的酰胺基數(shù)量上升，而水解反應使果膠分子中羧基數(shù)量增多，二者都是脫酯過程，使果膠的酯化度降低，因此均可稱為脫酯反應。由于有氨基基團進入果膠分子中，與普通LMP相比，酰胺化果膠形成凝膠所需的鈣離子濃度范圍更大，例如，酯化度相同的LMP與酰胺化果膠形成最佳凝膠的鈣離子濃度也相同，但是酰胺化果膠在更大的鈣離子濃度范圍內(nèi)也能夠形成凝膠[75]。蘇東林等[76]對制得的柑橘HMP進行酰胺化處理，實驗證明，在不同條件下獲得的不同產(chǎn)物，其酰胺化度、酯化度及黏度均符合國際標準。酰胺化果膠的生產(chǎn)工藝在國外研究較為成熟，但國內(nèi)仍然研究較少，當前研究熱點為酰胺化果膠的理化性質(zhì)及應用前景[77]。

4 結(jié) 語

LMP在乳品中的應用已證明具有很多有益效果，包括增強乳制品黏度、改善風味、提高穩(wěn)定性等，因此是一種非常好的天然添加劑。各種制備LMP的方法中，酸法脫酯制得的LMP分子內(nèi)的中性糖及RG-Ⅰ會發(fā)生降解；堿法脫酯操作簡單，價格低廉，被廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)中，能將相對分子質(zhì)量較高的同型半乳糖醛酸變?yōu)橄鄬Ψ肿淤|(zhì)量較低的聚半乳糖醛酸，但因其脫酯過程中產(chǎn)生的β-消除反應會解聚果膠分子結(jié)構(gòu)，影響其功能；酶法脫酯的優(yōu)勢在于環(huán)保、針對性強且易于操控，但因不同來源的PME價格較高，目前無法廣泛應用于工業(yè)中。酰胺化果膠對鈣離子的敏感性較普通LMP低，在西方工業(yè)中使用廣泛。我國對于LMP的需求目前仍然依賴于大量進口，成本較高，因此對于LMP提取及改性的工藝條件需要進一步研究。