甲基磺酸乙酯誘變西瓜種子的條件優(yōu)化

趙 展，王曉婷，李 林，侯晟燦，霍治邦，張新成

（1.開封市農(nóng)業(yè)物聯(lián)網(wǎng)工程技術(shù)中心·河南省高標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)田智能灌溉工程研究中心·開封大學(xué)信息工程學(xué)院河南開封 475004； 2.開封市農(nóng)林科學(xué)研究院 河南開封 475004）

西瓜是我國重要的蔬菜型水果，因其品質(zhì)好、瓤質(zhì)細(xì)、抗病強等特點而深受消費者和生產(chǎn)者的喜愛和信賴，具有很重要的經(jīng)濟(jì)價值。但在西瓜長期育種過程中，由于育種目標(biāo)大多單一，使得西瓜種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)越來越狹窄，進(jìn)而使西瓜的產(chǎn)量、品質(zhì)等重要性狀在生產(chǎn)上均受到較大限制；且單一化的種質(zhì)資源也讓西瓜病害越來越嚴(yán)重，常給生產(chǎn)者帶來無法挽回的經(jīng)濟(jì)損失。鑒于此，在西瓜遺傳育種過程中，利用現(xiàn)代育種技術(shù)和方法創(chuàng)新種質(zhì)資源，拓寬其遺傳基礎(chǔ)就顯得尤為重要。

目前，利用物理誘變方法和化學(xué)誘變方法對作物進(jìn)行誘變育種已成為選育新品種、創(chuàng)新種質(zhì)資源的有效手段?；瘜W(xué)誘變方法主要是利用化學(xué)誘變劑（如烷化劑、疊氮化物、堿基類似物等）對植物進(jìn)行誘導(dǎo)變異，具有周期短、頻率高、范圍廣等特點，能夠在較短時間內(nèi)獲得大量突變體材料，這些材料直接或間接地應(yīng)用于新品種和新種質(zhì)資源的選育。甲基磺酸乙酯（EMS，ethyl methanesulfonste）是一種高效穩(wěn)定且應(yīng)用廣泛的化學(xué)誘變劑，在誘變過程中，能夠使DNA 分子發(fā)生較多點突變，染色體畸變減少，并通過置換其他分子中的氫原子使得一些堿基烷基化而誘導(dǎo)突變。大量研究結(jié)果表明，要獲得良好的誘變效果，必須要有適宜的誘變劑量（誘變劑量=誘變液濃度×處理時間），通常把誘變處理后50.00%植株存活的劑量即半致死劑量作為選擇依據(jù)。弭寶彬等研究發(fā)現(xiàn)EMS 誘變冬瓜種子時最佳的誘變條件為1.20%EMS 誘變12 h，此時冬瓜種子發(fā)芽率、成苗率分別為54.67%、51.83%，接近半致死劑量。黃東福等對農(nóng)作物EMS 的誘變條件進(jìn)行分析后表明大部分作物的EMS 誘變半致死劑量在1.00%以內(nèi)，且處理時間集中在4～8 h 時，可以獲得較好的誘變效果。

以開封市農(nóng)林科學(xué)研究院的高代自交系石紅為研究材料，采用6 個處理濃度（0.40%、1.00%、1.20%、1.40%、1.60%和2.00%）和5 個處理時間（4、10、12、14、16 h）相互組合的方式，對西瓜種子進(jìn)行了EMS 誘變最佳條件的篩選，通過對誘變處理后種子的發(fā)芽率和相對發(fā)芽率進(jìn)行分析，獲得EMS誘變西瓜種子的最佳誘變劑量，為構(gòu)建西瓜突變體庫，創(chuàng)制新的種質(zhì)資源，進(jìn)而深入研究西瓜的基因組和拓寬西瓜的遺傳背景奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試西瓜材料為高代自交系石紅，由開封市農(nóng)林科學(xué)研究院西瓜研究所提供。EMS 誘變劑（水劑）購自Sigma 公司。試驗于2020 年7 月26 日至8 月初在開封大學(xué)信息工程學(xué)院農(nóng)業(yè)物聯(lián)網(wǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)實驗室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 EMS 溶液的配制方法 EMS 誘變劑用pH 7.0 的0.1 mol·L磷酸緩沖液配制成0.40%、1.00%、1.20%、1.40%、1.60%和2.00%的溶液。

1.2.2 EMS 的處理方法 西瓜種子誘變前設(shè)計2種種子處理方式：指甲刀切口和不切口。將切口和不切口的西瓜種子對EMS 的敏感性進(jìn)行測試：用0.40%和1.00%的EMS 溶液分別處理切口和不切口的西瓜種子各4 h 和10 h。每個處理用50 粒種子，3 次重復(fù)。

確定最佳的種子處理方式后，將試驗設(shè)誘變濃度和誘變時間2 個因素，采用二因素完全隨機區(qū)組設(shè)計方法，因素1 為EMS 誘變濃度，設(shè)6 個濃度水平，即0.40%、1.00%、1.20%、1.40%、1.60%；因素2為誘變時間，設(shè)5 個誘變時間水平，即4、10、12、14、16 h。試驗共30 個處理，3 次重復(fù)，每個處理用50粒種子。試驗處理均以pH 7.0 的0.1 mol·L磷酸緩沖液處理作為對照，誘變結(jié)束后，用1.0 mol·L的硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，接著用0.1 mol·L的硫代硫酸鈉溶液沖洗，再用蒸餾水清洗3 遍，將種子平鋪于濾紙上瀝水，后用紗布包好放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽。

1.2.3 測定發(fā)芽率 分別統(tǒng)計7 d 后的種子發(fā)芽數(shù)，計算發(fā)芽率和相對發(fā)芽率，篩選出EMS 溶液的半致死劑量，確定最佳的EMS 誘變濃度和時間。

發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%，相對發(fā)芽率=處理的實際發(fā)芽率/對應(yīng)CK 的實際發(fā)芽率×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 處理試驗數(shù)據(jù)并分析作圖，使用IBM SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件采用LSD 法分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS溶液對西瓜種子切口與不切口的影響

利用切口與不切口2 種處理方式對EMS 誘變西瓜種子的敏感性進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)（表1），0.40%的低濃度處理下，處理時間為4 h 時，與對照相比，切口與不切口2 種處理方式對西瓜種子的實際發(fā)芽率和相對發(fā)芽率無影響，都是100%；但當(dāng)濃度為0.40%，處理時間為10 h 時，切口西瓜種子的實際發(fā)芽率和相對發(fā)芽率都比對照顯著降低了4.00%，而不切口種子的實際發(fā)芽率和相對發(fā)芽率與對照相比無變化；當(dāng)誘變濃度為1.00%，處理時間為4 h時，2 種處理方式對西瓜種子的實際發(fā)芽率和相對發(fā)芽率都無顯著變化；但當(dāng)濃度為1.00%，處理時間為10 h 時，種子切口的處理方式使西瓜種子的實際發(fā)芽率和相對發(fā)芽率都分別比對照顯著下降了20.00%，而不切口的處理方式下西瓜種子的實際發(fā)芽率和相對發(fā)芽率僅下降了3.33%。由此可見，當(dāng)誘變濃度較低且誘變時間較短時，種子不管是切口還是不切口對EMS 誘變劑都不敏感；當(dāng)誘變濃度和誘變時間達(dá)到一定程度時，相同條件下，種子進(jìn)行切口處理能夠顯著提高西瓜種子對EMS 誘變劑的敏感性。

表1 不同種子處理方式對西瓜種子發(fā)芽率的影響

2.2 誘變時間和誘變濃度對西瓜種子發(fā)芽率的影響

2.2.1 誘變時間對西瓜種子發(fā)芽率的影響 相同誘變濃度條件下，研究誘變時間對西瓜種子發(fā)芽率的影響（表2）發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘變濃度為0.40%時，誘變時間分別為4、10、12 h 的西瓜種子相對發(fā)芽率與對照相比無顯著差異，而誘變時間為14 h 和16 h 時的西瓜種子相對發(fā)芽率分別比對照顯著降低了7.34%和11.78%；當(dāng)誘變濃度分別為1.00%、1.20%、1.40%、1.60%和2.00%時，誘變10、12、14、16 h 的西瓜種子相對發(fā)芽率均低于誘變4 h 的相對發(fā)芽率，且均達(dá)到了顯著水平。以上結(jié)果表明，誘變濃度和誘變時間對西瓜種子的發(fā)芽率都有較大影響，當(dāng)誘變濃度較低為0.40%時，誘變時間在短期內(nèi)對西瓜種子發(fā)芽率的影響效果差異不明顯，但超過一定時間后有顯著的影響效果；當(dāng)誘變濃度≥1.00%時，誘變時間≥10 h 的影響效果均顯著低于誘變時間為4 h 的誘變效果。

表2 同一濃度下不同誘變時間對西瓜種子發(fā)芽率的影響

2.2.2 誘變濃度對西瓜種子發(fā)芽率的影響 相同誘變時間條件下，研究EMS 的誘變濃度對西瓜種子發(fā)芽率的影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘變時間為4 h 時，誘變濃度為0.40%和1.00%的西瓜種子相對發(fā)芽率與對照相比無顯著差異，而誘變濃度分別為1.20%、1.40%、1.60%和2.00%的西瓜種子相對發(fā)芽率均顯著低于對照（圖1）；當(dāng)誘變時間為10 h 和12 h 時，誘變濃度為0.40%的西瓜種子相對發(fā)芽率與對照相比均無顯著變化，但1.00%～2.00%的西瓜種子相對發(fā)芽率都比對照低，且都達(dá)到了顯著水平（圖2、圖3）；誘變14 h 和16 h 時，誘變濃度0.40%～2.00%的西瓜種子相對發(fā)芽率都顯著低于對照（圖4、圖5）。由此可見，誘變時間和誘變濃度協(xié)同影響EMS 的誘變效果，誘變時間一定時，誘變濃度越高西瓜種子的相對發(fā)芽率越低；與對照相比，誘變時間較短、誘變濃度較低時對西瓜種子相對發(fā)芽率的影響不大，誘變濃度越高，影響越顯著；當(dāng)誘變時間較長時，低濃度的誘變效果依然不顯著，但隨著誘變濃度的增大，影響效果越來越明顯，且均能夠達(dá)到顯著水平；當(dāng)誘變時間足夠長時，即使誘變濃度較低，誘變效果也較顯著。

圖1 不同EMS 濃度誘變4 h 對西瓜種子相對發(fā)芽率的影響

圖2 不同EMS 濃度誘變10 h 對西瓜種子相對發(fā)芽率的影響

圖3 不同EMS 濃度誘變12 h 對西瓜種子相對發(fā)芽率的影響

圖4 不同EMS 濃度誘變14 h 對西瓜種子相對發(fā)芽率的影響

圖5 不同EMS 濃度誘變16 h 對西瓜種子相對發(fā)芽率的影響

2.3 最佳誘變濃度和誘變時間的確定

最佳誘變劑量（包括誘變濃度和誘變時間）才能夠達(dá)到最佳的誘變效果。本試驗利用6 個誘變濃度和5 個誘變時間共30 個組合對EMS 誘變西瓜種子的劑量效應(yīng)進(jìn)行了分析（表2 和圖1），當(dāng)誘變濃度為1.20%，誘變時間分別為12、14、16 h 時，西瓜種子相對發(fā)芽率分別為50.38%、52.21%和51.97%；當(dāng)誘變濃度為1.40%，誘變時間分別為12、14、16 h 時，西瓜種子相對發(fā)芽率分別為48.95%、49.97%和48.82%。由上述結(jié)果可知，當(dāng)誘變濃度為1.20%～1.40%、誘變時間為12～16 h 時，西瓜種子的相對發(fā)芽率能夠達(dá)到半致死劑量，以誘變濃度越低和誘變時間越短為最好的原則，獲得最佳的誘變組合為誘變濃度1.20%、誘變時間12 h。

3 討論和結(jié)論

最佳的誘變劑量是獲得最佳突變頻率，得到理想突變體的關(guān)鍵。而合適的誘變材料處理方式是降低誘變劑使用量和縮短誘變時間進(jìn)而獲得最佳誘變劑量的重要措施之一?？当Ｉ旱仍诶肊MS誘變瓠瓜種子的研究中發(fā)現(xiàn)，利用1.00% 的EMS誘變濃度誘變12 h，不開殼種子的相對發(fā)芽率能夠達(dá)到99.20%，但開殼種子的相對發(fā)芽率卻下降到了46.00%左右，對EMS 誘變的敏感性顯著提高。在其他葫蘆科作物中，甜瓜種子不切口且EMS 處理濃度在1.00%～3.00%之間的發(fā)芽率能夠達(dá)到97.00%以上。本試驗發(fā)現(xiàn)對西瓜種子進(jìn)行不切口處理時，1.00%的誘變濃度下即使誘變時間達(dá)到10 h，種子相對發(fā)芽率依然能夠達(dá)到96.67%，而切口處理后該條件下的種子相對發(fā)芽率下降到了80.56%，與前人研究結(jié)論類似，也進(jìn)一步說明在進(jìn)行EMS 誘變處理中，可以通過種子切口或者開殼的處理方式來提高種子對誘變劑的敏感性。

目前，關(guān)于是否存在低濃度、短時間的EMS 處理對植物種子或者幼苗有一定的促進(jìn)作用還沒有統(tǒng)一定論。李雪寶等研究表明低濃度的EMS 能夠促進(jìn)水稻種子的發(fā)芽勢及幼苗生長發(fā)育?；粞跑暗仍诩Q豌豆中發(fā)現(xiàn)EMS 的短時處理能夠促進(jìn)其幼苗生長?？当Ｉ旱仍陴现邪l(fā)現(xiàn)低濃度、短時間的EMS 誘變處理能夠促進(jìn)開殼瓠瓜種子發(fā)芽率的提高。但王春語等在分析EMS 處理高粱種子的最佳誘變劑量中發(fā)現(xiàn)隨著EMS 誘變時間的增長和EMS 誘變濃度的增加，高粱出苗率呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢?？椎屡嗟仍诿藁ㄖ幸舶l(fā)現(xiàn)EMS 對棉花種子的萌發(fā)有抑制作用，EMS 濃度越大，處理時間越長，對種子發(fā)芽勢和活力的抑制作用越顯著。本試驗中低濃度、短時間的EMS 處理后西瓜種子的相對發(fā)芽率與對照相比有所降低，但差異不顯著。此外，多數(shù)研究也表明，高濃度的EMS 處理短期內(nèi)會對細(xì)胞造成無法完全修復(fù)的生理損傷，并抑制植株的生長發(fā)育。本試驗中同樣發(fā)現(xiàn)高濃度的EMS 條件下，即使誘變時間較短也能夠顯著降低西瓜種子的相對發(fā)芽率。

EMS 是一種高效、穩(wěn)定的化學(xué)誘變劑，具有成本低、操作簡單、點突變頻率高，而染色體畸變頻率低等特點，且EMS 誘變多為顯性，易于突變體篩選。目前，利用EMS 誘變來創(chuàng)新種質(zhì)資源已在不同作物育種中有了廣泛應(yīng)用，但在該過程中，篩選出最佳的誘變劑量是獲得最佳的誘變效果的前提。通常是以半致死劑量為標(biāo)準(zhǔn)，一般以50%的種子相對發(fā)芽率作為半致死劑量的指標(biāo)。殷冬梅等以半致死劑量為選擇標(biāo)準(zhǔn)，確定了2 個花生品種的最佳誘變組合，分別是中花5 號的0.90%誘變7 h 和1.20%誘變5 h，遠(yuǎn)雜9102 的0.60%誘變7 h和0.90%誘變7 h，不同品種最佳誘變組合不同?？椎屡嗟壤肊MS 誘變亞洲棉發(fā)現(xiàn)0.60%的EMS溶液處理8 h 時其種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別為51.00%和18.84，該組合下的誘變效果最佳?？当Ｉ旱葘﹂_殼瓠瓜種子的24 個濃度/時間處理組合的研究中，發(fā)現(xiàn)1.00%～2.00%的EMS 誘變濃度為瓠瓜最適宜誘變濃度，在此濃度范圍內(nèi)，誘變8～12 h 可達(dá)到半致死劑量，提高濃度需要相應(yīng)縮短誘變時間。王學(xué)征等利用EMS 誘變西瓜種子發(fā)現(xiàn)1.80% 6 h 的組合、1.00% 9 h 的組合、1.40% 9 h 的組合和1.00%12 h 的組合發(fā)芽率均接近50%，并最終確定EMS 的最佳誘變條件為處理濃度1.00%且誘導(dǎo)時間9 h。本試驗以半致死劑量為標(biāo)準(zhǔn)，通過6個誘變濃度和5 個誘變時間共30 個誘變處理組合發(fā)現(xiàn)，EMS 誘變濃度為1.20%～1.40%，誘變時間達(dá)到12 h～16 h 的組合都能夠使西瓜種子相對發(fā)芽率達(dá)到50.00%左右，但以誘變濃度越低和誘變時間越短為原則獲得最佳的誘變組合為誘變濃度1.20%和誘變時間12 h。本試驗結(jié)果與王學(xué)征等的試驗結(jié)果相比誘變濃度增大，誘變時間延長，出現(xiàn)該問題的原因可能是西瓜品種以及西瓜自身基因型的不同造成的。

大量研究已經(jīng)證實，最佳的EMS 誘變條件有利于獲得最佳的誘變效果，對于構(gòu)建突變體庫、篩選突變體材料有重要的作用。目前，關(guān)于西瓜EMS 誘變條件和誘變效果的研究相對較少，具體的誘變機制仍處于探究階段。本試驗中利用誘變濃度和誘變時間的不同處理組合，篩選到了EMS 誘變西瓜種子的最佳誘變劑量，為西瓜突變體庫的構(gòu)建和突變體材料的篩選提供了基礎(chǔ)，但該條件下能否獲得滿意的變異率還有待進(jìn)一步的驗證。