1株優(yōu)良生防細(xì)菌的篩選及其對(duì)甘肅溫室黃瓜枯萎病的防治效果

李 娜，李 晶，付麟雲(yún)，劉錦霞，丁 品，武建榮

（甘肅省科學(xué)院生物研究所 蘭州 730000）

黃瓜枯萎病由尖孢鐮刀菌黃瓜?；停╢sp）這一類真菌侵染，從苗期到結(jié)果期均會(huì)發(fā)病，開花結(jié)果期發(fā)病最為嚴(yán)重。發(fā)病初期，黃瓜植株上的葉片在中午高溫時(shí)出現(xiàn)萎蔫癥狀，早晚氣溫轉(zhuǎn)涼時(shí)，萎蔫癥狀又恢復(fù)正常。發(fā)病的中后期，植株上萎蔫的枝葉會(huì)逐漸增加，氣溫轉(zhuǎn)涼時(shí)癥狀也難以恢復(fù)，葉片出現(xiàn)由下向上逐步變得枯黃萎蔫，直至莖稈成水浸狀腐爛。黃瓜枯萎病主要經(jīng)土壤傳播的維管束病害，露地和保護(hù)地栽培黃瓜上均可發(fā)生，連作地區(qū)尤為嚴(yán)重，現(xiàn)已成為世界范圍內(nèi)影響黃瓜生產(chǎn)的毀滅性土傳病害。發(fā)病率在20%～30%，造成黃瓜產(chǎn)量下降，嚴(yán)重時(shí)在80%～90%，可導(dǎo)致黃瓜嚴(yán)重減產(chǎn)。目前，此病害己成為生產(chǎn)上制約黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一，而黃瓜是日光溫室反季節(jié)栽培的主要蔬菜種類，栽培面積已占日光溫室生產(chǎn)面積的50%以上。所以，此病害也成為制約現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要因素。

目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)主要就是采取田間輪作和植株嫁接的方法，還會(huì)使用和化學(xué)農(nóng)藥相結(jié)合的方法來(lái)防治黃瓜枯萎病。但這些方法效果往往不穩(wěn)定，化學(xué)農(nóng)藥雖然可以有效控制溫室黃瓜枯萎病的發(fā)生，但長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥所產(chǎn)生的農(nóng)藥殘留不僅污染土壤和地下水，也危害人畜健康，而且隨著內(nèi)吸性殺菌劑大量使用，病菌易產(chǎn)生抗藥性，防效會(huì)逐漸降低。

如今，用生物防治的方法控制溫室黃瓜枯萎病越來(lái)越得到人們的關(guān)注和青睞。人們已經(jīng)從土壤中篩選出多種有益微生物。其中，植物根際促生菌作為具有防病潛力和應(yīng)用價(jià)值的一類生防菌受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注，并用于土傳病害的防治。目前，已報(bào)道對(duì)黃瓜枯萎病有生防潛力的拮抗菌包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、木霉屬真菌、鏈霉菌等，但有關(guān)弗雷德里克斯堡假單胞菌對(duì)黃瓜枯萎病菌的防控作用目前還未見(jiàn)報(bào)道。筆者從已分離鑒定的黃瓜根際微生物中檢測(cè)對(duì)尖孢鐮刀菌黃瓜?；途哂休^好拮抗作用的菌株，開展抗病試驗(yàn)，為溫室黃瓜枯萎病防治的生物農(nóng)藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

生防菌株：菌株F-2、33-1、F-4、N-2、N-Z、N-6、N-8、N-9，均為該實(shí)驗(yàn)室分離，2018 年篩選于甘肅省武威市涼州區(qū)日光溫室黃瓜根際土壤。

供試病原菌：尖孢鐮刀菌黃瓜?；停╢sp）購(gòu)于中國(guó)微生物菌種保藏中心。供試黃瓜：津育二號(hào)黃瓜。

供試藥劑：50%多菌靈可濕性粉劑。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基。

儀器：蘇凈安泰超凈工作臺(tái)SW-CJ-2 FD、上海申安立式高壓蒸汽滅菌鍋LDZF-50 L、上海森信霉菌培養(yǎng)箱。

1.2 方法

試驗(yàn)于2018 年10 月在甘肅省科學(xué)院生物研究所實(shí)驗(yàn)室開展。

1.2.1 拮抗菌株對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制作用 采用牛津杯法將實(shí)驗(yàn)室前期篩選出對(duì)尖孢鐮刀菌有一定抑制作用的菌株F-2、33-1、F-4、N-2、N-Z、N-6、N-8、N-9 接種在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫活化48 h，活化后將8 種供試拮抗菌接在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。將尖孢鐮刀菌接在PDA 平板培養(yǎng)基中26 ℃恒溫活化96 h 后，將尖孢鐮刀菌孢子液均勻涂布在9 cm 的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中心放置內(nèi)徑為6 mm 的牛津杯，每個(gè)牛津杯中分別加入8 種供試拮抗菌，在26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)空白對(duì)照（無(wú)菌水處理），每株供試菌設(shè)3 次重復(fù)，待對(duì)照平板菌落長(zhǎng)滿時(shí)測(cè)量抑菌圈大小，比較空白對(duì)照及各供試菌株病原菌菌落直徑，篩選對(duì)尖孢鐮刀菌拮抗性能良好的生防菌株。

1.2.2 拮抗菌發(fā)酵液對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 采用菌絲生長(zhǎng)速率法，測(cè)定菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性即發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用。將拮抗細(xì)菌接入到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，制成發(fā)酵液。將尖孢鐮刀菌接在PDA 平板培養(yǎng)基中26 ℃恒溫活化96 h。用200 μL 拮抗菌株F-2、33-1、F-4、N-2、N-Z、N-6、N-8、N-9 液體發(fā)酵液均勻涂在PDA 平板上，在平板中心放置5 mm 病原菌菌餅，以無(wú)菌水為對(duì)照，26 ℃下培養(yǎng)7 d，每處理設(shè)3 次重復(fù)，用十字交叉法測(cè)量病原真菌菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑-處理菌落生長(zhǎng)直徑）/對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑×100%。

1.2.3 優(yōu)良拮抗菌株鑒定 拮抗菌的鑒定用常規(guī)方法結(jié)合分子鑒定方法完成。

將拮抗效果最好的菌株33-1 進(jìn)行革蘭氏染色、菌體形態(tài)、菌落形狀觀察；菌株生理生化反應(yīng)參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中的方法。16 S rDNA測(cè)定是由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司完成并通過(guò)MEGA 7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 優(yōu)良菌株33-1 對(duì)黃瓜枯萎病的防治及其促生效果 采用蘸根接種法測(cè)定優(yōu)良菌株33-1 對(duì)黃瓜枯萎病的防治及其促生效果。將拮抗菌33-1接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)2 d 備用，將病原菌尖孢鐮刀菌接種在PDA 液體培養(yǎng)基中26 ℃培養(yǎng)7 d，制成尖孢鐮刀菌菌懸液備用。將購(gòu)買的津育二號(hào)黃瓜種子在45 ℃水中泡種1 h，之后經(jīng)過(guò)70%酒精消毒1 min，HgCl消毒1 min，無(wú)菌水沖洗多次后放入培養(yǎng)皿中25 ℃催芽3 d，之后將芽根部劃傷，將劃傷的芽根部在之前培養(yǎng)好的尖孢鐮刀菌菌懸液中浸泡5 s，后接入育苗盤中，并將尖孢鐮刀菌菌懸液每穴6 mL 灌在距莖部1 cm 周圍，24 h后灌根接入拮抗菌33-1 液體懸浮液6 mL，拮抗菌菌液處理分B（原液）、A（10）、C（10）、D（10）、E（10）5 個(gè)濃度。每個(gè)處理30 個(gè)重復(fù)，并設(shè)有CK空白對(duì)照（不接病原菌）、CK（病原菌+清水）、CK 培對(duì)照（病原菌+培養(yǎng)基）、CK 藥劑對(duì)照（病原菌+50%多菌靈可濕性粉劑稀釋1000 倍）。溫度24～28 ℃，相對(duì)濕度50%～70%。30 d 后調(diào)查發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)、計(jì)算防治效果并測(cè)量植株株高、根長(zhǎng)、總質(zhì)量。黃瓜枯萎病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1

表1 黃瓜枯萎病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

植株發(fā)病程度及病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算病情指數(shù)按公式（1）（2）進(jìn)行計(jì)算。

病情指數(shù)/%=∑（病情級(jí)值×該病情級(jí)株數(shù)）/（病情最高級(jí)值×總株數(shù)）×100； （l）

相對(duì)防治效果/%=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100 。 （2）

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007 和SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和顯著性水平檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高拮抗菌株篩選

牛津杯法篩選結(jié)果（表2）顯示，33-1 對(duì)尖孢鐮刀菌有較好的抑制作用，病原菌菌落直徑最小，F(xiàn)-2、N-Z 次之，N-6、F-4 對(duì)病原菌也有一定的抑制作用，N-8 的抑菌效果最差。

表2 拮抗菌株對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制效果

菌絲生長(zhǎng)速率法對(duì)比結(jié)果（表3）顯示，與對(duì)照比，8 種拮抗菌發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)均有極顯著抑制作用。其中，N-Z、N-6 和F-4 對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)有一定抑制作用，3 種拮抗菌沒(méi)有顯著性差異，抑菌效果相當(dāng)。33-1 和F-2 和CK 相比較有極顯著差異，并且33-1 對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制率可達(dá)64.65%，F(xiàn)-2 對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制率可達(dá)55.81%，N-2、N-8 和N-9 對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制率較低，均不超過(guò)30%，但三者間差異極顯著。由圖1 也可明顯看出8 種拮抗菌對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制的差異。

表3 拮抗菌發(fā)酵液對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

圖1 拮抗菌發(fā)酵液對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

2.2 形態(tài)觀察、生理生化測(cè)定

挑選出對(duì)病原菌生長(zhǎng)抑制率最高的拮抗菌株33-1，確定拮抗菌株33-1 是革蘭氏陰性，桿狀，運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)芽胞，菌落圓形隆起，邊緣整齊，濕潤(rùn)，其生理生化特性與假單孢屬性狀吻合（表4）。菌株33-1為弗雷德里克斯堡假單胞菌。

表4 菌株33-1 的部分生理生化特性

2.3 拮抗菌防病能力

由圖表5 可知，在室內(nèi)條件下，5 種處理較CK都降低了病情指數(shù)。其中，C 處理和D 處理病情指數(shù)最低，分別是5.36%和12.50%，D 處理與藥劑對(duì)照組效果相當(dāng)，而C 處理植株發(fā)病程度明顯低于藥劑對(duì)照組14.28%，在防效上，C 處理和D 處理的效果也尤為突出，分別是86.95%和69.56%，C 處理更是明顯高于藥劑對(duì)照組65.23%的防治效果。在對(duì)株高的影響上，A 處理、C 處理、D 處理的株高高于CK。其中，C 處理的株高顯著高于CK，而C 處理與藥劑對(duì)照組沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明C 濃度可以促進(jìn)植株生長(zhǎng)，這個(gè)濃度在對(duì)促進(jìn)植株生長(zhǎng)與已經(jīng)商品化的農(nóng)藥效果相當(dāng)。在對(duì)植株根長(zhǎng)的影響上，A 處理、B 處理、C 處理、D 處理、E 處理均與CK、藥劑對(duì)照組無(wú)顯著差異，與空白對(duì)照組有極顯著差異，說(shuō)明雖然各濃度菌劑沒(méi)有改善病原菌對(duì)植株根長(zhǎng)生長(zhǎng)的影響，但也沒(méi)有加劇病原菌對(duì)根長(zhǎng)生長(zhǎng)的抑制作用。從各濃度藥劑對(duì)植株總質(zhì)量影響上來(lái)看，A處理、B 處理、C 處理、D 處理和E 處理的植株總質(zhì)量都顯著高于CK，C 處理的植株總質(zhì)量高于CK 和藥劑對(duì)照組，且差異極顯著，D 處理與藥劑對(duì)照組效果相當(dāng)，說(shuō)明5 種濃度藥劑對(duì)植株都有一定的增重效果，C 處理、D 處理效果尤為明顯。

表5 菌株33-1 室內(nèi)盆栽防效試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

在黃瓜生物防治的應(yīng)用中，應(yīng)用最多的有木霉屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬和假單胞菌屬等，谷祖敏等研究發(fā)現(xiàn)采用拌土法接種長(zhǎng)枝木霉THLJ 對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果達(dá)67.05%。孫燕霞等使用解淀粉芽孢桿菌SYX-1 菌懸液對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果為43.3%。圓圓等使用鏈霉菌S-101 發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病防效達(dá)到57.11%。假單胞菌屬是植物根系、根際最豐富的細(xì)菌類群，具有多樣的生物活性，假單胞菌廣泛存在于植物根際中。其中，許多菌株可以有效抑制多種真菌和細(xì)菌引起的根部病害，對(duì)植物的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，具有作為生防菌的有利條件，并能很好地發(fā)揮生防作用。關(guān)于假單胞菌在植物病害防治中，研究主要集中在熒光假單胞菌。熒光假單胞菌是植物根圍和土壤中常見(jiàn)的一種有益細(xì)菌，是目前研究最為廣泛的生防菌之一，但關(guān)于弗雷德里克斯堡假單胞菌的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

結(jié)合拮抗菌株和病原菌的平板對(duì)峙試驗(yàn)、生防菌株發(fā)酵液抑菌活性的試驗(yàn)，本試驗(yàn)篩選出拮抗菌株弗雷德里克斯堡假單胞菌33-1，該菌能較好地抑制病原菌生長(zhǎng)，對(duì)黃瓜枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌黃瓜?；途暧休^好的抑制作用，其發(fā)酵產(chǎn)物也能很好地抑制尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)，抑制率可達(dá)64.65%。33-1 的室內(nèi)盆栽防病效果試驗(yàn)結(jié)果表明，33-1 在C（10）拮抗菌發(fā)酵液濃度處理下植株發(fā)病程度明顯低于藥劑對(duì)照組14.28%和CK 對(duì)照組的41.07%，病情指數(shù)最低，為5.36%；在防效上，33-1在C（10）拮抗菌發(fā)酵液濃度處理下效果也尤為突出，防治效果為86.95%，更是明顯高于藥劑對(duì)照組65.23%的防治效果，說(shuō)明C（10）拮抗菌發(fā)酵液濃度為33-1 室內(nèi)盆栽防病效果最佳的拮抗菌發(fā)酵液濃度。拮抗菌33-1 在C（10）拮抗菌發(fā)酵液濃度處理下及D（10）拮抗菌發(fā)酵液濃度處理下，相對(duì)防治效果高于A（10）拮抗菌發(fā)酵液濃度處理及B（原液）處理，可能是因?yàn)楦邼舛鹊霓卓咕l(fā)酵液在土壤中對(duì)植株本身會(huì)產(chǎn)生一定影響，使得植株根系細(xì)胞受損，從而抵抗力降低，植株生長(zhǎng)緩慢，株高、根長(zhǎng)、總質(zhì)量均低于空白對(duì)照組。培養(yǎng)基對(duì)照組處理下，植株全部死亡，可能是由于培養(yǎng)基養(yǎng)分充足，加快了病原菌尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)。D（10）拮抗菌發(fā)酵液濃度處理下，相對(duì)防治效果和藥劑對(duì)照組相對(duì)防治效果相當(dāng)。在與已經(jīng)商品化的多菌靈比較，33-1 在C（10）拮抗菌發(fā)酵液濃度時(shí)，有效降低了黃瓜枯萎病的發(fā)病率，相對(duì)防治效果也高于已商品化的多菌靈；高于大部分假單胞菌對(duì)黃瓜枯萎病的67.5%的防治效果；更是高于目前研究較多的熒光假單胞菌的生防效率50%～60%。研究還表明這株弗雷德里克斯堡假單胞菌不僅具有抑菌活性作用，并在黃瓜苗期有顯著促生作用，其適宜濃度發(fā)酵液對(duì)苗期黃瓜植株有顯著促生作用。

綜上所述，弗雷德里克斯堡假單胞菌33-1 是1株綜合性狀優(yōu)良的高效拮抗菌株，在防治土傳植物病害方面具有極大的潛力，可以為黃瓜枯萎病的防治及假單胞菌的高效利用提供菌株資源。下一步可以比較高效拮抗菌株33-1 活菌和代謝產(chǎn)物的抑菌能力，確定有效抑菌物質(zhì)及其抑菌機(jī)制，為黃瓜枯萎病的防治及假單胞菌的高效利用奠定理論基礎(chǔ)，為黃瓜枯萎病的綠色防控提供重要的技術(shù)支撐。