不同類型甜瓜高效再生體系的建立

張春秋，李斯貝，胡紫玉，呂桂云，王建設(shè)

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·蔬菜種質(zhì)改良北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心 北京 100097； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 河北保定 071001）

甜瓜（L.）屬于葫蘆科甜瓜屬，是一種國內(nèi)外普遍栽培的水果型作物。2020 年全球甜瓜產(chǎn)量已達(dá)2.7×10t，種植面積達(dá)1.1×10hm（FAO，www.fao.org/faostat）。隨著甜瓜的規(guī)模化生產(chǎn)，病蟲害的問題也隨之日益嚴(yán)重，造成甜瓜產(chǎn)量銳減、品質(zhì)下降。近年來，基因工程技術(shù)快速發(fā)展，使得運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段進(jìn)行種質(zhì)定向改良成為培育抗病優(yōu)質(zhì)甜瓜新品種的有效途徑。建立一個(gè)穩(wěn)定、高效的再生體系，是基因工程育種成功的前提條件。

影響甜瓜再生能力的主要因素有基因型、外植體類型及其生長(zhǎng)狀態(tài)、激素種類和濃度配比。基因型對(duì)甜瓜再生能力起決定性的作用，不同類型甜瓜的再生潛力有明顯差異，已有研究分別針對(duì)厚皮和薄皮等不同類型甜瓜建立了特定的再生體系。但甜瓜離體再生過程中仍存在愈傷組織分化出芽困難、不定芽誘導(dǎo)率較低和再生體系重復(fù)性差等問題。因此，對(duì)不同類型甜瓜再生體系進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化以建立廣泛適用的再生體系顯得尤為迫切。外植體的類型及生長(zhǎng)狀態(tài)是建立甜瓜再生體系的影響因素之一。目前，已有選用子葉、下胚軸、真葉、葉片等通過器官發(fā)生途徑再生出完整植株的報(bào)道。其中，子葉相比其他器官出愈較快且愈傷組織緊密，不定芽誘導(dǎo)率也相對(duì)較高，被認(rèn)為是甜瓜再生的首選外植體。甜瓜子葉的再生能力與苗齡密切相關(guān)，不同苗齡甜瓜子葉的不定芽誘導(dǎo)率存在較大差異，合適的苗齡是成功誘導(dǎo)不定芽的關(guān)鍵因素。影響甜瓜再生的另一個(gè)重要因素是生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和濃度配比。目前，常用于甜瓜再生的激素有6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等，選擇合適的激素種類和濃度配比是建立高效穩(wěn)定的甜瓜再生體系的研究重點(diǎn)。

筆者在本試驗(yàn)中以不同類型（厚皮、厚薄皮中間型和薄皮）的8 個(gè)甜瓜自交系材料子葉作為外植體，對(duì)基因型、外植體苗齡、不同激素組合和濃度配比等影響甜瓜再生效率的主要因素進(jìn)行系統(tǒng)深入研究，以構(gòu)建適于不同類型甜瓜的高效再生體系，為甜瓜快速繁殖、應(yīng)用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)甜瓜種質(zhì)資源進(jìn)行定向改良等提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

筆者分別以厚皮類型甜瓜M1（sspvar）和M2（sspvar）；厚薄皮類型甜瓜M32 和M36（ssp.var.）；薄皮類型甜瓜M250（ssp.var.）和M265（sspvarMakino）；對(duì)照組薄皮甜瓜BU-21/3（sspvar）和厚皮甜瓜Védrantais（sspvar）等不同類型8 個(gè)甜瓜自交系作為供試材料。其中，M1、M2、M32、M36、M250 和M265 為北京市農(nóng)市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜中心選育，BU-21/3 和Védrantais種子分別由以色列農(nóng)業(yè)科學(xué)院Yaakov Tadmor 研究員和美國農(nóng)業(yè)部J.D.McCreight 研究員饋贈(zèng)，在北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心溫室擴(kuò)繁。其中，Bu-21/3 為具有高再生能力的甜瓜材料，Védrantais為研究甜瓜再生體系常用的材料。試驗(yàn)于2016 年3 月至2019 年10 月在北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心進(jìn)行。以MS 為基本培養(yǎng)基，根據(jù)不同生長(zhǎng)階段配制添加不同激素濃度配比。其中，激素種類包括IAA、IBA 和6-BA。以上試劑均購于美國Sigma試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 種子處理 挑取飽滿的甜瓜種子，剝?nèi)シN皮后用70%（，后同）的乙醇浸泡20～30 s，無菌水洗2～3 次，用1%的次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水洗滌4～5 次后，用無菌濾紙吸干多余水分，置于MS培養(yǎng)基（蔗糖質(zhì)量濃度30 g·L，瓊脂質(zhì)量濃度7 g·L，pH 5.8）中暗培養(yǎng)。

1.2.2 不定芽的誘導(dǎo) 取苗齡為3 d 的甜瓜子葉，切除胚根和子葉兩端1～2 mm 后，剝除子葉的內(nèi)種皮，將子葉部分橫切為二作為外植體，葉背面向下接種于附加不同激素配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（見表1），置于25 ℃，光照度為2000 lx，光周期為16 h/8 h 培養(yǎng)。30 d 后調(diào)查統(tǒng)計(jì)發(fā)生不定芽的外植體數(shù)，以篩選出不定芽誘導(dǎo)最佳激素配比組合，并比較基因型不定芽誘導(dǎo)率的差異。分別取2、3、4、5 d 苗齡的甜瓜子葉，置于MS+1.0 mg·L6-BA 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30 d 后觀察不同苗齡外植體不定芽的誘導(dǎo)情況。每個(gè)處理30 個(gè)外植體，3 次重復(fù)。不定芽誘導(dǎo)率/%=產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100。采用SPSS 17.0 軟件中的Duncan’s multiple range test 方法進(jìn)行差異顯著性分析。

表1 不同濃度激素配比對(duì)不同類型甜瓜材料不定芽誘導(dǎo)率的影響 %

1.2.3 不定芽的伸長(zhǎng)與生根 選取厚皮類型M2、厚薄皮類型M32 和薄皮類型M265 三個(gè)甜瓜品種進(jìn)行不定芽伸長(zhǎng)和生根試驗(yàn)。不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)3～4周，待叢生芽長(zhǎng)至0.5～1.0 cm，及時(shí)切下分化的不定芽轉(zhuǎn)入芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基（表2），比較不同激素配比對(duì)不定芽伸長(zhǎng)的影響。當(dāng)不定芽伸長(zhǎng)到2～3 cm 時(shí)，切下不定芽，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)（表3），比較不同激素對(duì)不定芽生根的影響。待確定最佳濃度配比后，將生根培養(yǎng)基添加3.0 mg·L的活性炭防止形成玻璃苗。生根率/%=生根的不定芽數(shù)/接種的總不定芽數(shù)×100。1.2.4 試管苗的移栽 待試管苗根系發(fā)達(dá)后，煉苗3～5 d 后，洗凈根上附著的培養(yǎng)基，移栽入預(yù)先經(jīng)高壓滅菌的蛭石和草炭土1∶1（∶）基質(zhì)中于溫室中培養(yǎng)，前期注意保濕遮陰，3～5 d 后逐漸增加透光量。

表3 不同激素濃度對(duì)生根率的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型甜瓜材料和激素配比對(duì)甜瓜不定芽誘導(dǎo)的影響

由表1 可以看出，不同類型甜瓜在含相同激素濃度配比的培養(yǎng)基中不定芽誘導(dǎo)率表現(xiàn)有所不同，薄皮型甜瓜M250 和M265 不定芽誘導(dǎo)率高于厚皮和厚薄皮類型。此外，不定芽的誘導(dǎo)和分化與6-BA 和IAA 的質(zhì)量濃度配比密切相關(guān)。隨著6-BA 和IAA 質(zhì)量濃度的增加，不定芽的誘導(dǎo)率隨之降低，8 個(gè)不同甜瓜材料在MS8（MS+2.0 mg·L6-BA+0.6 mg·LIAA）不定芽誘導(dǎo)率最低。分析發(fā)現(xiàn)在含1.0 mg·L6-BA 的培養(yǎng)基中添加低質(zhì)量濃度的IAA（0.2 mg·L）對(duì)不定芽的誘導(dǎo)影響較小，8 個(gè)不同類型甜瓜材料在MS1（MS+1.0 mg·L6-BA）和MS2（MS+1.0 mg·L6-BA+0.2 mg·LIAA）上的不定芽誘導(dǎo)率均沒有顯著性差異。不同基因型甜瓜材料的不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基有所不同，對(duì)照組（BU-21/3 和Védrantais），厚皮型（M1 和M2），厚薄皮類型（M32 和M36）和薄皮型M265 在MS1 培養(yǎng)基中不定芽誘導(dǎo)率最高，分別為90.3%、87.3%、72.0%、83.0%、73.6%、75.6%和89.3%。其中，對(duì)照組BU-21/3 不定芽誘導(dǎo)率最高，薄皮型M265 表現(xiàn)出與對(duì)照組相近的較強(qiáng)再生能力。薄皮型甜瓜M250 在MS2 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率最高（85.3%），但其在MS1 培養(yǎng)基上同樣具有較高的誘導(dǎo)率（84.7%）。綜合考慮，不同甜瓜材料后續(xù)試驗(yàn)采用的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+1.0 mg·L6-BA。

2.2 不同苗齡子葉外植體對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

由圖1 可知，不同基因型甜瓜在2 d 苗齡時(shí)子葉塊不定芽誘導(dǎo)率最低，3～4 d 苗齡的子葉塊不定芽的誘導(dǎo)率相對(duì)較高，在72%～90%之間。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，不同基因型材料均在苗齡為3 d 時(shí)表現(xiàn)出的不定芽誘導(dǎo)率最高，苗齡增大后誘導(dǎo)率均有所下降。因此，最好采用3 d 苗齡的子葉作為外植體進(jìn)行甜瓜再生培養(yǎng)。

圖1 苗齡對(duì)子葉塊不定芽誘導(dǎo)率的影響

2.3 不定芽伸長(zhǎng)和生根條件優(yōu)化

M2、M32 和M265 三個(gè)不同類型材料在不同激素濃度配比的培養(yǎng)基上不定芽生長(zhǎng)狀態(tài)較為一致，在高濃度6-BA 的MS 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，但容易形成玻璃化苗，6-BA 的質(zhì)量濃度為0.1 mg·L時(shí)能滿足不定芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)需求，且不定芽葉色深綠，節(jié)間適中，莖較粗。添加微量的IAA 有助于莖的正常生長(zhǎng)，當(dāng)IAA 濃度較高時(shí)，不定芽生長(zhǎng)較快，節(jié)間變長(zhǎng)且莖較細(xì)，在一定程度上還會(huì)加重幼苗的玻璃化現(xiàn)象。因此，MS+0.1 mg·L6-BA+0.05 mg·LIAA 是適于不定芽伸長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基，在此條件下生長(zhǎng)的試管苗葉色深綠、節(jié)間適中、生長(zhǎng)健壯，2 周左右生長(zhǎng)成2～3 cm 高的健壯苗（表2，圖2）。

表2 不同激素濃度對(duì)甜瓜不定芽伸長(zhǎng)的影響

圖2 M1 甜瓜組培苗再生過程

待不定芽伸長(zhǎng)至2～4 cm 時(shí)，將其移入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。結(jié)果表明，相較于高濃度IBA 培養(yǎng)基，添加低質(zhì)量濃度0.1 mg·LIBA 誘導(dǎo)生根率較高，M2、M32 和M265 的生根率分別高達(dá)86.7%、91.1%和89.2%，并且根系形態(tài)正常、較為粗壯、須根較多。隨著IBA 濃度的升高，生根率逐漸降低，3種類型甜瓜材料在含0.5 mg·LIBA 的培養(yǎng)基上生根率與0.1 mg·LIBA 相比顯著降低，根系明顯變細(xì)且根量減少。在培養(yǎng)基中添加不同濃度的IAA時(shí)，厚皮型M2 和厚薄皮M32 的生根率無顯著性差異；薄皮類型M265 在0.1、0.3 mg·LIAA 的培養(yǎng)基上生根率差異顯著，但均低于添加同樣濃度的IBA。所有類型甜瓜材料在IAA 培養(yǎng)基上生根速度快，但根系較細(xì)，根量較少，不利于試管苗移栽成活。在不定芽生根的過程中也存在玻璃化現(xiàn)象，研究發(fā)現(xiàn)在生根培養(yǎng)基中添加3 g·L的活性炭能使培養(yǎng)中玻璃化苗比例下降且根系生長(zhǎng)健壯（圖2）。甜瓜再生植株最佳的生根培養(yǎng)基為MS+0.1 mg·LIBA+3 g·L活性炭。

3 討論與結(jié)論

合適的激素種類和濃度配比是影響甜瓜再生效率的關(guān)鍵因素，首先表現(xiàn)在對(duì)不定芽的誘導(dǎo)上。6-BA 是誘導(dǎo)出不定芽的必需激素。IAA 對(duì)不定芽誘導(dǎo)影響較小，但合適配比的6-BA 與IAA 共同使用可以提高不定芽誘導(dǎo)率。以往的甜瓜再生體系研究中，其激素種類和濃度配比因甜瓜品種差異而有所不同。筆者在本試驗(yàn)中以具有高再生能力的甜瓜材料BU-21/3（var）和研究甜瓜再生體系常用的Védrantais（var）為對(duì)照，對(duì)比了甜瓜自交材料在含有不同激素濃度配比培養(yǎng)基上的再生效率，以篩選適用于不同類型甜瓜再生體系。發(fā)現(xiàn)適當(dāng)質(zhì)量濃度的6-BA（1.0 mg·L）對(duì)甜瓜不定芽的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用；6-BA 質(zhì)量濃度過高（2.0 mg·L）不但不利于誘導(dǎo)不定芽，而且會(huì)再生出很多畸形芽，玻璃化嚴(yán)重，難以發(fā)育成正常植株。本試驗(yàn)中所用的不同類型8個(gè)甜瓜材料中，除M250 外，其他材料在MS+6-BA 1.0 mg·L上的不定芽誘導(dǎo)率最高，M250 在添加0.2 mg·LIAA 的培養(yǎng)基上不定芽誘導(dǎo)率最高，其他類型甜瓜在添加IAA 后反而會(huì)使誘導(dǎo)率降低，這可能是由于外植體內(nèi)含有內(nèi)源生長(zhǎng)素，內(nèi)源生長(zhǎng)素含量高的品種在組培過程中添加IAA，會(huì)抑制不定芽的誘導(dǎo)。在相同培養(yǎng)條件下，不同基因型材料誘導(dǎo)率存在差異，薄皮甜瓜的再生能力高于厚皮類型和厚薄皮類型。

影響甜瓜不定芽誘導(dǎo)率的另一重要因素是外植體苗齡，本試驗(yàn)中所用的不同基因型甜瓜子葉均在3 d 苗齡時(shí)表現(xiàn)出最高的誘導(dǎo)效率。在以往的研究中，針對(duì)不同品種甜瓜最佳苗齡范圍從2～6 d 不等，苗齡增大后，不定芽誘導(dǎo)率迅速下降，超過10 d苗齡的甜瓜子葉幾乎不能誘導(dǎo)出不定芽。這可能與甜瓜子葉的內(nèi)源激素有關(guān)，苗齡小的子葉內(nèi)源激素水平較高，細(xì)胞全能性較好，與外源激素協(xié)同作用有利于不定芽高效誘導(dǎo)。

在植物組織培養(yǎng)生根過程中常用的激素有萘乙酸（NAA）、IBA 和IAA，不同激素對(duì)甜瓜不定芽的生根影響不同。有研究表明NAA 無論濃度高低都對(duì)甜瓜品種生根誘導(dǎo)存在抑制作用。故而本試驗(yàn)中并未設(shè)置NAA 濃度條件。低濃度的IBA 和IAA，對(duì)甜瓜的生根誘導(dǎo)有一定的促進(jìn)作用。當(dāng)IAA 濃度較高時(shí)容易誘導(dǎo)愈傷組織的形成，使根的形成受到抑制。筆者的研究顯示，M2、M32 和M265 的不定芽在添加0.1 mg·LIBA的MS 培養(yǎng)基上生根率最高，且根系生長(zhǎng)狀態(tài)良好。添加IAA 的培養(yǎng)基生根率低，主根少且細(xì)，不利于后續(xù)再生苗移栽成活，添加IBA 生根狀態(tài)明顯好于添加IAA 的培養(yǎng)基。

筆者在本試驗(yàn)中通過對(duì)不同類型甜瓜再生體系進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)3 d 苗齡的甜瓜子葉最適合進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，并且在含有1.0 mg·L6-BA 的MS 培養(yǎng)基上不定芽誘導(dǎo)率較高。不定芽在MS+0.1 mg·L6-BA+0.05 mg·LIAA 培養(yǎng)基上伸長(zhǎng)狀態(tài)最好，在含有0.1 mg·LIBA 和3 g·L活性炭的培養(yǎng)基上生根最優(yōu)。筆者在本試驗(yàn)中建立的適合不同基因型甜瓜的高效再生體系，為后續(xù)通過遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行甜瓜種質(zhì)定向改良奠定了基礎(chǔ)。