土家藥山姜水提物的安全性初步評(píng)價(jià)*

汪子榮，吳美靜，許 睿，許太靜，向 露，梁渝敏，陳 希，向 娟,2,3

(1.吉首大學(xué)藥學(xué)院，湖南 吉首 416000；2.土家醫(yī)藥傳承與創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 吉首 416000；3.湖南省土家醫(yī)藥研究中心，湖南 吉首 416000)

山姜(Alpiniajaponica(Thunb.) Miq.)是姜科山姜屬植物，產(chǎn)于我國(guó)東南部、南部至西南部各省區(qū)，生于林下蔭濕處，山姜廣泛分布于湖南省湘西地區(qū)[1].山姜又名和山姜、姜葉淫羊藿、九龍盤(pán)、九姜連、姜七等，在湘西地區(qū)又被稱(chēng)之為小桿子、小柑子、小甘草等.山姜具有抗?jié)?、?zhèn)痛、抑菌、抗腫瘤、抗炎等作用[2-3]，化學(xué)成分以萜類(lèi)、黃酮類(lèi)為主[4-6].湘西地區(qū)的土家醫(yī)、苗醫(yī)及普通百姓廣泛使用山姜的根莖用于治療感冒等呼吸系統(tǒng)疾病，山姜的常用藥用部位為根莖，亦有人采用山姜的果實(shí)、種子、莖葉入藥，主要用法為水煎服.目前，山姜的使用主要基于民間用藥經(jīng)驗(yàn)，尚缺乏對(duì)其藥用安全性的評(píng)價(jià)，開(kāi)展山姜藥用安全性評(píng)價(jià)是保證其用藥安全的重要措施.

為探究山姜水提物的安全性，本研究通過(guò)急性毒性試驗(yàn)和亞急性毒性試驗(yàn)對(duì)山姜的水提物進(jìn)行初步的安全性評(píng)價(jià)，以小鼠的行為特征、體重變化、臟器系數(shù)、肌酐(CRE)含量、尿素氮(BUN)含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活力、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活力作為安全性評(píng)價(jià)的重要依據(jù)，以期為山姜的臨床研究及臨床應(yīng)用提供一定理論依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠，雄性，體重20～24 g，SPF級(jí)，試驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(湘)2019-0004，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司.在開(kāi)始試驗(yàn)前，筆者對(duì)小鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，即讓小鼠自由進(jìn)水、進(jìn)食，使其適應(yīng)生存環(huán)境.小鼠被飼養(yǎng)在相對(duì)清潔、安靜、恒溫(23 ℃±3 ℃)、恒濕(55%±15%)的環(huán)境中，日夜周期調(diào)節(jié)為12 h光照和12 h黑暗，小鼠可自由獲得食物和水.本研究所有動(dòng)物試驗(yàn)符合吉首大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)規(guī)定.

1.2 藥品及試劑

1.2.1 藥材 山姜藥材購(gòu)于湘西土家族苗族自治州吉首市乾州農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，產(chǎn)地吉首.此藥材經(jīng)吉首大學(xué)張代貴老師、向娟老師鑒定為姜科山姜屬植物山姜的根莖.

1.2.2 試劑 肌酐、尿素氮、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；通用型多聚甲醛固定液購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司；水合氯醛購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司.其他試劑均為市售的純度為化學(xué)純或分析純?cè)噭?

1.3 儀器

SUNRISE酶標(biāo)儀(TECAN)、冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪公司)、BM-500T系列生物顯微鏡(南京南派科技有限公司)、FB224電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 山姜水提物的制備

稱(chēng)取適量干燥的山姜根莖，按照料液比1∶10的比例加入山姜根莖和水，采用加熱回流方法提取2次，每次2 h，過(guò)濾后合并濾液，濃縮成浸膏狀后冷凍干燥，置于4 ℃冰箱備用，計(jì)算得到山姜水提物的得率為17.8%.

2.2 急性毒性試驗(yàn)

按照成人(體重70 kg)可服用10 g生藥的一般規(guī)則，計(jì)算出山姜人用給藥劑量為0.143 g/kg，將人用給藥劑量按體表面積法折算成小鼠的給藥劑量，生藥量為1.3 g/kg，即浸膏量0.23 g/kg.給藥當(dāng)天將小鼠按體重隨機(jī)分成山姜水提物組和對(duì)照組，每組5只雄性小鼠.山姜水提物組小鼠以最大耐受劑量給藥，以浸膏量5 g/kg溶于純凈水配成相應(yīng)濃度的灌胃液，再以10 mL/kg的給藥體積給藥[7].小鼠給藥前禁食12 h，稱(chēng)重之后進(jìn)行1次灌胃給藥(以5 g/kg給藥劑量給藥，此劑量大約是臨床10 g劑量的22倍)，對(duì)照組不做處理.對(duì)小鼠給藥后，密切觀察并記錄前4 h山姜水提物組和對(duì)照組小鼠的狀態(tài)，4 h后每間隔0.5 h觀察1次，8 h后觀察間隔時(shí)間延長(zhǎng)，共觀察7 d，記錄此期間小鼠的行為特征及體重變化.

2.3 亞急性毒性試驗(yàn)

小鼠給藥劑量的換算方法同2.2節(jié)，給藥劑量分別為1.3，2.6 g/kg.給藥當(dāng)天將小鼠按體重隨機(jī)分為山姜水提物低劑量組(給藥劑量為1.3 g/kg)、高劑量組(給藥劑量為2.6 g/kg)和對(duì)照組，共3組，每組5只雄性小鼠，對(duì)照組不做處理.每天用浸膏以純凈水配置成相應(yīng)濃度的灌胃液對(duì)山姜水提物各劑量組小鼠進(jìn)行灌胃，按照10 mL/kg的給藥體積灌胃給藥，每天灌胃1次，連續(xù)給藥15 d.給藥期間，每天觀察記錄小鼠的行為特征及體重變化.

2.4 尿素氮、肌酐含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活力的檢測(cè)

2.4.1 觀測(cè)指標(biāo) 每個(gè)試驗(yàn)快結(jié)束時(shí)(急性毒性試驗(yàn)第7 d，亞急性毒性試驗(yàn)第15 d)，小鼠均需要在末次給藥晚上禁食不禁水過(guò)夜.在兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)束后一天，即第8 d和第16 d，按10 mL/kg給藥體積向小鼠腹腔注射4%水合氯醛，將小鼠麻醉后采血，血液分別置于有肝素鈉和無(wú)肝素鈉的離心管中，于3 000 r/min，4 ℃的離心機(jī)中離心10 min，獲得的上清液分別為血漿和血清樣品，樣品置于-20 ℃冰箱備用，用于檢測(cè)尿素氮、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶等肝、腎功能生化指標(biāo).

2.4.2 尿素氮、肌酐含量的測(cè)定 待測(cè)血漿按照試劑盒說(shuō)明配成相應(yīng)的待測(cè)溶液后，利用酶標(biāo)儀在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，尿素氮含量的計(jì)算公式為：尿素氮(mmol/L)=(OD測(cè)定-OD空白)/(OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白)*10.

待測(cè)血漿按照試劑盒說(shuō)明配成相應(yīng)的待測(cè)溶液后，利用酶標(biāo)儀在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度.肌酐含量的計(jì)算公式為：肌酐(μmol/L)=(ΔA測(cè)定-ΔA空白)/(ΔA標(biāo)準(zhǔn)-ΔA空白)*C標(biāo)準(zhǔn)，其中ΔA=A2-K*A1(A1為加入酶溶液A后的吸光度值，A2為加入酶溶液B后的吸光度值，K為稀釋因子，數(shù)值為186/246).

2.4.3 谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力、谷草轉(zhuǎn)氨酶活力的測(cè)定 待測(cè)血清按照試劑盒說(shuō)明配成相應(yīng)的待測(cè)溶液后，利用酶標(biāo)儀在505 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管的OD值，OD絕對(duì)=OD測(cè)定-OD對(duì)照，根據(jù)試劑盒原始數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將OD絕對(duì)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算求得谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活力(卡門(mén)氏單位)，其中1卡門(mén)氏單位為0.482 U/L.

2.5 臟器系數(shù)的計(jì)算

在急性和亞急性毒性試驗(yàn)中，對(duì)小鼠腹腔注射4%水合氯醛，麻醉后采血，處死小鼠后收集其肝臟、腎臟、心臟、脾臟、腎臟稱(chēng)重并計(jì)算臟器系數(shù)，臟器系數(shù)指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某臟器的重量與其體重之比值(單位為mg/g).

2.6 組織病理學(xué)分析

將小鼠肝、腎、脾等組織置于4%甲醛固定液中固定后，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片(切片厚約4～5 μm)、H&E(伊紅和蘇木素染色)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖片，分析小鼠的組織病理變化.

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果分析

3.1 行為特征

在急性和亞急性毒性試驗(yàn)中，所有小鼠均未出現(xiàn)死亡.在急性毒性試驗(yàn)給藥后的前8 h，山姜水提物組部分小鼠出現(xiàn)舔足、舔毛、精神不振等行為，在8 h后均恢復(fù)正常.在亞急性毒性試驗(yàn)中，給藥后的第10天，山姜水提物高劑量組的部分小鼠出現(xiàn)豎毛現(xiàn)象.

3.2 體重變化

在急性毒性試驗(yàn)中，給藥后的7 d，山姜水提物組和對(duì)照組小鼠的體重均有逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)，如圖1所示.在進(jìn)行亞急性毒性試驗(yàn)的15 d中，對(duì)照組小鼠的體重隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，山姜水提物低劑量組和高劑量組小鼠的體重呈緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)，增長(zhǎng)幅度低于對(duì)照組，如圖2所示.

圖1 急性毒性試驗(yàn)7天內(nèi)小鼠的體重變化Fig. 1 Weight of Mice in 7 Days of the Acute Toxicity Test

圖2 亞急性毒性試驗(yàn)15天內(nèi)小鼠的體重變化Fig. 2 Weight of Mice in 15 Days of the Subacute Toxicity Test

3.3 臟器系數(shù)

在急性毒性試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，山姜水提物組各器官的臟器系數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，如表1所示.在亞急性毒性試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，山姜水提物高劑量組肝的臟器系數(shù)較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，山姜水提物低劑量組、高劑量組的心、肺、腎、脾臟器系數(shù)與對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，如表2所示.

表1 急性毒性試驗(yàn)小鼠臟器系數(shù)

表2 亞急性毒性試驗(yàn)小鼠臟器系數(shù)

3.4 肝、腎功能生化指標(biāo)

在急性毒性試驗(yàn)中，山姜水提物組的尿素氮、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)與對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，如表3所示.在亞急性毒性試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，山姜水提物高劑量組肌酐含量較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，山姜水提物高劑量組、低劑量組的尿素氮含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力、谷草轉(zhuǎn)氨酶活力與對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，如表4所示.

表3 急性毒性試驗(yàn)小鼠肝、腎生化指標(biāo)

表4 亞急性毒性試驗(yàn)小鼠肝、腎生化指標(biāo)

3.5 組織病理學(xué)檢查

肝組織H&E染色結(jié)果顯示，對(duì)照組肝細(xì)胞索和肝血竇大致呈放射狀排列，肝細(xì)胞圓潤(rùn)、飽滿(mǎn)，肝板排列規(guī)則、整齊.與對(duì)照組相比，急性毒性試驗(yàn)中水提物組小鼠肝組織未見(jiàn)明顯異常，見(jiàn)圖3所示.

圖3 急性毒性試驗(yàn)小鼠肝組織病理檢查(×100)Fig. 3 Liver Histopathological Examination in Acute Toxicity Test

4 討論

山姜在湘西土家族苗族自治州中廣泛分布，其根莖在民間廣泛用于治療上呼吸道感染及一些慢性呼吸系統(tǒng)疾病的急性發(fā)作，但是其用藥安全性尚未明確，僅有文獻(xiàn)報(bào)道山姜果實(shí)的水煎液和熱浸液無(wú)明顯急性毒性和亞急性毒性[8].因此，本研究通過(guò)急性毒性及亞急性毒性試驗(yàn)對(duì)山姜根莖的用藥安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)[9].急性毒性的常用評(píng)價(jià)方法包括LD50法、最大耐受劑量法、近似致死之劑量法、固定劑量法、上下法(階梯法)[10]、累積劑量設(shè)計(jì)法[11]等.由于山姜在湘西地區(qū)的應(yīng)用中認(rèn)為毒性較小或無(wú)毒，因此本研究選擇最大耐受劑量法對(duì)山姜根莖的用藥安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)其在人體中是否有慢性毒性，本研究進(jìn)行了時(shí)長(zhǎng)達(dá)15 d的亞急性毒性試驗(yàn)[12].

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在急性和亞急性毒性試驗(yàn)中，給藥后小鼠的精神狀態(tài)和生活狀態(tài)均表現(xiàn)良好，器官形態(tài)外觀無(wú)病理性變化.在急性毒性試驗(yàn)中，山姜水提物給藥組小鼠的臟器系數(shù)、尿素氮、肌酐含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力、谷草轉(zhuǎn)氨酶活力與對(duì)照組相比，均無(wú)明顯差異，提示山姜根莖水提物無(wú)明顯急性毒性.在亞急性毒性試驗(yàn)中，山姜水提物低劑量組和對(duì)照組相比，給藥15 d后體重有差異，但其增長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，提示山姜水提物無(wú)明顯毒性；山姜水提物高劑量組的肝系數(shù)與對(duì)照組相比較高，但小鼠的行為及狀態(tài)均正常，且谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，可能和體重較輕有關(guān)，因此認(rèn)為山姜水提物沒(méi)有明顯的肝毒性；當(dāng)腎臟功能受到損害，腎功能失代償時(shí)血清肌酐水平會(huì)上升[13-14]，而山姜水提物低劑量組、高劑量組的肌酐含量與對(duì)照組相比，均沒(méi)有明顯升高，提示山姜根莖水提物無(wú)明顯腎毒性.

綜上所述，山姜水提物的急性毒性和亞急性毒性不明顯或較低，臨床安全性上可視為較安全.本研究?jī)H為初步安全性評(píng)價(jià)，尚未進(jìn)行慢性毒性等試驗(yàn)研究，故山姜水提物的安全性仍有待進(jìn)一步研究，以期為其臨床應(yīng)用和新藥研發(fā)等增加理論依據(jù).