白及多糖提取工藝及抑菌活性檢測*

羅玲麗，匡勇斌，喻 淅，張 滔，馮秋菊

(吉首大學藥學院，湖南 吉首 416000)

白及(Bletillastriata)，又名連及草、雪如末、甘根，是蘭科白及屬多年生草本植物[1].味苦、甘、澀、性涼，有止血止痛的功效，常被作為一種止血藥物在臨床上推廣使用[2].研究發(fā)現(xiàn)白及中富含大量的粘膠類物質(zhì)，其主要成分是葡萄糖甘露聚糖，可溶于水形成比較粘稠的親水膠液，而白及的止血作用正是與其含有的粘膠類成分有關[3].白及膠有特殊的黏度特性，其理化性質(zhì)與阿拉伯膠類似，是一種低毒、安全的高分子聚合物，通過相關藥物活性成分的研究和表征，發(fā)現(xiàn)白及多糖有多種藥理作用，包括抗病毒[4]、抗菌[5-6]、抗氧化[7]和保濕[8]等功效.

目前，市場上的各種化妝品幾乎全是“化學化妝品”，其主要原料或半成品基本上是高級脂肪酸族化合物.近年來，具有抗氧化、保濕、美白等功效的天然產(chǎn)物護膚制品所占有的消費市場正在逐步擴大.天然浸提物化妝品的配料中主要含有植物浸提物或天然配料，其中所含有的合成化學配料較少或含量極低，將天然藥物活性成分加入到化妝品中，產(chǎn)品針對性強，性能較穩(wěn)定，護膚效力持久，作用溫和，刺激小，安全系數(shù)較高.植物成分提取方法簡易便行，添加后制得的相應產(chǎn)品療效顯著且毒副作用小，因而在國內(nèi)化妝品研發(fā)領域備受關注.現(xiàn)代研究較多探討白及植物的化學成分及生物活性，有關該屬植物民間傳統(tǒng)護膚利用的報道較少.為了開發(fā)效果更好的藥妝用品，本研究將提取武陵山區(qū)白及的有效活性成分，并將其添加于現(xiàn)代化妝品中，制成天然植物白及系列化妝品，如白及膏.

本研究對白及多糖的提取工藝和抑菌作用進行了初步探討，為后續(xù)白及膏的制作奠定了一定的基礎.依據(jù)相似相溶原理采用適宜的溶劑萃取白及中多糖，根據(jù)溶劑性質(zhì)的不同，提取方法有熱水浸提法[9]、酸提法[10]和堿提法[11]等.因為多糖是極性大分子化合物，不溶于有機溶劑[10]，因此本研究采用水提醇沉法來提取白及多糖.本研究對白及多糖水提條件進行正交優(yōu)化設計研究，設置不同料液比、提取溫度、提取時間，以多糖提取率為指標，確定不同因素條件下的最佳提取條件，將提取的白及多糖粗品按照一定配比制得白及膏，對白及膏進行抑菌性能檢測，旨在為白及化妝品行業(yè)的綜合開發(fā)利用提供參考依據(jù)，拓展中藥白及的藥用范圍和開發(fā)利用價值.

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

材料：白及(購自藥店，產(chǎn)自貴州)；試劑：濃硫酸、蒽酮、氯仿、Na2HPO4、KH2PO4、正丁醇、牛肉膏、蛋白胨等(所有試劑純度均為分析純).

儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE 2000A)；電子天平；電熱鼓風干燥箱(BGZ-76)；萬能粉碎機；醫(yī)用離心機(L530)；真空干燥箱(BZF-50)；立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-50SII).

1.2 實驗方法

1.2.1 白及原材料的預處理 將購買的白及飲片平鋪于烘盤中，于60 ℃的熱恒溫鼓風干燥箱中干燥至恒重，使用中藥粉碎機粉碎，過20目篩后裝入密封袋備用.

1.2.2 白及多糖的提取 準確稱取白及粉末3 g，置于錐形瓶中，加入75 mL蒸餾水，在80 ℃恒溫水浴鍋中恒溫提取2.0 h，將得到的提取液過4層紗布，收集濾液，濃縮得到一定體積的水提物，向濃縮后的濾液中加入Sevage試劑(氯仿∶正丁醇體積比為5∶1)，濾液與Sevage試劑的體積比為5∶1，充分振蕩搖勻，于高速離心機3 500 r/min下離心15 min，取上清液，加入與上清液同等體積的95%乙醇，充分攪拌后，密封，室溫下醇沉2.0 h，抽濾，濃縮到一定體積后進行真空干燥，獲得白及總多糖粗品，對其稱重后暫存冰箱備用.

1.2.3 白及多糖的測定 參照張曉靜[12]的方法，精密稱取干燥的無水葡萄糖標準品配制成0.1 g/L的葡萄糖標準液，吸取標準液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL于試管中，分別加水至2 mL，在冰水浴中加入0.2%蒽酮-濃硫酸溶液8.0 mL，置于沸水浴中反應10 min，取出置于冰水浴中10 min.以0.0 g/L葡萄糖標準溶液為空白對照，在620 nm波長條件下測定各溶液的吸光值Abs.以葡萄糖的濃度作為X軸，Abs值作為Y軸，繪制標準曲線，得回歸方程Y=5.581 0X+0.026 4，R2=0.993.準確吸取2.0 mL白及總多糖溶液代替葡萄糖標準品溶液，并按照上述流程進行實驗，重復3次，于620 nm波長下測定樣品的吸光度，按照下列公式計算白及的總多糖提取率：

白及總多糖提取率W=(C×V/m)×100%.

其中：C為樣品中多糖的質(zhì)量濃度，g/L；V為樣品的定容體積，mL；m為白及粉末干重，g.

1.2.4 單因素實驗 按1.2.2節(jié)方法提取制備白及多糖粗品，以料液比1∶25(g∶mL)、提取溫度80 ℃、提取時間2.0 h、體積分數(shù)95%乙醇為基礎水平，依次考察白及總多糖提取工藝中料液比(1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40(g∶mL))，提取溫度(50，60，70，80，90 ℃)，提取時間(2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 h)對提取率的影響(表1).在考察單一因素影響時，其他影響因素水平與基礎水平保持一致，以白及總多糖提取率為指標，繪制各因素對白及多糖提取率的影響曲線圖.

表1 白及總多糖提取單因素實驗水平表

1.2.5 正交優(yōu)化實驗 以單因素實驗結(jié)果為基礎，考慮經(jīng)濟成本和操作等因素，選擇料液比、提取溫度和提取時間進行3因素3水平設計正交實驗，因素水平表見表2.

表2 白及總多糖正交實驗因素水平表

1.2.6 抑菌研究 將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌種接種于牛肉膏蛋白胨的斜面培養(yǎng)基中，在37 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24.0 h，用無菌生理鹽水稀釋制成菌懸液.用打孔器將吸水性較強的濾紙打成直徑為6.0 mm的圓形濾紙片，烘干滅菌后分別浸泡于質(zhì)量濃度為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.33，0.66 g/mL的白及提取物中，浸泡時間為2.0 h，浸泡后再烘干備用.對照組則浸泡在無菌水中，其他處理條件同前.

抑菌實驗操作如下：用移液器移取300 μL菌懸液于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，用三角形涂布器將菌懸液均勻涂于培養(yǎng)基上，用白及提取物浸泡處理過的濾紙貼于平板上，每個平板貼3片，其中1片為空白對照，放入37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24.0 h后，取出測定抑菌圈直徑，比較抑菌效果.每種細菌平行接種3個平板.

白及膏化妝品配方：參考馬世宏等[13]工藝方法，對其進行改進，按照雙氧水∶甘油∶丙二醇體積比為5∶3∶3的比例配置A相組分，二甲基硅油∶羊毛脂∶硬脂酸∶十六醇體積比為2∶3∶2∶2的比例配置B相組分，白及提取物∶去離子水體積比為3∶7的比例配置C相組分.將B相攪拌加熱至85 ℃，保溫20 min；A相與C相攪拌加熱至45 ℃，將B相加入A相與C相混合液中，合并在乳化設備中乳化30 min，冷卻至45 ℃，加入C相攪拌均勻后冷卻至40 ℃出料，制得成品后取1 mg溶于1 mL無菌水中備用，進行抑菌測試，方法與白及多糖提取液測定方法相同.將藥店購買的一夫百應抑菌膏作為陽性對照，同法測定其抑菌性.

表3 白及膏配方

2 結(jié)果

2.1 標準曲線

使用蒽酮-濃硫酸法測定白及提取物的總多糖，以葡萄糖溶液作為對照品繪制標準曲線，如圖1所示.

圖1 葡萄糖溶液的標準曲線Fig. 1 Glucose Standard Curve

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 料液比對白及多糖提取率的影響 如圖2所示，在料液比為1∶20～1∶35(g∶mL)范圍內(nèi)，隨著提取溶劑的體積不斷增大，白及多糖提取率也不斷增加，當料液比為1∶35(g∶mL)時，白及多糖提取率達到最大值17.09%，而繼續(xù)增大料液比，白及多糖提取率呈現(xiàn)下降趨勢，可能是由于在料液比為1∶35(g∶mL)時達到了白及多糖提取的最大飽和，因此本研究選擇1∶35(g∶mL)作為最優(yōu)料液比.

圖2 料液比對白及多糖提取率的影響Fig. 2 Effect of Material to Liquid Ratio on Bletilla striata Polysaccharide Extraction Efficiency

2.2.2 提取溫度對白及多糖提取率的影響 如圖3所示，溫度從50 ℃升高到90 ℃，隨著提取溫度的不斷升高，白及多糖提取率也逐漸增加，可能是因為溫度的升高加劇了分子熱運動和分子擴散運動，這有利于白及多糖的溶出，從而增加了白及多糖提取率.在80 ℃前后，白及多糖提取率的變化前者大于后者，可能是較高的溫度對白及多糖產(chǎn)生了分解破壞作用，因而提取率的增加幅度有所降低.因此本研究選擇80 ℃作為最優(yōu)提取溫度.

圖3 提取溫度對白及多糖提取率的影響Fig. 3 Effect of Temperature on Total Bletilla striata Polysaccharide Extraction Efficiency

2.2.3 提取時間對白及多糖提取率的影響 如圖4所示，提取時間從2 h延長至6 h，隨著提取時間的延長，白及多糖提取率不斷增加，可能是因為提取時間越長，越能夠使白及多糖充分地溶解出來.白及多糖提取率在3 ～ 4 h的變化率大于4 ～ 5 h，考慮到實際情況，本研究選擇4 h作為最優(yōu)提取時間.

圖4 提取時間對白及多糖提取率的影響Fig. 4 Effect of Time on Total Bletilla striata Polysaccharide Extraction Efficiency

2.3 正交優(yōu)化實驗結(jié)果

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選取表2中不同水平因素進行正交優(yōu)化，對結(jié)果進行極差分析以此來確定最佳的提取條件.由表4中的極差分析數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出來，極差R(B)>R(C)>R(A)，說明3個因素對白及多糖的提取影響大小依次為提取溫度(B)、提取時間(C)、料液比(A)，其中提取溫度對提取效果影響最為顯著.根據(jù)正交設計系列實驗可得，白及多糖的最佳提取條件為A2B1C2，即料液比1∶35(g∶mL)，提取溫度80 ℃，提取時間4.0 h，在此提取條件下白及多糖得率為25.97%.

表4 白及總多糖正交實驗結(jié)果

2.4 抑菌實驗結(jié)果

采用濾紙片法測定白及多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用，設置不同質(zhì)量濃度梯度白及多糖進行測試(質(zhì)量濃度分別為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 g/mL)，測定樣品及對照品的抑菌圈直徑大小.由圖5可知在該濃度梯度下抑菌圈均不明顯，可知在上述濃度梯度范圍內(nèi)白及多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果不明顯.

從左到右，白及多糖質(zhì)量濃度依次為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 g/mL，A為對照品圖5 不同質(zhì)量濃度白及多糖的抑菌效果Fig. 5 Inhibitory Effect of Different Concentrations of Bletilla striata Polysaccharid

為進一步驗證白及多糖的抑菌效果，選取市售的一夫百應抑菌膏作為陽性對照，增大白及多糖提取液濃度進行抑菌測試，同時對制備的白及膏也進行了抑菌測試.由表5、圖6可知，當白及多糖提取液質(zhì)量濃度增大至0.33 g/mL和0.66 g/mL時，其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用明顯增強.尤其是當質(zhì)量濃度達到0.66 g/mL時，白及多糖提取液對大腸桿菌的抑菌效果優(yōu)于一夫百應抑菌膏.與一夫百應抑菌膏相比，白及膏對大腸桿菌的抑菌效果良好，而對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較差.

表5 不同樣品的抑菌測試

A—無菌蒸餾水對照品；B—0.33 g/mL的白及多糖提取液；C—0.66 g/mL的白及多糖提取液；D—市售的一夫百應抑菌膏；E—白及膏.圖6 不同質(zhì)量濃度試劑對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果Fig. 6 Inhibitory Effect of Different Reagent Concentrations on Escherichia Coli and Staphylococcus Aureus

3 結(jié)論

本研究采用水提醇沉法提取白及多糖，設計單因素實驗、正交優(yōu)化實驗確定白及多糖的最優(yōu)提取工藝為料液比1∶35(g∶mL)，提取溫度80 ℃，提取時間4.0 h，在此提取條件下，白及多糖提取得率為25.97%.當白及多糖質(zhì)量濃度為0.33 g/mL時，其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用，當質(zhì)量濃度提高至0.66 g/mL時，白及多糖提取液抑菌效果較強，對大腸桿菌的抑菌效果優(yōu)于市售的一夫百應抑菌膏.本研究結(jié)果可為白及后期的抑菌研究提供理論依據(jù)，為進一步開發(fā)其相關抑菌性研究奠定基礎.關于處方白及膏的制備，其抑菌效果雖低于市售抑菌膏，但也證實處方的白及抑菌性能存在進一步提高的空間，仍需進一步研究.