TLR7基因單核苷酸多態(tài)性與江蘇淮安哮喘患者易感性的相關(guān)性研究①

邢 飛 周 瑾 姜玉新 金 躍 （徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，淮安 223002）

支氣管哮喘以慢性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和可逆性氣流受限為特征。主要涉及肥大細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞。在臨床上，其傾向于出現(xiàn)反復(fù)呼吸困難、喘息、咳嗽和胸部不適等癥狀。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球約有3.34 億人口罹患哮喘，每年約有18 000 人死于哮喘［1］。經(jīng)典理論認(rèn)為，Th1/Th2失衡是支氣管哮喘發(fā)病的重要免疫機(jī)制。迄今為止，許多研究評(píng)估了基因變異和哮喘易感性間的關(guān)系。Toll 樣受體家族（Toll-like receptors，TLRs）在各種免疫細(xì)胞中表達(dá)，包括抗原呈遞細(xì)胞和首次遇到傳入病原體的細(xì)胞（如上皮細(xì)胞），特別是樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）在初始病原體感測(cè)和免疫應(yīng)答的啟動(dòng)中發(fā)揮重要作用。DCs 是否促進(jìn)Th1 或Th2 狀態(tài)（以不同的細(xì)胞因子為特征）在很大程度上取決于觸發(fā)TLR 的方式，而這種方式又取決于感染的類型［2-3］。TLR7 為 TLRs 家族成員，主要識(shí)別病毒單鏈RNA，通過MyD88信號(hào)途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素及核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo) IFN-β 等炎癥細(xì)胞因子表達(dá)［4］。單個(gè)基因的異常可導(dǎo)致整個(gè)TLR7 信號(hào)通路缺陷，研究證實(shí)TLR7 位點(diǎn)多態(tài)性與多種免疫性疾病易感性相關(guān)［5］。本研究采用病例對(duì)照研究方法，探討TLR7單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與哮喘發(fā)病危險(xiǎn)度的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象 哮喘患者158例設(shè)為哮喘組，患者均為2018 年3 月至2020 年10 月淮安市第二人民醫(yī)院收治的門診和住院患者，均為淮安市常住人口（≥10 年），年齡16～75 歲，平均為（44.94±19.51）歲。所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸分會(huì)哮喘學(xué)組制定的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)（2008 年修訂）；健康志愿者137 例設(shè)為對(duì)照組，均為徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院體檢中心各項(xiàng)指標(biāo)正常的人群，年齡13～65歲，平均為（33.57±15.31）歲，均無過敏性疾病癥狀或心血管病史。人口一般特征統(tǒng)計(jì)見表1。以上所有研究對(duì)象均簽有知情同意書。

表1 哮喘組與對(duì)照組人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征Tab.1 Demographic characteristics of asthmatic and control group

1.1.2 主要試劑 人類基因組提取試劑盒及引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及DNA 提取 采集受檢者外周靜脈血2 ml，用人類基因組提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（NCBI）及Hapmap數(shù)據(jù)庫公布的人類DNA 核酸序列設(shè)計(jì)特異性引物（表2），送至生工生物公司合成。

表2 3個(gè)位點(diǎn)的基因序列Tab.2 Gene sequences of three loci

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 反應(yīng)體系 50 μl；模版3 μl，引物1 μl，dNTP 1 μl，10×Buffer 5 μl，Tap 酶 0.5 μl，雙蒸水 34.5 μl，MgCl24 μl；反 應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性5 min，94℃ 變性40 s，56℃ 退火30 s，72℃ 延伸40 s，35 個(gè)循環(huán)，最后 72℃ 延伸 5 min。取 5 μl PCR 產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，電泳25 min，在SyngeneG：BOX熒光凝膠成像系統(tǒng)下分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布的定量資料以表示，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。基因頻率采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算，使用Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律檢測(cè)樣本可靠性。組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，并計(jì)算OR值和95%CI。不同基因位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)哮喘相對(duì)危險(xiǎn)度采用單變量Logistic 回歸分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡檢測(cè) 哮喘組和對(duì)照組進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)結(jié)果顯示樣本均符合Hardy-Weinberg 遺傳規(guī)律（P＞0.05，表3），說明研究樣本可進(jìn)行后續(xù)分析。

表3 Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Hardy-Weinberg test results

2.2 基因型頻率和等位基因頻率比較 對(duì)rs179009、rs179019、rs5935436 位點(diǎn)在哮喘組與對(duì)照組中基因型頻率和等位基因頻率分布比較顯示見表4、表5。在江蘇淮安地區(qū)漢族人群哮喘組rs179009基因型分布與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），等位基因G 高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而rs5935436 位點(diǎn)基因型分布與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），等位基因C 與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。rs179019位點(diǎn)基因型分布與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且等位基因C 與正常對(duì)照組相比，結(jié)果亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 哮喘組與對(duì)照組TLR7各位點(diǎn)基因頻率分布［例（%）］Tab.4 Frequency distribution of TLR7 gene each loci genotypes in asthma and control group［n（%）］

表5 哮喘組與對(duì)照組TLR7 各位點(diǎn)等位基因頻率分布［例（%）］Tab.5 Frequency distribution of TLR7 gene each loci alleles in asthma and control group［n（%）］

2.3 基因型相對(duì)危險(xiǎn)度 如表6 所示，rs179009 基因位點(diǎn)相對(duì)GG 基因型而言，AA 與GA+AA 基因型均能增加哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)性，而GA 基因型與哮喘發(fā)病無相關(guān)性；rs179019基因位點(diǎn)相對(duì)CC基因型而言，AA與CA+AA基因型，亦能增加哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)性，而CA 基因型未發(fā)現(xiàn)與哮喘發(fā)病有相關(guān)性；rs5935436基因位點(diǎn)CT、TT型及CT+TT較CC型差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表6 各位點(diǎn)不同基因型對(duì)哮喘的相對(duì)危險(xiǎn)度Tab.6 Relative risk of asthma for different genotypes at each loci

3 討論

哮喘是一種復(fù)雜的疾病，涉及多種物質(zhì)（例如細(xì)胞因子）的細(xì)胞分泌及其他多種因素影響。其中遺傳因素和環(huán)境因素間的相互作用可導(dǎo)致各種并發(fā)癥的發(fā)生，以反復(fù)發(fā)作的喘息、咳嗽、氣促、胸悶為主要特征，發(fā)病率逐年增高［6］。在臨床實(shí)踐中確定患者對(duì)哮喘的超敏水平至關(guān)重要。

TLR 是目前發(fā)現(xiàn)的一種模式識(shí)別受體，能夠特異性識(shí)別細(xì)菌、病毒等多種病原微生物，進(jìn)而激活機(jī)體對(duì)病原微生物的非特異性免疫應(yīng)答［7］。其受體家族（TLRs），尤其是 TLR3、TLR7、TLR8 和TLR9 是啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答的重要分子，發(fā)揮重要的抗病毒效應(yīng)功能［8］。人類TLR7 基因位于性染色體Xp22上，TLR7 介導(dǎo)機(jī)體抗病毒免疫，在天然和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用。支氣管哮喘是以Th2應(yīng)答為主的免疫失衡，激活TLR7 信號(hào)途徑導(dǎo)致NF-κB 活化及促炎因子（如IFN-α、TNF-α和IL-12）分泌，進(jìn)而使免疫應(yīng)答偏向 Th0 甚至 Th1 方向［9］。既往多項(xiàng)研究表明，TLR7 激動(dòng)劑可防止Th2 介導(dǎo)的氣道炎癥中卵清蛋白誘導(dǎo)小鼠發(fā)生哮喘［10-13］。TLR7 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用不僅限于Th2定向炎癥的動(dòng)物模型。近期有報(bào)道稱哮喘患者青少年TLR7 功能減弱，哮喘患者中由鼻病毒（TLR7的天然配體）誘導(dǎo)的干擾素缺乏，但在控制良好的哮喘患者中沒有TLR7 功能減弱［14-15］。以上研究表明TLR7 在哮喘的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。國(guó)內(nèi)外TLR7 基因位點(diǎn)rs179007 多態(tài)性集中在肝臟免疫疾病的研究。ZHU 等［16］研究發(fā)現(xiàn)TLR7基因多態(tài)性在中國(guó)成年人慢性乙型肝炎感染進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，并且可能部分解釋了中國(guó)男性中HBV相關(guān)疾病高發(fā)病率的原因。FAKHIR 等［17］研究發(fā)現(xiàn) TLR7 基因 rs179008-T 和 rs179009-G 等位基因在男女中均增加了HCV 疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。而M?LLER-LARSEN 等［18］研究發(fā)現(xiàn) TLR7 和 TLR8 相關(guān)的4種表型（哮喘、鼻炎、特應(yīng)性皮炎和特異性IgE均升高）中，TLR7和TLR8的SNP與單倍型均存在顯著關(guān)聯(lián)。哮喘發(fā)病與TLR7 基因位點(diǎn)rs179008 多態(tài)性具有較強(qiáng)的相關(guān)性。TORMANEN 等［19］研究發(fā)現(xiàn)TLR7 基因位點(diǎn)rs179008 多態(tài)性可能增加?jì)雰好?xì)支氣管炎后學(xué)齡前兒童患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)。而ZHANG等［20］在研究 TLR7 和 TLR8 多態(tài)性與中國(guó)漢族人群哮喘發(fā)病相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn)TLR7 和TLR8 基因多態(tài)性可能在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，其中rs179009 基因位點(diǎn)與哮喘患者FEV1%及哮喘嚴(yán)重度相關(guān)。SHAN 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，與健康志愿者相比，哮喘患者中TLR7 rs179009 基因型頻率更高，與本研究結(jié)果基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)TLR7 基因位點(diǎn)rs179009與江蘇淮安地區(qū)漢族哮喘顯著相關(guān)。而對(duì)于rs179019 位點(diǎn)研究多集中在其他免疫疾病方面。KAWASAKI 等［22］發(fā)現(xiàn) TLR7 內(nèi)含子 SNP rs179019 和系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)，在亞洲人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡中有易感性。RAAFAT等［23］研究發(fā)現(xiàn)rs179019多態(tài)性在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和對(duì)照組間的基因型分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ZHANG等［24］研究發(fā)現(xiàn)TLR7基因rs179019位點(diǎn)的A等位基因不是嚴(yán)重手足口病的危險(xiǎn)因素。YUE 等［25］確定了 TLR7（rs179019/rs3853839）C 等位基因與中國(guó)女性HCV 的發(fā)生有關(guān)，CC 型和AC 型單倍型具有針對(duì)中國(guó)女性的HCV 持久性的保護(hù)作用。BARBARASH 等［26］發(fā)現(xiàn) TLR7 中 rs179019位點(diǎn)與廣東女性患Graves 病的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。本次研究發(fā)現(xiàn)rs179019 位點(diǎn)多態(tài)性與江蘇淮安哮喘患者發(fā)病相關(guān)。TLR7基因rs5935436位點(diǎn)與免疫性疾病相關(guān)性研究相對(duì)較少，TRAKS 等［27］發(fā)現(xiàn) TLR7 SNP rs5935436、rs179013 和 rs179008 區(qū)域在整個(gè)白癜風(fēng)及其亞組分析中產(chǎn)生了較弱的等位基因關(guān)聯(lián)。ZHANG 等［20］發(fā)現(xiàn) rs5935436SNP 的 T 等位基因?qū)δ行韵陌l(fā)展有保護(hù)作用。rs5935436 的CT/TT 基因型在患有過敏性鼻炎的女性哮喘患者中偶爾出現(xiàn)。SHAN 等［21］發(fā)現(xiàn) TLR7 基因 rs5935436 的啟動(dòng)子區(qū)域SNP 與慢性阻塞性肺疾病和非小細(xì)胞肺癌的風(fēng)險(xiǎn)均相關(guān)。SHAN 等［21］研究表明 TLR7 rs5935436位點(diǎn)SNP 與小兒哮喘間不存在顯著相關(guān)性，與本研中TLR7 rs5935436 位點(diǎn)與淮安漢族人群哮喘發(fā)病無相關(guān)性的結(jié)論一致。

綜 上 ，TLR7 基 因 位 點(diǎn) rs179009、rs179019 和rs5935436 多態(tài)性與各類免疫系統(tǒng)疾病相關(guān)性不盡相同，提示種族差異和遺傳背景的不同可能會(huì)影響TLR7 基因多態(tài)性在免疫疾病遺傳機(jī)制中的作用。本研究表明TLR7 基因3 個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性在哮喘易感基因中表現(xiàn)亦不同，這可能與哮喘發(fā)病的復(fù)雜性有關(guān)?？傊煌貐^(qū)人群的基因SNP 與同一疾病的相關(guān)性不同，今后需選取更大樣本，更多人群，多種族開展研究，以便為哮喘的治療提供可靠依據(jù)。