系統(tǒng)性紅斑狼瘡合并動脈粥樣硬化動物模型及其發(fā)病機制研究進展①

楊 月 劉一凡 薛 鸞 （上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院風(fēng)濕科，上海 200437）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是由自身免疫介導(dǎo)的，以免疫性炎癥損傷為特點的結(jié)締組織疾病，由于細(xì)胞和體液免疫功能障礙，產(chǎn)生多種自身抗體，其炎癥損傷可累及皮膚、漿膜、關(guān)節(jié)、腎臟及中樞神經(jīng)等全身多個系統(tǒng)及器官，臨床表現(xiàn)多樣，病情變化多端。全身不同程度的血管炎作為其發(fā)病的病理基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為各種免疫復(fù)合物在血管壁沉積，從而激活補體系統(tǒng)，引起發(fā)病。

近年研究發(fā)現(xiàn)，心血管病變是SLE 常見的并發(fā)癥，其中又以冠狀動脈粥樣硬化性疾病為主，其是導(dǎo)致SLE患者死亡的重要原因之一［1-2］。SLE合并早發(fā)的動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)病機制目前并不明確，傳統(tǒng)危險因素并不能完全解釋其發(fā)病，因此，建立合適的SLE 合并AS 的動物模型并深入研究其可能的發(fā)病機制就成為研究的重點。本文就現(xiàn)有的常用SLE 合并AS 的小鼠模型做一簡要闡述（總結(jié)如表1）。

表1 SLE合并AS小鼠模型Tab.1 Mouse model of SLE with AS

1 雜交純化模型

lpr 和 gld 品系小鼠分別在 Fas 和 FasL 基因位點上存在突變，而Fas/FasL 信號通路是調(diào)控細(xì)胞凋亡的信號通路之一，從而導(dǎo)致大量的淋巴細(xì)胞異常增殖，出現(xiàn)與人類SLE 相似的特異性自身抗體［3-4］。以C57BL/6 為背景的載脂蛋白 E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除小鼠（ApoE-/-mice）和低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）基因敲除小鼠（LDLr-/-mice）是目前用來研究AS 的經(jīng)典動物模型［5］。ApoE 是一種富含精氨酸的堿性蛋白，具有調(diào)節(jié)膽固醇和脂蛋白代謝的功能。因此，ApoE基因的缺失能夠?qū)е潞心懝檀嫉奈镔|(zhì)在血管中不斷積聚，最終形成AS。LDLR 是一類單鏈糖蛋白膜受體，主要功能是介導(dǎo)血漿中富含膽固醇的低密度脂蛋白進入胞內(nèi)代謝分解，清除血管中的多余脂質(zhì)，LDLR 功能異常將導(dǎo)致體內(nèi)脂代謝紊亂。因此，通過將SLE 和AS 兩種模型的小鼠雜交純化從而獲得同時具備SLE 和AS 表現(xiàn)的小鼠模型就被率先提出。

最早在 2004 年，APRAHAMIAN 等［6］首先將同是C57BL/6背景的ApoE-/-和gld小鼠交配，選取其中的 4 種純合子基因型：ApoE-/-、gld、gld. ApoE-/-以及ApoE+/+gld+/+（WT）。雖然 gld. ApoE-/-小鼠的高膽固醇血癥較ApoE-/-小鼠輕，但gld. ApoE-/-小鼠的主動脈斑塊面積較ApoE-/-小鼠明顯增多。gld.ApoE-/-小鼠不僅ANA、aCL 和IgG 的水平較其余3 組明顯升高，同時脾腫大和淋巴結(jié)增生、腎小球體積增大和蛋白尿的生成也較其余3組嚴(yán)重。以上表現(xiàn)在高脂飲食時更明顯。gld. ApoE-/-小鼠在動脈斑塊、淋巴結(jié)、血液中均可見凋亡核碎片增加，但在淋巴結(jié)檢查發(fā)現(xiàn)吞噬凋亡碎片的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯下降。該模型的發(fā)病機制可能與凋亡物質(zhì)增加而巨噬細(xì)胞吞噬功能不足有關(guān)，可見，凋亡細(xì)胞清除障礙同時加重了該模型的AS 和免疫表型。王世穎等［7-8］也通過這種方法成功建立了SLE合并AS的小鼠模型，同時發(fā)現(xiàn)gld.ApoE-/-小鼠體內(nèi)內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）數(shù)量減少，且骨髓EPCs 黏附、吞噬及促血管生成功能受損，這可能是狼瘡伴AS發(fā)生的原因之一。WATKINS 等［9］還發(fā)現(xiàn)干擾素調(diào)節(jié)因子5（interferon regulatory factor 5，IRF5）在該模型SLE 合并AS 病變中起到了特殊的調(diào)節(jié)作用。IRF5缺乏可改善狼瘡病情，但可促進AS 和代謝功能障礙。這可能與IRF5缺乏導(dǎo)致的Toll樣受體7（TLR7）和 Toll 樣受體 9（TLR9）信號下游抗 AS 細(xì)胞因子IL-10的減少有關(guān)。

辛伐他汀和嗎替麥考酚酯治療均可改善gld.ApoE-/-小鼠的 AS 和免疫表型［10-11］。常規(guī)劑量的辛伐他汀不僅對gld.ApoE-/-小鼠主動脈斑塊病變范圍有緩和的抑制作用（25%），其對免疫的改善更顯著，其中淋巴組織增生和脾腫大下降達(dá)到66%和48%，ANA 滴度下降57%，蛋白尿和腎小球增生基本恢復(fù)正常，其作用機制和調(diào)控Th1/Th2 細(xì)胞因子平衡相關(guān)，抑制促炎因子TNF-α、IFN-γ的釋放，促進抗炎因子IL-4、IL-10 的表達(dá)，并最終減少凋亡碎片聚集。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）激動劑羅格列酮是一種常用的胰島素增敏劑，同時具有免疫調(diào)節(jié)作用。APRAHAMIAN 等［12］研究發(fā)現(xiàn)羅格列酮通過誘導(dǎo)脂聯(lián)素能夠降低gld. ApoE-/-小鼠的ANA 水平和腎臟病變程度，減輕AS病變。

與此相似，F(xiàn)ENG 等［13］在 2007 年通過將 ApoE-/-和lpr小鼠交配獲得了另一種同時具備狼瘡和AS的ApoE-/-Fas-/-C57BL/6 小鼠。該模型鼠同時表現(xiàn)為狼瘡腎炎、AS 和骨量減少。在該模型中，抗氧化磷脂（OxPL）IgG抗體含量增加與動脈斑塊面積、腎小球叢面積呈正相關(guān)，與骨密度和骨體積分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)，提示共享的信號通路可能促進以上3種疾病的發(fā)生。

LEWIS 等［14］還使用 LDLr-/-小鼠與 Sle16 小鼠雜交產(chǎn)生了Sle16. LdLr-/-小鼠。Sle16 小鼠又稱B6.129chr1b小鼠，是在1號染色體攜帶一個起源于129 小鼠的間隔［15］。盡管 Sle16 小鼠在血清中具有高水平的自身抗體，腎臟中沉積了高水平的IgG 和C3，但僅表現(xiàn)為輕度增生性腎小球腎炎。在此種易感狼瘡背景下，高脂肪飲食不僅會導(dǎo)致Sle16.LdLr-/-小鼠AS斑塊范圍增加，還會使斑塊組成發(fā)生質(zhì)的變化，凋亡細(xì)胞增加，抗ds-DNA 抗體、抗ss-DNA 抗體及抗chromatin 抗體滴度升高，從而導(dǎo)致更嚴(yán)重的病變。SLE 加速的AS 和腎臟炎癥與免疫復(fù)合物的形成和系統(tǒng)補體的耗竭密切相關(guān)。高脂血癥會增強腎免疫復(fù)合物介導(dǎo)的補體沉積和腎炎的發(fā)展，而加速AS 的發(fā)生與補體的耗竭和凋亡碎片攝取的減少有關(guān)。這些結(jié)果提示積極治療SLE患者高脂血癥可減少狼瘡性腎炎的發(fā)生，降低加速AS的風(fēng)險。

2 誘導(dǎo)模型

Pristane 的化學(xué)名是2，6，10，14-四甲基十五烷（2，6，10，14-tetramethylpentadecane）。SATOH 等［16］1995 年發(fā)現(xiàn)給非自發(fā)性免疫鼠BALB/c 鼠1 次性腹腔注射Pristane 0.5 ml 可成功誘導(dǎo)小鼠狼瘡，之后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)非自身免疫性小鼠對Pristane 的易感性普遍存在，其中包括C57BL/6 小鼠［17］。該造模方法小鼠外周血循環(huán)產(chǎn)生大量的ANA 抗體、anti-dsDNA 抗體、抗 snRNP/Sm 抗體、anti-Su 抗體等，同時可導(dǎo)致腎小球腎炎、蛋白尿、關(guān)節(jié)炎等病變，跟人類SLE 具有相似的血清特異性抗體和腎臟免疫復(fù)合物沉積，有較好的相關(guān)性［18］。目前該方法已成為誘導(dǎo)型狼瘡小鼠模型最常用方法，是唯一在IFN-Ⅰ升高特征上與人類 SLE 相似的動物模型［19］。LEE 等［20-21］發(fā)現(xiàn)腹腔未成熟的Ly6Chigh單核細(xì)胞的聚集是Pristane 處理的小鼠體內(nèi)IFN-Ⅰ的主要來源，Ly6Chigh單核細(xì)胞耗竭后IFN-Ⅰ的表達(dá)迅速消失。Pristane 僅通過TLR7 和髓樣分化因子88（MyD88）依賴通路誘導(dǎo)IFN-Ⅰ的產(chǎn)生、單核細(xì)胞的募集和自身抗體的產(chǎn)生。TLR7 缺失不僅可以消除Pristane 誘導(dǎo)的IFN-Ⅰ產(chǎn)生，還可消除自身抗體的產(chǎn)生，提示TLR7/MyD88/IFN-Ⅰ通路在該模型中發(fā)揮關(guān)鍵作用［22］。

近年來，通過AS模型鼠誘導(dǎo)狼瘡模型的研究逐漸增多。ZHANG 等［23］對 ApoE-/-小鼠進行腹腔注射Pristane，ApoE-/-pristane 組小鼠出現(xiàn) ANA、ENA 水平升高和脾腫大，其中包括抗Sm、抗nRNP、抗核糖體抗體，符合SLE 的特征。且ApoE-/-pristane 組小鼠動脈斑塊的膠原含量明顯下降，凋亡細(xì)胞增多。Pristane能夠增加AS 斑塊的易損性，這與IFN-I 的活化密切相關(guān)。

3 骨髓移植嵌合體模型

MOREL等［24］在1996年描述了NZM2410小鼠株中3個主要的染色體區(qū)間，分別為Sle1、Sle2和Sle3，它們與狼瘡易感性高度相關(guān)。STANIC 等［25］將B6.Sle1.2.3三倍同源小鼠的狼瘡易感性表型轉(zhuǎn)移到受致命性輻射、AS 易感的LDLr-/-小鼠體內(nèi)，從而制造骨髓移植嵌合體模型LDLr.Sle。LDLr.Sle小鼠表現(xiàn)出狼瘡樣病變，以雙鏈DNA 抗體升高和腎臟病變?yōu)樘卣鳌＝?jīng)過高脂飲食喂養(yǎng)，盡管LDLr.Sle 較LDLr.B6 小鼠出現(xiàn)更為嚴(yán)重的AS 病變，但LDLr. Sle 小鼠的膽固醇和甘油三酯水平卻較LDLr.B6 小鼠低，且兩種小鼠的血壓水平無明顯差異，血清肌酐和尿素氮水平與動脈斑塊面積無明顯相關(guān)性，證明除了血脂異常、腎臟病變、高血壓，還有其他機制導(dǎo)致了該狼瘡易感小鼠的AS 進展。LDLr.Sle 小鼠的斑塊部位出現(xiàn)更多的炎癥細(xì)胞浸潤，外周CD4+T 細(xì)胞和B 細(xì)胞高度活化，出現(xiàn)明顯升高的抗氧化低密度脂蛋白抗體和抗心磷脂抗體。

BRAUN 等［26］還發(fā)現(xiàn)普通飲食和高脂飲食對于LDLr.Sle 小鼠狼瘡表型和加速AS 的出現(xiàn)以及斑塊部位增多的CD4+T 細(xì)胞、抗氧化低密度脂蛋白抗體和抗β2-GPI抗體的升高均無影響，但高脂飲食喂養(yǎng)的LDLr. Sle 小鼠的死亡率和狼瘡病情活動度較普通飲食小鼠明顯升高。VAN LEUVEN 等［27］進一步研究發(fā)現(xiàn)，盡管阿托伐他汀能明顯降低LDLr.Sle 小鼠的膽固醇水平，但其并不能改善LDLr.Sle 小鼠的動脈斑塊面積，反而是嗎替麥考酚酯能明顯降低LDLr.Sle 小鼠的動脈斑塊面積，抑制CD4+T 細(xì)胞活化和向動脈斑塊部位的浸潤。而在此時間點上，嗎替麥考酚酯對LDLr.Sle 小鼠的抗ds-DNA 抗體滴度和腎臟功能以及腎臟病理并無明顯改善，提示嗎替麥考酚酯對LDLr.Sle 小鼠AS 的改變并非是其改善腎臟病變的間接影響。以上結(jié)果也從另一側(cè)面為SLE 中觀察到的加速AS 與自身免疫相關(guān)提供了額外的證據(jù)。

GAUTIER 等［28］還使用 gld 小鼠的骨髓細(xì)胞移植到LDLr-/-小鼠體內(nèi)制造了另一種骨髓移植嵌合體模型gld→LDLr-/-。gld→LDLr-/-小鼠和wt→LDLr-/-小鼠在血漿脂質(zhì)、脂蛋白譜以及腎功能和蛋白尿方面均無明顯差異，但gld→LDLr-/-小鼠的AS 斑塊面積較wt→LDLr-/-小鼠明顯升高?？赡苁怯捎诶钳彶∏閷?dǎo)致了免疫系統(tǒng)的激活，從而在心血管系統(tǒng)中誘導(dǎo)了炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞活化以及凋亡碎片、巨噬細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞的聚集，從而加速了AS 病變進展。

4 高脂飲食喂養(yǎng)模型

研究表明，ApoE-/-小鼠體內(nèi)本身就可能存在異常的免疫反應(yīng)。ApoE-/-小鼠能夠通過提升抗原遞呈細(xì)胞表面協(xié)同刺激信號分子CD40 和CD80 的表達(dá)，增強T細(xì)胞免疫反應(yīng)［29］。WANG 等［30］發(fā)現(xiàn)ApoE-/-小鼠能夠通過下調(diào)TLR4 信號通路從而導(dǎo)致脾臟細(xì)胞凋亡減輕，促進ANA 和ds-DNA 抗體的產(chǎn)生。同時該團隊還發(fā)現(xiàn)ApoE-/-小鼠高脂飲食喂養(yǎng)4 個月后，出現(xiàn)血肌酐和尿蛋白的升高，能自發(fā)性地形成血清ANA 抗體和抗ds-DNA 抗體，同時出現(xiàn)脾腫大和增生性腎小球腎炎，IgG、C3 在腎小球沉積，這些疾病特征在雌性小鼠中表現(xiàn)為更明顯，與SLE 動物模型Fas-/-小鼠（MRL/lpr mice）極其相似。但不同于Fas-/-小鼠，只有在ApoE-/-小鼠的主動脈內(nèi)膜觀察到AS斑塊，動脈斑塊內(nèi)還可以檢測到IgG、C3的沉積和巨噬細(xì)胞的浸潤。以上表現(xiàn)提示ApoE-/-小鼠經(jīng)高脂飲食喂養(yǎng)后出現(xiàn)了自身免疫炎癥和臟器的損傷［31］。

劉麗等［32］試圖通過用狼瘡模型小鼠（MRL/lpr mice）高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)SLE 合并AS 模型，發(fā)現(xiàn)即使予以足夠時間的高脂飲食，該模型鼠仍不能表現(xiàn)出明顯的高脂血癥和AS病變。

除了以上提到的4 種造模方法，通過對ApoE-/-小鼠誘導(dǎo)慢性移植物抗宿主?。╟GVHD）（B6.GVH.ApoE-/-小鼠）也成為狼瘡合并AS 的造模方法之一［33］。cGVHD 會加劇 AS，同時出現(xiàn)抗 ds-DNA 抗體、抗chromatin 抗體、抗心磷脂抗體及抗氧化低密度脂蛋白抗體升高。但抗體水平?jīng)]有MRL/lpr.ApoE-/-小鼠（MRL/lpr 小鼠與ApoE-/-小鼠雜交鼠）升高明顯，目前該模型研究較少。

綜上所述，選擇合適的動物模型，并從系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)、自身抗體、細(xì)胞凋亡、補體耗竭、IFN-Ⅰ、趨化因子等方面進一步探討SLE 合并AS 的作用機制，可能為臨床防治SLE心血管事件帶來新的突破。